Summary
Bu çalışma manyetik nano tanecikleri hazırlanması için protokolleri açıklar, SiO ile kaplama2, ile amin fonksiyonelleştirme takip (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) ve bir bağlayıcı olarak bir süksinyl moiety kullanarak deferoksamin ile çekimi. Derin bir yapısal karakterizasyon açıklaması ve tüm ara nano tanecikleri ve son konjuge için Y. enterocolitica kullanılarak yakalanan bakteri tahlilleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Bu çalışmada, manyetik nano partiküllerin sentezi, SiO ile kaplama2, amin fonksiyonelleştirme ile takip (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) ve deferoksamin ile konjugasyonu, Yersinia enterocoliticatarafından tanınan bir siderofor , bir bağlayıcı olarak bir süksinil moiety kullanarak açıklanmıştır.
Manyetik nano tanecikler (MNP) manyetit (Fe3O4)solvotermal yöntemle hazırlanmış ve Stöber prosesi kullanılarak SiO2 (MNP@SiO2)ile kaplanmış ve ardından APTES ile işlevselleştirme (MNP@SiO2@NH2). Daha sonra, feroksamin MNP@SiO 22@NH2 karbodiimid kaplin ile MNP@SiO 2 @NH2@Fa vermek için konjuge edildi.2 Konjuge ve ara ların morfolojisi ve özellikleri toz X-Işını kırınımı (XRD), Fourier transform kızılötesi spektroskopisi (FT-IR), Raman spektroskopisi, X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS), iletim elektron mikroskobu (TEM) ve enerji dağıtıcı X-ışını (EDX) haritalama dahil olmak üzere sekiz farklı yöntemle incelendi. Bu ayrıntılı karakterizasyon eşlekap oluşumunu doğruladı. Son olarak, nano taneciklerin kapasitesini ve özgüllüğünü değerlendirmek için, yersinia enterocoliticakullanılarak bir yakalama bakteri testi nde test edildi.
Introduction
MNP kullanan bakteri algılama yöntemleri, patojenik bakteriler1tarafından MNP'ye konan antikorların, aptamerlerin, biyoproteinlerin, karbonhidratların moleküler olarak tanınmasına dayanmaktadır. Sideroforların bakterilerin dış zarındaki spesifik reseptörler tarafından tanındığı göz önünde bulundurularak, özgüllüklerini artırmak için MNP'ye de bağlanabilen2. Sideroforlar bakteriler in Fe3+ alımında yer alan küçük organik moleküllerdir3,4. Bakterilerin yakalanması ve izolasyonu için değerlendirmelerinin yanı sıra sideroforlar ve MNP arasında konjuge lerin hazırlanması henüz rapor edilmemiştir.
Küçük moleküller ile manyetik nano taneciklerin konjuge sentezinde önemli adımlardan biri küçük molekül MNP yüzeyine bağlı olduğundan emin olmak için aralarında bağ veya etkileşim türü seçimidir. Bu nedenle, manyetik nano tanecikleri ve feroksamin arasında konjuge hazırlamak için prosedür-Yersinia enterocoliticatarafından tanınan siderofor- karbodiimid kimya sıyrık tarafından siderofor kovalent bağlantı sağlamak için MNP değiştirilebilir bir yüzey üretimi ne odaklanmıştır. Düzgün bir manyetit nano tanecikleri almak için (MNP) ve çekirdekleşme ve boyut kontrolünü geliştirmek için, benzil alkol ile bir solvolysisreaksiyonusallayarak olmadan bir termal blok yapıldı 5 . Daha sonra, bir silika kaplama koruma vermek ve sulu ortamda nano tanecikleri süspansiyon istikrarını artırmak için Stöber yöntemi tarafından oluşturuldu6. Ferokramin yapısı dikkate alınarak, amin gruplarının giriş uygun nano tanecikleri üretmek için gereklidir (MNP@SiO2@NH2) siderofor ile konjuge olmak. Bu (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) silika modifiye nano tanecikleri yüzeyinde mevcut alkol grupları ile yoğuşma ile elde edildi (MNP@SiO2) bir sol-jel yöntemi kullanılarak7.
