Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

סינתזה של חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הקוניוגציה שלהם עם הסידרפפור פראאוקמין והערכתה לאיתור חיידקים

doi: 10.3791/60842 Published: June 16, 2020

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקולים להכנת חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הציפוי שלה עם SiO2, ואחריו פונקציונליזציה האמין שלה עם (3-aminopropyl) triethoxysilane (aptes) ואת הקוניוגציה שלה עם דפרוקסמין באמצעות moiety מקשר. תיאור מבני עמוק באפיון וחיידק לכידת שיטת Y. enterocolitica עבור כל חלקיקי ביניים המשלים הסופי מתוארים גם בפרוטרוט.

Abstract

בעבודה הנוכחית, סינתזה של חלקיקים מגנטיים, הציפוי שלה עם SiO2, ואחריו הפונקציונליזציה של האמין שלה עם (3-aminopropyl) triethoxysilane (aptes) ואת הקונאוציה שלה עם deferoxamine, siderophore המזוהה על ידי yersinia enterocolitica, באמצעות moiety סוקסיל כמקשר מ

חלקיקים מגנטיים (MNP) של מגנטיט (Fe3O4) הוכנו על ידי שיטת solvothermal מצופה עם SiO2 (MNP@SiO2) באמצעות תהליך STÖBER ואחריו פונקציונליזציה עם aptes (MNP@SiO2@NH2). לאחר מכן, פראוקאמין היה מצועם עם MNP@SiO2@NH2 על ידי צימוד קרבודיאימיד לתת MNP@SiO2@NH2@Fa. המבנה והמאפיינים של המשלים והintermediates נבדקו על-ידי שמונה שיטות שונות, כולל עקיפה לקרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיית פורייה (FT-IR), ספקטרוסקופיית, מיקרוסקופית רנטגן, ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון (XPS), מיקרוסקופ אלקטרוני של שידור (TEM) ואנרגיה מפזרים מיפוי רנטגן. אפיון ממצה זה אישר את היווצרות המשלים. לבסוף, על מנת להעריך את היכולת ואת הספציפיות של חלקיקי חלקיקים, הם נבדקו בחיידק לכידת שיטת הלכידה באמצעות Yersinia בידור.

Introduction

שיטות גילוי חיידקים באמצעות MNP מבוססים על הכרה מולקולרית של נוגדנים, aptamers, ביופרוטאין, פחמימות מצופני MNP על ידי חיידקים פתוגניים1. נטילת בחשבון כי siderophores מזוהים על ידי קולטנים ספציפיים על הקרום החיצוני של חיידקים, הם יכולים גם לקשר MNP כדי להגדיל את הספציפיות שלהם2. Siderophores הם מולקולות אורגניות קטנות מעורב Fe3 + ספיגה על ידי חיידקים3,4. הכנת שערי מעלה בין siderophores ו MNP יחד עם ההערכה שלהם ללכוד ובידוד של חיידקים עדיין לא דיווחו.

אחד השלבים הקריטיים בסינתזה של שערי מעלה של חלקיקים מגנטיים עם מולקולות קטנות היא הבחירה של סוג של קשר או אינטראקציה ביניהם כדי להבטיח כי המולקולה הקטנה מחוברת למשטח של MNP. מסיבה זו, ההליך להכין את המשלים בין חלקיקים מגנטיים ופראוקמין-הסידרפור המזוהה על ידי Yersinia בידור-היה ממוקד בדור של משטח מאפשר של mnp כדי לאפשר קישור זה מתוך הסידרפור על ידי כימיה קרבודיאימיד. על מנת לקבל חלקיקים מגנטיט אחיד (MNP) ולשפר את הנוקלאוציה ובקרת גודל, תגובה solvolysis עם אלכוהול בנזיל נישא בלוק תרמי מבלי לרעוד5. לאחר מכן, ציפוי סיליקה נוצר על ידי שיטת Stöber כדי להעניק הגנה ולשפר את היציבות של השעיית חלקיקים במדיה מימית6. נטילת בחשבון את המבנה של feroxamine, המבוא של קבוצות אמין הוא הכרחי כדי לייצר חלקיקים מתאימים (MNP@SiO2@NH2) כדי להיות מצופף עם siderophore. זה הושג על ידי עיבוי (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) עם קבוצות אלכוהול להציג על פני השטח של חלקיקי סיליקה שונה (MNP@SiO2) באמצעות שיטת sol-ג'ל7.