Buna paralel olarak, feroksamin demir (III) kompleksi sulu çözeltide demir asetil asetat ile ticari olarak kullanılabilir deferoksanin karmaşıklığı ile hazırlanmıştır. N-succinylferoxamine, bağlayıcı olarak hareket edecek süksinil grupları taşıyan, süksinik anhidrit ile feroksanin reaksiyonu ile elde edildi.
MNP@SiO 2 @NH22 ve N-succinylferoxamine arasında konjugasyon MNP@SiO vermek için2@NH@Fa kaplin reaktifler benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethyl olarak kullanılarak karbodiimid kimya ile yapılmıştır Amino)-fosfonyum hekzaflorofoffat (BOP) ve 1-hidroksibenzotriazol (HOBt) yumuşak bir temel ortamda N-succinylferoksamin8terminal asit grubunu etkinleştirmek için .
MNP'ler karakterize edildikten sonra, yabani tip (WC-A) ve feroksamin reseptörü FoxA'dan yoksun Y. enterokolitica mutantını yakalamak için çıplak ve işlevsel leştirilmiş manyetik nano partiküllerin yeteneklerini değerlendirdik (FoxA WC-A 12-8). Düz Milletvekilleri, işlevsel milletvekilleri ve eşlenik MNP@SiO2@NH@Fa her Y. enterocolitica zorlanma ile etkileşime izin verildi. Bakteri-eşlekapakları manyetik alan uygulaması ile bakteri süspansiyonundan ayrılmıştır. Ayrılmış agregalar iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulandı, seri seyreltmehazırlamak için PBS'de yeniden askıya alındı ve daha sonra koloni sayımı için kaplandı. Bu protokol, MNP@SiO2@NH@Fa sentezinin her adımını, tüm ara maddelerin yapısal karakterizasyonunu ve eşlekap'ı ve bir bakteri yakalama testini ara maddelerle ilgili olarak eşleninin özgüllüğünü değerlendirmenin kolay bir yolu olarak gösterir. 9.000
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Hareketsiz atmosfer koşullarında yapılan reaksiyonlar için tüm cam eşyalar daha önce 65 °C'de bir fırında kurutulmuş, kauçuk septumla kapatılmış ve üç kez argon ile temizlenmiş.
1. Feroksanin ile konjuge manyetik nano taneciklerin sentezi
- Fe3O4 manyetik nano partiküllerin (MNP) sentezi
- 20 mL cam şişeye 0,5 g Fe(acac)3 ekleyin ve 10 mL benzyl alkolü ile karıştırın.
- Bu karışımı 2 dakika sonicate, sonra bir ısıtma bloğu ve ısı 180 °C 72 saat aktarın.
- Reaksiyon tamamlandıktan sonra, şişelerin soğumasını bekleyin, nano tanecikleri %96 etanol ve santrifüj ile 30 dk boyunca 4000 x g'da durulayın.
- Nano tanecikleri neodimyum (NdFeB) mıknatısı kullanarak manyetik çekim ile süpernatanttan ayırın ve artık çözücüatın atın.
- % 96 etanol tekrar adım 1.1.4 ile durulayın. ve çözücü net görünene kadar 40 kHz 1 dakika boyunca bir banyoda sonication ile alternatif supernatant atın.
- Manyetik nanopartiküller SiO2 kaplama (MNP@SiO2)
- İzopropanol 80 mL'de 2 g MNP süspansiyon hazırlayın ve ardından manyetik bir karıştırma çubuğuna yuvarlak bir alt şişeye %21 amonyağ, 7,5 mL distile su ve 0,56 mL tetraetil ortosilikat (TEOS) (bu sırada) ekleyin.
- Karışımı 40 °C'de sürekli karıştırarak 2 saat ısıtın ve ardından 1 saat sonicate yapın.
- MNP'yi bir mıknatısla ayırın, süpernatant'ı atın ve 30 mL izopropanol'de dağıtın.
- Adımları 1.2.1'i yineleyin. ve 1.2.2.
- Tüm malzemeyi kurtarmak için manyetik karıştırma çubuğunu %96 etanol ile çıkarın ve yıkayın.
- Bir mıknatıs kullanarak manyetik çekim ile süpernatant nano tanecikleri ayırın.
- Supernatant atın ve sonication ile dönüşümlü üç kez% 96 etanol ile nano tanecikleri durulayın.
- Oda sıcaklığında vakum altında nano tanecikleri 12 saat kurulayın.
- (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) ile MNP@SiO2 fonksiyonelizasyonu
- Durulayın 500 MNP@SiO mg2 Bir önceki adımdan elde edilen N,N-dimethylformmide (DMF) inert atmosfer altında ve sonra 40 kHz 1 dakika sonicate. Sonra, supernatant atın ve bu işlemi üç kez tekrarlayın.
- Manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırma altında yuvarlak bir alt şişedeki parçacıkları yeniden askıya alın ve 9 mL APTES ekleyin.
- Karışımı 60 °C'de 12 saat karıştırın.
- Supernatant atın ve sonication ile dönüşümlü üç kez% 96 etanol ile nano tanecikleri durulayın.
- Ferokramin sentezi
- 100 mg (0.15 mmol) deferoksamin mesylat tuzu ve 53.0 mg (0.15 mmol) Fe(acac)3 5 mL distile su çözün ve oda sıcaklığında bir gecede karışımı karıştırın.
- Elde edilen ürünü 20 mL EtOAc ile üç kez bir ayırma hunisi içinde yıkayın ve ardından organik çözücüü döner buharlaştırıcı kullanarak vakum un altından çıkarın.
- Kırmızı katı olarak feroksanin göze sulu faz dondurun-kuru.
- N-succinylferoksamin sentezi
- Etkisiz atmosfer altında 50 mL yuvarlak dipli şişede 5 mL piridine 5 mL feroksamin 100 mg (0.17 mmol) çözeltisine 350 mg (3.50 mmol) succinik anhidrit ekleyin.
- 16 saat oda sıcaklığında ortaya çıkan karışımı karıştırın. Bu süre sonra, koyu kırmızı katı vermek için bir rotatory evaporatör azaltılmış basınç altında piridin fazlalığı kaldırın.
- Reaksiyonu 3 mL metanolde çözün.
- Metanolik çözeltiyi sephadex kolona (20 mm çapında bir kolonda 20 cm Sephadex) aktarın ve 0,5 mL/dk'da ezik olun.
- Kırmızı fraksiyonu toplamak ve bir döner buharlaştırıcı kullanarak vakum altında metanol kaldırın.
- Konjuge MNP@SiO2@NH@Fa sentezi
- 30 mg kuru MNP@SiO2@NHDMF ile iki kez durulayın ve 100 mL Erlenmeyer şişesinde nano partikülleri inert atmosferin 30 dakika boyunca sonicate.
- N-succinylferoksamin (200 mg, 0.30 mmol), benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfonyum hekaksiyum hekaksiorofosfat (BOP, 173 mg, 0.45 mmol), 1-hidroksibenzotriazol (HOBt, 46 mg, 0.39 mmol) ve N,N-diisopropiletiletin (DIPEA, 128.8 mg, 1.21 mmol) 10 mL DMF (Mix A) bir 50 mL yuvarlak dipli flask inert atmosferde.
- Daha önce durulanan MNP@SiO2@NH2 DMF 3 mL bir argon gaz atmosferi (Mix B) kullanarak oksijensiz koşullar altında kuru sonication altında askıya alın.
- B dropwise karıştırmak için karışımı A ekleyin.
- Gece oda sıcaklığında bir orbital shaker kullanarak son karışımı çalkalayın.
- Ortaya çıkan eşlekapayı(MNP@SiO 2@NH@Fa) mıknatıs kullanarak süspansiyondan ayırın.
- Ortaya çıkan katı yıkın ve sonra, etanol 10 mL ile beş kez sonicate.
- Vakum altında katı kuru 24 saat.