במקביל, הקומפלקס feroxamine ברזל (III) הוכנו על ידי הcomplexation של מסחרית דפרוקסמין עם ברזל מרחלי באמצעות מימית הפתרון. N-סוסוסוקסימין, הנושאת קבוצות סוקסיניות שיפעלו כלינטים, הושגה על ידי תגובת פראוקמין עם אנהידריד סוקסילי.

הקוניוגציה בין MNP@SiO2@NH2 ו- N-סוקסיאמין לתת MNP@SiO2@NH-Fa בוצעה באמצעות כימיה קרבודיאימיד באמצעות הצימוד ריאגנטים benzotriazole-1-yl-אוקסי-טריס-(dimethylamino)-פוספוניום hexafluorophosphate (בופ) ו-1-hydroxybenzotriazole (הובט) במדיה בסיסית רכה כדי להפעיל את הקבוצה חומצה מסוף ב N-סולילפראמין8.

לאחר MNPs היו מאופיינים, הערכנו את היכולות של חלקיקים מגנטיים חשופים ופונקציונליזציה כדי ללכוד פראי סוג (WC-A) ומוטציה של Y. enterocolitica חסר קולטן פראוקאמין FoxA (FOXA WC-A 12-8). מאוד מסוג MNPs, הפונקציונליות של MNPs והמשלים MNP@SiO2@NH@הפא הורשו לקיים אינטראקציה עם זן Y. enterocolitica . החיידקים המשלים האגרגטים הופרדו החיידקים ההשעיה על ידי יישום של שדה מגנטי. האגרגטים המופרדים שטפו פעמיים בתמיסת מלח (PBS), מושעה מחדש ב-PBS כדי להכין מדלל סדרתי ולאחר מכן הם היו מצופים לספירת המושבה. פרוטוקול זה ממחיש כל שלב של הסינתזה של MNP@SiO2@NH @Fa, האפיון המבני של כל הintermediates והמשלים, ושיטת לכידת החיידק כדרך קלה להעריך את הספציפיות של המשלים ביחס לintermediates. מיכל בן 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: לתגובות שבוצעו תחת תנאי אטמוספירה אינרטי, כל כלי הזכוכית התייבשו בעבר בתנור ב-65 ° c, אטום במחיצת גומי ומטוהר בארגון שלוש פעמים.