2. Nano tanecikli patojenik bakterilerin yakalanmasını ölçmek için Y. enterocolitica suşları ile bakteriyel analiz
- Tüm ara nano partiküllerin süspansiyonuna ve PBS'de steril 2 mL tüplerde 1 mg/mL'de son eşleksiyonu hazırlayın.
- Luria Bertani (LB) suyu 5 mL y. enterokolitica bir kültür hazırlamak gecede 37 °C'de kuluçka.
- 10 mM 2,2′-bipyridyl 50 μL ekleyerek demir eksikliği triptik soya suyu (TSB) 5 mL hazırlayın.
- Y. enterocolitica'nın geceleme kültürünün 50 μL'si ile 5 mL'lik demir eksikliğini aşılayın ve 37 °C'de OD600 = 0.5\u20120.8'e ulaşıncaya kadar ajitasyonla kuluçkaya yürün.
- İlk 1/10 seyreltme elde etmek için adım 2.4'te elde edilen kültürün 100 μL'sini alın ve 900 μL PBS içeren 2,0 mL'lik bir tüpte seyreltin. Daha sonra, 1 x 106 Koloni Şekillendirme Birimleri (CFU)/mL yaklaşık olarak bakteri hücrelerinin konsantrasyonu elde etmek için aynı prosedürü kullanarak ilk seyreltme 1/100 seyreltme hazırlamak.
- 1 mg/mL ile 1 mL arasında 100 μL nano partikül süspansiyon ekleyin 2.0 mL'lik bir tüpte bakteriyel süspansiyonun 1/100 seyreltilmesi ve girdap ile homojenleştirin.
- Kültürü 20 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Bir mıknatıs kullanarak MNP/bakteri agregalarını ayırın ve süpernatant'ı dikkatlice atın.
- Ayrılmış nano tanecikleri girdap kullanarak 1 mL PBS ile iki kez durula.
- CFU/mL'deki bakteri yakalama miktarını saymak için 1 mL PBS'deki nano partikülleri askıya alın.
- 1 x 10-4 seyreltme ulaşılına kadar eski süspansiyondört ardışık 1/10 seyreltme hazırlayın.
- Her seyreltmenin 10 μL plakası TS agar plakalarına ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Epi beyaz modda bir jel dijitalleştirici ile plaka fotoğraf. Tek tek kolonilerin sayısını saymak için bir noktayı yükseltmek için görüntüyü uygun bir yazılımla işleyin.
NOT: Her MNP ara sentezin ilerlemesini takip etmek için karakterize edildi. İlk olarak, çıplak milletvekilleri xrd tarafından kristal yapısını kontrol etmek için incelenmiştir. Daha sonra, her ara orta seviyenin FT-IR spektrumu, ilgili reaksiyonda meydana gelen değişiklikleri denetlemek üzere çalıştırıldı. FT-IR spektrumlarından elde edilen sonuçları doğrulamak için her bir ara nın Raman spektroskopisi analizi de yapılmıştır. TGA analizi, yapısında organik madde taşıyan ara maddelerin kayıp ağırlığını tahmin etmemizi sağladı. Her bir ara bilimin morfolojisi ve büyüklüğü TEM tarafından incelenmiştir. Son olarak, XPS analizi her MNP ara yüzeyindeki atom oksidasyon durumlarını belirlemek ve konjugeMNP@SiO 2@NH@Fa kovalent bağ oluşumunu doğrulamak için kritik öneme yönelikti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her ara ve son eşleninin morfolojisini ve özelliklerini belirlemek için kapsamlı bir yapısal karakterizasyon gerçekleştirilir. Bu amaçla konjugatın oluşumunu göstermek için XRD, FT-IR, Raman spektroskopisi, TGA, TEM, EDX haritalama ve XPS teknikleri kullanılmaktadır. X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) ile elde edilen nano partiküllerin yüzeyindeki atomların oksidasyon durumları, nanopartikül ile siderofor arasında kovalent bağların oluşumunu doğrulayan en uygun verilerdir. Bu sonuçlarla aynı fikirde, bu protokol tekrarlanabilir.