1. סינתזה של חלקיקים מגנטיים מצועם עם פראוקמין

  1. סינתזה של Fe3O4 חלקיקים מגנטיים (mnps)
    1. הוסף 0.5 g של Fe (acac)3 בבקבוקון זכוכית 20 מ ל ולאחר מכן לערבב עם 10 מ ל של אלכוהול בנזיל.
    2. Sonicate תערובת זו עבור 2 דקות, ואז להעביר בלוק חימום חום ב 180 ° c עבור 72 h.
    3. לאחר התגובה הושלמה, לאפשר את הבקבוקונים להתקרר, לשטוף את חלקיקי חלקיקים עם 96% אתנול ו צנטריפוגה ב 4000 x g עבור 30 דקות. לחזור על צנטריפוגה לפחות פעמיים.
    4. הפרד חלקיקים מן supernatant על ידי אטרקציה מגנטית באמצעות המגנט ניאודימיום (NdFeB) ולהיפטר שיורית ממיס.
    5. לשטוף עם 96% האתנול צעד חוזר שלב 1.1.4. ולהיפטר supernatant לסירוגין עם sonication באמבטיה עבור 1 דקות ב 40 kHz עד הממס נראה ברור.
  2. מגנטית חלקיקים SiO2 ציפוי (MNP@SiO2)
    1. הכינו השעיה של 2 גרם MNP ב 80 mL של איזופנול ולאחר מכן להוסיף 4 מ ל של 21% אמוניה, 7.5 מ ל של מים מזוקקים ו 0.56 mL של הטטראתיל אורתוסטיסיליקט (TEOS) (בסדר זה) בבקבוקון התחתון עגול עם בר מגנטי המהומה.
    2. לחמם את התערובת ב 40 ° c עבור 2 h עם ערבוב רציפה ולאחר מכן sonicate עבור 1 h.
    3. הפרד את ה-MNP עם מגנט, מחק את הסופרנטנט ופזר אותו ב -30 מ ל של איזופנול.
    4. חזור על שלבים 1.2.1. ו1.2.2.
    5. להסיר ולשטוף את בר המהומה המגנטי עם 96% אתנול כדי לשחזר את כל החומר.
    6. להפריד את חלקיקי חלקיקים מן supernatant על ידי אטרקציה מגנטית באמצעות מגנט.
    7. להיפטר supernatant ולשטוף את חלקיקי חלקיקים עם 96% אתנול שלוש פעמים לסירוגין עם sonication.
    8. לייבש את חלקיקי חלקיקים תחת ואקום בטמפרטורת החדר עבור 12 h.
  3. הפונקציונליזציה של MNP@SiO2 עם (3-aminopropyl) triethoקסיסטן (aptes)
    1. לשטוף 500 מ"ג של MNP@SiO2 שהתקבלו מן השלב הקודם עם N, n-diמתילמיד (dmf) תחת האווירה האינרטי ולאחר מכן sonicate עבור 1 דקות ב 40 kHz. לאחר מכן, בטל את הסופרנטנט וחזור על תהליך זה שלוש פעמים.
    2. מחדש להשעות את החלקיקים בבקבוקון התחתון עגול, תחת ערבוב עם בר מגנטי לערבב ולהוסיף 9 מ ל של APTES.
    3. מערבבים את התערובת ב-60 ° c עבור 12 שעות.
    4. להיפטר supernatant ולשטוף את חלקיקי חלקיקים עם 96% אתנול שלוש פעמים לסירוגין עם sonication.
  4. סינתזה של פראוקמין
    1. לפזר 100 mg (0.15 mmol) של מלח דפרוקסמין ו 53.0 mg (0.15 mmol) של Fe (acac)3 ב 5 מ ל של מים מזוקקים ומערבבים את התערובת לילה בטמפרטורת החדר.
    2. שטוף את המוצר כתוצאה שלוש פעמים עם 20 מ ל של אטואק במשפך הפרדה ולאחר מכן, הסר את הממס האורגני תחת ואקום באמצעות מאייד.
    3. להקפיא את השלב המים כדי לממן פראוקאמין כמו אדום מוצק.
  5. סינתזה של N-סוסוקסימין
    1. הוסף 350 mg (3.50 mmol) של האנהידריד סוהיד לפתרון של 100 mg (0.17 mmol) של פראוקאמין ב 5 מ ל של פירידין ב 50 mL בתוך התחתית בקבוקון בתוך האווירה האדיש.
    2. מערבבים את התערובת הנוצרת בטמפרטורת החדר במשך 16 שעות. לאחר זמן זה, להסיר את העודף של פירידין תחת לחץ מופחת במאייד ה, כדי לתת מוצק כהה אדום.
    3. מפזר את התגובה גולמי 3 מ ל של מתנול.
    4. העבר את הפתרון המיאנופילית לעמוד Sephadex (20 ס מ של Sephadex בטור בקוטר 20 מ"מ) ואליוט ב 0.5 mL/min.
    5. לאסוף את השבר האדום ולהסיר את המתנול תחת ואקום באמצעות מאייד.
  6. סינתזה של המשלים MNP@SiO2@NH @Fa
    1. לשטוף 30 מ ג יבש MNP@SiO2@NH2 פעמיים עם dmf ו Sonicate חלקיקי חלקיקים 100 mL erlenmeyer בקבוקון עבור 30 דקות תחת אווירה אינרטי.
    2. להכין פתרון של N-סווליפראמין (200 mg, 0.30 mmol), benzotriazole-1-yl-אוקסי-tris-(dimethylamino)-פוספוניום HEXAFLUOROPHOSPHATE (בופ, 173 מ ג, 0.45 ממול), 1-hydroxybenzotriazole (הובט, 46 mg, 0.39 mmol) ו- n,n-DI לאמילין (diאפונה, 128.8 mg, 1.21 ממול) ב 10 מ ל של dmf (לערבב a) ב-50 mL בתוך תחתית בקבוקון תחת האטמוספירה אינרטי.
    3. להשעות את ששטף בעבר MNP@SiO2@NH2 ב 3 מ ל dmf תחת sonication יבש תחת תנאי חמצן ללא תשלום באמצעות אווירת גז ארגון (Mix B).
    4. הוסף ערבוב A כדי לערבב B הdropwise.
    5. מטלטל את התערובת הסופית באמצעות שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר לילה.
    6. הפרד את המשלים המתקבל (MNP@SiO2@NH @Fa) מההשעיה באמצעות מגנט.
    7. לשטוף את מוצק כתוצאה מכך ולאחר מכן, sonicate זה חמש פעמים עם 10 מ ל אתנול.
    8. יבש את המוצק תחת ואקום עבור 24 שעות.