Çıplak MNP, fonksiyonel milletvekilleri ve konjuge PBS çözeltisi her Y. enterokolitica zorlanma ile karıştırılır. Bakteri-MNPs agregaları bir mıknatıs kullanılarak süspansiyon ayrılır. Agregaları PBS ile iki kez duruladıktan sonra, koloni sayımı için kaplanmış seri seyreltmeler hazırlamak için PBS'de yeniden askıya alınırlar.
Bu protokol kullanılarak hazırlanan ara lar ve son eşlekap, sentezin her adımında gerçekleşen değişiklikleri görüntülemek için çeşitli tekniklere sunulmuştur. Kızılötesi ve Raman spektroskopisi sentezin her adımını izlemek için kolay ve hızlı bir yol oluşturmaktadır. Si-O, C-Si-C, Fe-O, O=C amid titreşimi, FT-IR ve Raman (aşağıya bakınız) spektrumlarında Bulunan Karakteristik bantların varlığı, sentezin her adımında manyetik nano partiküllerin yüzeyinde meydana gelen kimyasal değişikliklerin ilk göstergeleridir.
XRD difraktogramı
Şekil 1, manyetitin sentetik manyetik nano partiküllerinin (MNP) bileşimini ve kristal yapısını doğrulamak için kullanılan XRD analizini JCPDS dosyası 00-003-0863 ile karşılaştırarak göstermektedir.
TEM analizi
Şekil 2C, sırasıyla 4,9, 2,9, 2,4, 2.0, 1.7, 1.6 ve 1.4'lük d-aralıklara karşılık gelen manyetit in (111), (220), (311), (400), (422), (511) ve (440) kırınım düzlemleriyle eşleşen elektron kırınım deseninin parlak noktalarını görüntüler. Öte yandan Şekil 2D ve Şekil 4E, amorf inorganik-organik maddeye gömülü dağınık MNP partiküllerine (~10 nm) karşılık gelen MNP@SiO2@NH2@Fa TEM görüntülerini göstermektedir. Kaplama kalınlığı ~10 nm'nin üzerindedir.
EDX analizi
EDX haritaları yüzeydeki Fe, O, Si ve C elemanlarının dağılımını görüntüler. Şekil 3A açıkça MNP@SiO2yüzeyinde Si varlığını gösterir. Amin işlevselleştirme ve feroktamin ile konjugasyon sonra, MNP@SiO2@NH@Fa için nano tanecikleri yüzeyinde C artış başarılı bir konjugasyon kanıtı olarak Şekil 3B gösterilir.
IR analizi
Çıplak MNP FTIR spektrumları,MNP@SiO 2, MNP@SiO2@NH2 ve MNP@SiO2@NH@Fa Şekil 4'tegösterilmiştir. Tüm FTIR spektrumları, fe-o titreşimleri ile ilgili 600 cm-1'de analizin spektral aralığında bir bandın başlangıcını gösterir. 1050 cm-1geniş bir bant varlığı -1 -Si-O-Si germe titreşim atfedilen-MNP@SiO2FTIR spektrumları 2 MNP@SiO2@NH2 ve MNP@SiO2@NH@Fa silika kaplama doğruladı.
MNP@SiO2'nin FTIR spektrumu(Şekil 4)830 ile 1275 cm-1 (Si-O bağı) arasında geniş bir bant görüntüler; muhtemelen Si-C bağı nedeniyle (1175 ile 1250 cm-1arasında beklenmektedir) MNP@SiO2@NH2FTIR spektrumunda APTES ile işlevselleştirilmesinden sonra daha yoğun hale gelir. Son olarak, 2995 cm-1 (C-H germe bağları), 1640 cm-1 (O=C-NH amide II titreşim) ve 1577 cm-1 (O=C-N hidroksamik asit titreşimi) MNP@SiO FTIR spektrumunda gözlenen bantlar2@NH@Fa nano tanecikleri ile feroksamin konjugasyon doğruladı10.
Termogravimetri analizi
Thermogravimetry verileri Şekil 5'tegösterilmiştir , bu da organik madde ve su ilavesi nedeniyle kilo kaybını gösterir.
Raman analizi
Çıplak MNP'nin silika kaplaması ve işlevselleştirilmesi de Raman analizi ile doğrulandı veher birara ve MNP@SiO 2 @NH@Fa(Şekil 6). Tüm Raman spektrumları 305.8, 537.2 ve 665.6 cm-1'dezirveleri gösterir , Fe-O titreşimlerine karşılık gelen(Şekil 6A)11, ve 713.5 cm-1'dezirvede bir omuz , Si-O-Si titreşimleri ile ilgili (Şekil 6B)12. APTES işlevselleştirilmesinden sonra, raman spektrumu MNP@SiO2@NH2 1001.5 ve 1027.4 cm-1yoğun zirveleri görüntüler , SiO2varlığı karşılık gelen , ve 1578.6 ve 1597.9 cm-1, Si-C bağları oluşumunu doğrulayan. Ayrıca, 703.0 cm-1 de tepenin bir omuz varlığı da APTES varlığını doğruladı (Şekil 6C)13,14. Son olarak, 1490 ve 1700 cm-1 (~ 1581 cm-1merkezli) arasındaki geniş tepe, Si-C tahvilleri ve MNP@SiO2@NH@Fa Raman spektrumundaki amid gruplarına karşılık gelen, konjuge oluşumu ile uyum içindedir (Şekil 6D)14.
XPS analizi
Yüzeydeki atomların oksidasyon durumu XPS analizi ile yapılmıştır ve yapılardaki bağ oluşumu nu doğrulamıştır. Şekil 7, çıplak ve farklı işlevselleştirilmiş milletvekillerinin XPS spektrumlarını gösterir. MNP için, C1'lerde dar bir tepe sentez sırasında numunenin işlenmesindeki kirlerden kaynaklanıyor olabilir. Karbon girişi 2@NH 2MNP@SiO C-C ve C-H bağları olarak,MNP@SiO 2@NH@Fa spektrumolarak gözlenir. N1s spektrumlarında 399 eV'deki zirvenin analizi veMNP@SiO 2@NH@Fa boyunca gözlenen zayıflama,2@NH MNP@SiO ile feroksamin arasında amid bağlarının oluşumunu doğrulamaktadır. Ayrıca, hidroksamik moieties N-O bağ varlığı 402 eV bir zirve varlığı ile kabul edilebiste. Tüm ara ve konjuge Si2p dar spektrumlarda 102 eV bir tepe varlığı siloksane grubu15,16için bağlayıcı enerji ile uyum içindedir.
Z Potansiyeli
Z potansiyel değerleri Tablo 1'degörüntülenir. Sonuçlar negatif, -25.21 ve -29.35 mV, MNP ve MNP@SiO2için , sırasıyla. 2@NH MNP@SiOvermek için APTES ile işlevselleştirme yüzey yükünü negatiften pozitife çevirdi. Bu gerçek amin gruplarına atfedildi ve yüzey yüküMNP@SiO 2@NH@Fa pozitif kalır. Pozitif yüzey Z potansiyeli bakteriler arasındaki etkileşimi açıklayabilir (yüzeyi negatif) ve eşlekap17,18,19.
Bakteri yakalama tsay
40\u201260 kolonilerinin ayrıldığı ve kolayca görselleştirildiği seyreltmelerde MNP ara ve MNP@SiO2@NH@Fa yakalanan Y. enterocolitica WC-A ve FoxA WC-A 12-8 hücrelerinin sayısı ölçüldü. Yakalanan hücrelerin çıplak, MNP@SiO2ve22@NH MNP@SiO 2'ye göre yakalanan hücrelerin sayısı anlamlı bir farklılık göstermez(Şekil 8). MNP@SiO2@NH2'deki serbest amin gruplarına bağlı elektrostatik kuvvetler ve bakterilerdeki feroktamin membran reseptörünün düşük konsantrasyonu beklenen bağlayıcı özgüllük eksikliğini haklı çıkarabilir.