2. בקטריות שיטת עם Y. enterocolitica זנים לכמת את לכידת חיידקים פתוגניים עם חלקיקי חלקיקים

  1. הכינו השעיה של כל חלקיקי הביניים ואת המשלים הסופי ב-PBS ב 1 מ"ג/mL בצינורות 2 מ ל סטרילי.
  2. הכינו תרבות של י. בידור בתוך 5 מ ל של לוריא ברגאני (LB) מרק לילה המבקע ב 37 ° c.
  3. להכין 5 מ ל של מרק סויה טריפטי ברזל לקוי (TSB) על ידי הוספת 50 μL של 10 מ"מ 2, 2 ′-bipyridyl.
  4. החזר 5 מ ל של ברזל לקוי TSB עם 50 μL של תרבות הלילה של Y. enterocolitica ולאחר מכן, דגירה ב 37 ° צ' עם עצבנות עד OD600 = 0.5 \ u 20120.8 מגיע.
  5. קח 100 μL של התרבות שהושגו בשלב 2.4 ולדלל ב שפופרת 2.0 mL המכילה 900 μL של PBS כדי לקבל ה1/10 ראשון בשנת דילול. אז, להכין דילול 1/100 מן הדילול הראשון באמצעות אותו הליך כדי לקבל ריכוז של תאים חיידקיים ב 1 x 106 המושבה היוצרים יחידות (cfu)/ml בקירוב.
  6. הוסף 100 μL של חלקיקי חלקיקים ב 1 מ"ג/mL ל 1 מ ל של 1/100 דילול של ההשעיה בקטריאלי בתוך שפופרת של 2.0 mL, ו הומוגון עם מערבולת.
  7. מודג את התרבות ב 20 ° צלזיוס עבור 1 h.
  8. הפרד את אגרגטים MNP/חיידקים באמצעות מגנט ולהשליך בזהירות את הסופרנטאנט.
  9. לשטוף את חלקיקי חלקיקים מופרדים פעמיים עם 1 mL PBS באמצעות מערבולת.
  10. להשעות את חלקיקי חלקיקים ב 1 מ ל של PBS לספור את כמות הלכידה בקטריאלי CFU/mL.
  11. הכינו ארבעה 1/10 רצופים של השעיה לשעבר עד שיגיע לדילול של 1 x 10-4 .
  12. צלחת 10 μL של כל דילול על לוחות TS אגר ו משחיז אותם ב 37 ° c בלילה.
  13. לצלם את הצלחת עם מכשיר ג'ל במצב לבנים אפינפרין. עבד את התמונה עם תוכנה מתאימה כדי להגביר נקודה כדי לספור את מספר המושבות הבודדות.
    הערה: כל מתווך MNP התאפיין לעקוב אחר התקדמות הסינתזה. ראשית, MNPs החשופים נחקרו על ידי XRD לבדוק את המבנה הגבישי. לאחר מכן, הספקטרום של FT-IR של כל ביניים הופעל כדי לבדוק את השינויים שהתרחשו בתגובה המתאימה. ניתוח ספקטרוסקופיית ראמאן של כל ביניים בוצע גם כדי לאשר את המסקנות להסיק מ-FT-IR ספקטרום. ניתוח TGA איפשר לנו להעריך את משקל הפסד של intermediates נושאת חומר אורגני במבנה שלה. המבנה והגודל של כל ביניים נחקרו על ידי TEM. לבסוף, ניתוח XPS היה קריטי כדי לקבוע את מצבי החמצון של האטום בכל משטח ביניים של MNP ולאשר את היווצרות הקשר הקוולנטי בתוך המשלים MNP@SiO2@NH @Fa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון מבני ממצה מבוצע על מנת לקבוע את המבנה ואת המאפיינים של כל ביניים ואת המשלים הסופי. למטרה זו, טכניקות XRD, FT-IR, ראמאן ספקטרוסקופית, TGA, TEM, מיפוי EDX ו-XPS משמשים כדי להדגים את היווצרות המשלים. מצבי החמצון של האטומים במשטח של חלקיקים שנרכשו על ידי X-ray ספקטרוסקופיית פוטואלקטרון (XPS) הם הנתונים הרלוונטיים ביותר כדי לאשר את היווצרות של קשרים בעלי ערך קוולנטי בין הננו-חלקיק והסידרופפור. בהסכמה עם תוצאות אלה, פרוטוקול זה מתבטא.

חשופים MNP, הפונקציונליות של Mnp והמשלים מעורבבים עם כל Y. enterocolitica המתח בפתרון PBS. אגרגטים של חיידקים MNPs מופרדים ההשעיה באמצעות מגנט. לאחר שטיפה את האגרגטים פעמיים עם ה-PBS, הם מושעים מחדש ב-PBS כדי להכין מדלל סדרתי המצופה לספירת המושבה.

Intermediates והמשלים הסופי שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה הוגשו מספר טכניקות כדי להציג את השינויים שמתרחשים בכל שלב של הסינתזה. ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ו ראמאן מהווים דרך קלה ומהירה לנטר כל שלב של הסינתזה. הנוכחות של להקות אופייני המתאים Si-O, C-Si-C, Fe-O, O = C מאמיד רטט, O = C-N ברטט חומצה הידרותלמי ב-FT-IR ו ראמאן (ראה להלן) ספקטרום היו האינדיקטורים הראשונים של השינויים הכימיים כי התרחש על פני השטח של חלקיקים מגנטיים בכל שלב של סינתזה.

הפצת XRD

איור 1 מציג את הניתוח xrd המשמש כדי לאשר את ההרכב ואת המבנה הגבישי של חלקיקים מגנטיים סינתטיים (mnp) של מגנטיט על ידי השוואה עם JCPDS קובץ 00-003-0863.

ניתוח טם

איור 2C מציג נקודות בהירות של דפוס העקיפה האלקטרונים התואמים עם (111), (220), (311), (400), (422) ו-(511) מטוסי עקיפה של מגנטיט המתאימים d-spacings של 440, 4.9, 2.9, 2.4, 2.0, 1.7 ו-1.6 Å, בהתאמה. מצד שני, איור 2D ואיור 4e להראות תמונות TEM של MNP@SiO2@NH2@Fa המתאים חלקיקים mnp התפזרו (~ 10 ננומטר) מוטבע בחומר חסר-אורגנית אורגני. עובי הציפוי הוא מעל ~ 10 ננומטר.

ניתוח EDX

מפות EDX להציג את התפלגות האלמנטים Fe, O, Si ו-C על פני השטח. איור 3A מראה בבירור את נוכחותו של Si על פני השטח של MNP@SiO2. לאחר הפונקציה של הפונקציונליזציה והקוניוגציה עם feroxamine, תוספת של C על פני השטח של חלקיקים עבור MNP@SiO2@NH @Fa מוצג באיור 3b כהוכחה של הקוניוגציה מוצלחת.

ניתוח IR

FTIR ספקטרום של חשופים MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 ו MNP@SiO2@NH @Fa מוצג באיור 4. כל ה-FTIR ספקטרום מציג את תחילתה של להקה בטווח הספקטרלי של הניתוח ב-600 ס"מ-1 שהיה קשור לויברציות של Fe-O. הנוכחות של להקה רחבה ב 1050 ס"מ-1-מיוחסת לתנודות Si-O-si-בספקטרום ftir של MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 ו MNP@SiO2@NH @Fa אישר את ציפוי סיליקה.

הספקטרום של FTIR של MNP@SiO2 (איור 4) מציג להקה נרחבת בין ה830-1275 ס"מ-1 (Si-O בונד); זה הופך חזק יותר לאחר הפונקציונליזציה עם APTES בספקטרום של FTIR של MNP@SiO2@NH2, כנראה בשל הקשר Si-C (צפוי בין 1175 ו 1250 ס"מ-1). לבסוף, הלהקות ב 2995 ס"מ-1 (C-H מתיחה אג ח), 1640 ס"מ-1 (o = c-NH amide II רטט) ו 1577 ס"מ-1 (o = c-N הידרותלמי ברטט חומצה) נצפתה בספקטרום ftir של MNP@SiO2@NH @Fa אישר את הקוניוגציה של פראוקמין עם חלקיקים10.

אנליזה תרמוגרבימטריה

נתונים תרמוגרבימטריה מוצגים באיור 5, אשר מציג את הירידה במשקל בשל תוספת של חומר אורגני ומים.