Bu protokol, özellikle karbodiimid kimyası kullanan konjugalerin farklı tipte sentezinde uygulanabilir. Daha iyi sonuçlar elde etmek için modifikasyonlar sunmak için yeterince çok yönlüdür. Açıklanan teknikleri kullanarak tüm ara ve son eşledik tam karakterizasyonu, bir sentezin her adımını takip etmek ve arzu bağıoluşumunu onaylamak için izin verir. 10 μL damla kullanarak bakteri yakalama tahlil kolonilerinin sayılması, bir çoğaltma almak ve farklı koşullar altında tahlil yapmak kolaylaştırır bir plaka içinde aynı anda tüm örnekleri test etmek için izin verir.
Şekil 1: MNP (Fe3O4)(mor) ve manyetit deseni (siyah) diffraktogramların karşılaştırılması.
Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Parlak alan TEM ve çıplak MNP (A, B ve C) ve MNP@SiO2@NH@Fa (D, E ve F) elektron kırınım görüntüleri.
Görüntüler orta ve yüksek çözünürlüklerdedir. Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MNP@SiO2EDX haritaları : HAADF görüntüsü ve A. MNP@SiO2 ve B. MNP@SiO2@NH@Fa ilgili Fe, Si, O ve C haritaları.
Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ft-IR spektrumları çıplak demir oksit (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 ve MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: MNP termogravimetrik analizi, MNP@SiO2@NH2, ve MNP@SiO2@NH@Fa.
Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Raman spektrumları çıplak demir oksit (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) ve MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Diğer demir oksit fazları, muhtemelen lazer gücü ile manyetit dönüşümü oluşur. Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: XpS dar spektrumları MNP, MNP@SiO2@NH2 ve MNP@SiO2@NH@Fa. Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Manyetik nano partiküllerin 100 g başına yakalanan Y. enterokolitica CFU: çıplak, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 ve MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (yabani tip) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutant feroktamin reseptörü FoxA eksik) ve SEM görüntü MNP@SiO2@NH@Fa Y. enterokoliticaile etkileşim . Bu rakam Martínez-Matamoros ve ark.9değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | Z Potansiyeli |
| Mnp | -25.21 |
| MNP@SiO2 | -29.35 |
| MNP@SiO2@NH2 | 17.03 |
| MNP@SiO2@NH@Fa | 22.14 |
| MNP@SiO2@NHBoc@Fa | 19.16 |
| MNP@SiO2@NHCOOH@Fa | 10.96 |
Tablo 1: Z potansiyel ölçümleri. Bu tablo Martínez-Matamoros ve ark.9elde edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, kovalent bağ ile manyetik nano tanecikleri ve siderofor feroktamin arasında bir konjuge sentezini açıklar. Manyetit sentezi pinna ve ark.5 tarafından bildirilen protokol kullanılarak yapıldı ve sulu sistemlerde korozyon manyetik çekirdek korumak için silika kaplama takip, toplama en aza indirmek ve fonksiyonelleştirme için uygun bir yüzey sağlamak için6. Silika kaplama işlemi değiştirildi. Li ve ark.6tarafından bildirilen üç kaplama yerine, MNP'ler bu yöntemde iki silika tabakası ile kaplandılar(Şekil 2D)APTES7ile işlevselleştirme adımı ile devam etmek için yeterliydi.
Deferoksamin demir ile karmaşık (III) çünkü oda sıcaklığında birkaç saat içinde bozulmaya duyarlıdır. Demir kompleksini elde etmenin en iyi yolu demir asetil asetonat kullanmaktır çünkü sıvı-sıvı ekstraksiyonu ile saflaştırılması çok basittir ve feroksanin kantitatif verim elde edilir. Feroksamin kararlı ve bir bağlayıcı olarak terminal asidik grup eklemek için süksinik anhidrit kullanarak N-succinylferoxamine vermek için değiştirilebilir. Boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırma n-succinylferoxamin aşırı süksinik anhidrit ve süksinik asit kaldırılmasını sağlar.