ניתוח ראמאן

ציפוי סיליקה והפונקציונליזציה של MNP חשופים אושרו גם על ידי ניתוח ראמאן של כל ביניים ו MNP@SiO2@NH @Fa (איור 6). כל להראות ספקטרום מראה פסגות ב 305.8, 537.2 ו 665.6 ס"מ-1, המתאים ויברציות Fe-O (איור 6a)11, וכתב על הפסגה ב-713.5 ס"מ-1, ביחס Si-O-si ויברציות (איור 6a)12. לאחר הפונקציונליות של APTES, הספקטרום ראמאן של MNP@SiO2@NH2 מציג פסגות אינטנסיבי ב 1001.5 ו 1027.4 ס"מ-1, המתאים לנוכחות של SiO2, ו ב 1578.6 ו-1597.9 ס"מ-1, המאשר את היווצרות אג ח סי-סי. יתר על כן, נוכחות של הכתף של הפסגה ב 703.0 ס"מ-1 אישרה גם את הנוכחות של aptes (איור 6c)13,14. לבסוף, את השיא הרחב בין 1490 ו 1700 ס"מ-1 (מרוכז ב ~ 1581 ס מ-1), המתאים לאיגרות חוב Si-C וקבוצות אמיד בספקטרום ראמאן של MNP@SiO2@NH @Fa, הם בהסכמה עם היווצרות של המשלים (איור 6d)14.

ניתוח XPS

חקר מצב החמצון של האטומים על פני השטח בוצע על ידי ניתוח XPS ואישר את היווצרות אגרות החוב במבנים. איור 7 מציג את ספקטרום ה-XPS של הפונקציונליות החשופה והשונה של ה-mnps. עבור MNP, שיא צר ב C1s עשוי להיות עקב זיהומים בטיפול במדגם במהלך הסינתזה. הכנסת הפחמן נצפתה כ-C-C ו-C-H אגרות חוב בMNP@SiO2@NH2 ו MNP@SiO2@NH @Fa ספקטרום. ניתוח השיא ב 399 eV ב ספקטרום N1s יחד עם הנחתה שלה נצפתה עבור MNP@SiO2@NH @Fa מאשרת את היווצרות קשרים אמיד בין MNP@SiO2@NH2 ו feroxamine. יתר על כן, קיומו של הקשר של N-O של moieties הידרותלמי הוא הישג עם נוכחות של שיא ב 402 eV. הנוכחות של שיא ב 102 eV ב Si2p ספקטרום צר בכל intermediates והמשלים הוא בהסכמה עם האנרגיה המחייב עבור קבוצת siloxane15,16.

Z פוטנציאל

Z ערכים פוטנציאליים מוצגים בטבלה 1. התוצאות הן שליליות,-25.21 ו-29.35 mV, עבור MNP ו-MNP@SiO2, בהתאמה. פונקציונליזציה עם APTES לתת MNP@SiO2@NH2 שינתה את הטעינה משטח שלילי לחיובי. עובדה זו יוחסה לקבוצות אמין והמטען הפנימי נשאר חיובי עבור MNP@SiO2@NH @Fa. הפוטנציאל החיובי של משטח Z יכול להסביר את האינטראקציה בין החיידקים (שפני השטח שליליים) והמשלים17,18,19.

שיטת לכידת חיידקים

מספר התאים של Y. enterocolitica שירותים-a ו FOXA wc-12-8 שנתפסו עם mnp intermediates ו MNP@SiO2@NH @Fa היו כמותית בדילול אלה היכן 40 \ u201260 המושבות היו פרודים בקלות לדמיין. מספר התאים שנלכדו על ידי חשופים, MNP@SiO2, ו MNP@SiO2@NH2 מראה אין הבדלים משמעותיים ביניהם (איור 8). הכוחות האלקטרוסטטית בשל קבוצות מאמין חינם ב MNP@SiO2@NH2 ואת הריכוז הנמוך של קולטן קרום פראוקאמין בחיידקים עשוי להצדיק את היעדר ספציפיות כריכה צפוי.

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בסינתזה של סוג שונה של שערי מעלה, בעיקר אלה המשתמשים בכימיה קרבודימיד. הוא תכליתי מספיק כדי להציג שינויים על מנת להשיג תוצאות טובות יותר. האפיון המלא של כל הintermediates והמשלים הסופי, תוך שימוש בטכניקות המתוארות, מאפשר לאחד לעקוב אחר כל שלב של הסינתזה ולאשר את היווצרות קשר התשוקה. ספירת המושבות בחיידק ללכוד את הנתונים, באמצעות ירידה μl 10, מאפשר לבדוק את כל הדגימות באותו זמן בצלחת אחת שהופכת קל יותר לקבל משכפל ולבצע בחני בתנאים שונים.

Figure 1
איור 1: השוואה של MNP (פה3O4) (סגול) ותבנית מגנטיט (שחור) מפזרת-גרם.
דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שדה בהיר TEM ותמונות עקיפה אלקטרונית של MNP חשופים (A, B ו-C), ושל MNP@SiO2@NH @Fa (D, E ו-F).
תמונות הן ברזולוציות בינוניות וגבוהות. דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מפות EDX של MNP@SiO2: תמונה haadf והמקביל Fe, Si, O ו-C מפות של A. MNP@SiO2 ו-B. MNP@SiO2@NH @Fa.
דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: FT-IR ספקטרום של תחמוצת ברזל חשופים (Fe3O4) mnp, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 ו MNP@SiO2@NH @Fa (4).
דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח תרמוגרבימטרי של MNP, MNP@SiO2@NH2, ו MNP@SiO2@NH @Fa.
דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מראמאן ספקטרום של תחמוצת ברזל חשופים (Fe3O4) mnp (א), MNP@SiO2 (ב), MNP@SiO2@NH2 (ג) ו MNP@SiO2@NH @Fa (ד).
(*) APTES, (* *) שלבים אחרים תחמוצת ברזל, כנראה נוצר מן הטרנספורמציה של מגנטיט על ידי כוח הלייזר. דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ספקטרום של XPS הצר של MNP, MNP@SiO2@NH2 ו MNP@SiO2@NH @Fa. דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: CFU של Y. enterocolitica שנתפסו לכל 100 μg של חלקיקים מגנטיים: חשופים, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 ו MNP@SiO2@NH @Fa.
(א) שרותים-a (פראי סוג) (ב) Foxa שרותים-a 12-8 (מוטציה חסר פראוקאמין קולטן FOXA) ו-SEM תמונה של MNP@SiO2@NH @Fa אינטראקציה עם Y. enterocolitica. דמות זו שונתה מ מרטיז-Matamoros ואח '9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דוגמה Z פוטנציאל
MNP -25.21
MNP@SiO2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO2@NH @Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc @Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH @Fa 10.96

טבלה 1: Z מדידות פוטנציאליות. השולחן הזה התקבל ממרטיז-מאטאמנוס ואח '9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של מקשר בין חלקיקי חלקיקים מגנטיים לבין הסימאואופור פראוקאמין באמצעות חיבור קוולנטי. סינתזה של מגנטיט בוצעה בפרוטוקול שדווח על-ידי פינה ואח '5 ולאחריה ציפוי סיליקה כדי להגן על הגרעין המגנטי של קורוזיה במערכות מימית, כדי למזער את הצבירה ולספק משטח מתאים לפונקציונליזציה6. תהליך ציפוי סיליקה השתנה. במקום לבצע שלושה ציפויים שדווחו על ידי לי ואח '6, mnps היו מצופים בשתי שכבות סיליקה בשיטה זו (איור 2d) שהיה מספיק כדי להמשיך בשלב הפונקציונליזציה עם aptes7.

Deferoxamine היה מלא ברזל (III) כי הוא פגיע השפלה בתוך כמה שעות בטמפרטורת החדר. הדרך הטובה ביותר להשיג את מתחם הברזל הוא באמצעות מרחכי ברזל acetonate כי הטיהור שלה על ידי נוזל נוזלי החילוץ הוא מאוד פשוט feroxamine מתקבל תשואה כמותית. Feroxamine הוא יציב והוא יכול להיות שונה לתת N-סולאילפראמין באמצעות האנהידריד סומד להוסיף קבוצה חומצית מסוף כמקשר. טיהור על ידי הדרה כרומטוגרפיה גודל מאפשר הסרה של האנהידריד העודפים ו חומצה סוקסימית מתוך N-סוסופראמין.

השתמשו ב-"אמין ננו" כדי לקשר." תהודה מגנטית גרעינית (NMR) לא ניתן להשתמש עבור ההסבר המבני של המוצרים בשל התנהגות פאראגנטית של תחמוצת ברזל. מסיבה זו, כל צעד התגובה היה מפוקח על ידי FT-IR ולאחר מכן אישר על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. התאמת פסגות והולם נעשו עם תוכנה נוחה לקחת בחשבון כי ספקטרום ראמאן כללה עשרה מדדים של 300 s עם זמן מדידה כולל של 3,000 s. מורפולוגיה וגודל נמדדו על ידי TEM התבוננות מגנטיט צורה כדורית עם התפלגות בגודל הומוגנית של 10 ננומטר (איור 2A,B). עובי הציפוי המשלים מראה 10 שכבת הומוגנית ננומטר (איור 2D,E).