Amin nanokompozit yüzeyde kovalent N-succinylferoxamine bağlamak için kullanılmıştır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) demir oksit paramanyetik davranışı nedeniyle ürünlerin yapısal açıklaması için kullanılamaz. Bu nedenle her reaksiyon adımı FT-IR tarafından izlendi ve Raman spektroskopisi ile doğrulandı. Raman spektrumunun 300 s.'lik toplam ölçüm süresi ile 300 s'lik on ölçüleri içeren uygun bir yazılımla yapılan zirveler, morfoloji ve boyut, 10 nm homojen boyut dağılımı ile takma adeforik şekil leri gözlemleyerek TEM tarafından ölçüldü(Şekil 2A,B) Eşlenik kaplama kalınlığı ölçüsü 10 nm homojen bir tabaka gösterir(Şekil 2D,E).
Manyetik karakteri ve aglomera yatkınlığı nedeniyle nano partiküllerin ayrı ayrı gözlemlenebildiği bir TEM alanı elde etmek çok zordur. EDX haritalama yüzeydeki her bir elementin bileşimi hakkında bilgi elde etmek için kullanılmıştır(Şekil 3A). Karbon yoğunluğu açıkça eşlenikMNP@SiO2 @NH@Fa (Şekil 3B) orta MNP@SiO2göre artırıldı .
Bakteri yakalama testi ferokramin dış membran protein reseptörü ile bakterileri yakalamak için konjuge yeteneğini test etmek için tasarlanmıştır. Yersinia enterocolitica WC-A suş FoxA feroktamin reseptörü ifade çünkü seçildi ve büyümek kolaydır. Bu işlemdeki kritik adım, yakalanmayan bakterilerin uzaklaştırılmasıydı. Bu steril PBS ile durulama ve girdap iki kez bir mıknatıs kullanarak bakteri-conjugate agregakurtarma ile elde edildi. Kontrol olarak kullanılan MNP ara ve konjuge MNP@SiO2@NH@Fa her biri tarafından yakalanan hücrelerin sayısı seyreltme yönteminden koloni sayımı ile belirlendi. 10 μL damla kullanmak deneysel prosedürü kolaylaştırır ve plak sayma kolonilerinin klasik yöntemine kıyasla zaman ve malzeme açısından test maliyetini azaltan dörtten fazla numunenin işlemesini sağlar.
MNP@SiO2@NH@Fa eşlenik sentezinin en önemli sınırlaması, bağ oluşumunu NMR ile doğrulamanın mümkün olmamasıdır. MNP@SiO2@NH@Fa hazırlanması basit gibi görünse de, kovalent bir bağ aracılığıyla siderofor ve MNP arasındaki bağı doğrulamak için yapısal karakterizasyon tekniklerinin kullanımı çok önemlidir.
Bu protokolü izleyerek, karbodiimid kimyası kullanılarak konjugatlar oluşturmak mümkündür. Bunu başarmak için, mnps yüzeyinde amino grupların varlığı ve ilgi bileşik bir karboksilik asit işlevselliği gereklidir. Farklı bağlayıcıların test edilmesi ve milletvekillerinin yüzeyinin diğer fonksiyonel gruplarla kaplayarak üzerinde pozitif ücretler oluşmasını önlemek bakteriyel yakalama ayrımcılığını artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak bir şeyimiz yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Profesör Klaus Hantke'nin (Tübingen Üniversitesi, Almanya) bu çalışmada kullanılan Yersinia enterocolitica suşlarını nazilikle tedarik etmek için minnettarlıkla kabul ediyorlar. Bu çalışma, Avrupa Birliği'nden FEDER Programı tarafından ortaklaşa finanse edilen İspanya Araştırma Devlet Ajansı'ndan (AEI/FEDER, AB) AGL2015-63740-C2-1/2-R ve RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, AB) hibeleri ile desteklenmiştir. Santiago de Compostela Üniversitesi ve A Coruña Üniversitesi'ndeki çalışmalar da Xunta de Galiçya'dan GRC2018/018, GRC2018/039 ve ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC stratejik grubu) hibeleri ile desteklenmiştir. Son olarak, nuria Calvo'ya bu video protokolünü seslendirme deki büyük işbirliği için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