קשה מאוד להשיג שדה TEM שבו חלקיקים יכולים להיות נצפתה בנפרד בשל אופיו המגנטי והנטייה שלה לאגלומרט. מיפוי EDX שימש להשגת מידע על הרכבו של כל אלמנט על פני השטח (איור 3A). צפיפות הפחמן הוגדלה בבירור ב המשלים MNP@SiO2@NH@פא (איור 3b) ביחס לזה של הMNP@SiO ביניים2.

החיידק לכידת החיידקים תוכנן על מנת לבדוק את היכולת של המשלים ללכוד חיידקים דרך קולטן חלבון הממברנה החיצונית של feroxamine. ירזיניה בנוקולטיקה WC-זן נבחר כי הוא מבטא את הקולטן Foxoxamine והוא קל לצמוח. הצעד הקריטי בהליך זה היה הסרת חיידקים שאינם נתפסו. זה הושג על ידי שטיפה ו vortexing עם ה-PBS סטרילי פעמיים לאחר מכן על ידי שחזור של חיידקים המשלים אגרגטים באמצעות מגנט. מספר התאים שנלכדו על-ידי כל אחד מאמצעי הביניים MNP, המשמש כשליטה, והמשלים MNP@SiO2@NH @Fa נקבעו על ידי ספירת המושבה משיטת דילול. שימוש 10 μL טיפות מקל על ההליך הניסיוני ומאפשר להתמודד עם יותר מארבע דגימות הפחתת העלות של הבדיקה במונחים של זמן וחומרים לעומת השיטה הקלאסית של הפלאק ספירת המושבות.

המגבלה החשובה ביותר של סינתזה של הMNP@SiO2@NH @Fa המשלים הוא שאין אפשרות לאשר את היווצרות הקשר על ידי nmr. למרות הכנת MNP@SiO2@NH @Fa נראה פשוט, השימוש בטכניקות אפיון מבניים הוא חיוני כדי לאשר את הקשר בין siderophore ו mnp באמצעות קשר קוולנטי.

בעקבות הפרוטוקול הנוכחי, ניתן ליצור שערי מעלה באמצעות כימיה קרבודיאימיד. כדי להשיג את זה, הנוכחות של קבוצות אמינו על פני השטח של mnps ופונקציונליות של חומצה קרבוקסילית במתחם העניין הם נחוצים. בדיקת לינוטים שונים וציפוי משטח MNPs עם קבוצות פונקציונליות אחרות כדי למנוע יצירת חיובים חיוביים על זה יכול לשפר את האפליה לכידת חיידקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. אין לנו מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מכירים בהכרת תודה פרופסור קלאוס האנטקה (אוניברסיטת טיבינגן, גרמניה) כדי לספק באדיבות את זנים בידור Yersinia המשמשים בעבודה זו. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים AGL2015-63740-C2-1/2-R ו RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/פדר, האיחוד האירופי) מהסוכנות המדינה למחקר (AEI) של ספרד, ממומן על ידי תוכנית פדר מהאיחוד האירופי. עבודה באוניברסיטת סנטיאגו דה קומפוסטלה ואוניברסיטת A קורוניה נתמך גם על ידי מענקים GRC2018/018, GRC2018/039, ו ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC קבוצה אסטרטגית) מ Xunta דה גליסיה. בסופו של דבר, אנחנו רוצים להודות לנוריה קאלבו על שיתוף הפעולה הגדול שלה לעשות את הקול-off פרוטוקול וידאו זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41, (7), 2912-2942 (2012).
  2. Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
  3. Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27, (5), 637-657 (2010).
  4. Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109, (10), 4580-4595 (2010).
  5. Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17, (15), 3044-3049 (2005).
  6. Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76, (5), 484-489 (2010).
  7. Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
  8. El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129, (44), 13392-13393 (2007).
  9. Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9, (24), 13533-13542 (2019).
  10. Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788, (1-3), 1-6 (2006).
  11. Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174, (4), 424-430 (2003).
  12. González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320, (12), 92-99 (2003).
  13. Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14, (3-7), 1051-1056 (2005).
  14. You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93, (10), 103111-103113 (2008).
  15. Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603, (18), 2849-2860 (2009).
  16. Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137, (1-4), 179-183 (2002).
  17. Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
  18. Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
  19. Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
סינתזה של חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הקוניוגציה שלהם עם הסידרפפור פראאוקמין והערכתה לאיתור חיידקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).More

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter