Summary

Syntese av funksjonaliserte magnetiske nanopartikler, deres bøyning med Siderophore Feroxamine og dens evaluering for bakterier deteksjon

Published: June 16, 2020
doi:

Summary

Dette arbeidet beskriver protokoller for fremstilling av magnetiske nanopartikler, dets belegg med SiO2, etterfulgt av sin aminfunksjonalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens bøyning med deferoksamin ved hjelp av en succinyl moiety som linker. En dyp strukturell karakteriseringsbeskrivelse og en fangstbakterieranalyse ved hjelp av Y. enterocolitica for alle mellomliggende nanopartikler og den endelige konjugaten er også beskrevet i detalj.

Abstract

I det nåværende arbeidet, syntesen av magnetiske nanopartikler, dens belegg med SiO2, etterfulgt av sin aminfunksjonalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens konjugering med deferoxamin, en siderophore anerkjent av Yersinia enterolitica, ved hjelp av en succinyl moiety som en linker er beskrevet.

Magnetiske nanopartikler (MNP) av magnetitt (Fe3O4) ble utarbeidet av solvotermisk metode og belagt med SiO2 (MNP@SiO2) ved hjelp av Stöber-prosessen etterfulgt av funksjonalisering med APTES (MNP@SiO2@NH2). Deretter ble feroxamin konjugert med MNP@SiO2@NH2 av karboksodiimidekobling for å gi MNP@SiO2@NH2@Fa. Morfologien og egenskapene til konjugat og mellomprodukter ble undersøkt av åtte forskjellige metoder, inkludert pulver X-Ray diffraction (XRD), Fourier forvandle infrarød spektroskopi (FT-IR), Raman spektroskopi, røntgen fotoelektronspektroskopi (XPS), overføring elektronmikroskopi (TEM) og energidispergering X-Ray (EDX) kartlegging. Denne uttømmende karakteriseringen bekreftet dannelsen av konjugatet. Til slutt, for å evaluere kapasiteten og spesifisiteten til nanopartiklene, ble de testet i en fangstbakterianalyse ved hjelp av Yersinia enterocolitica.

Introduction

Bakteriedeteksjonsmetodene ved hjelp av MNP er basert på molekylær anerkjennelse av antistoffer, aptamers, bioprotein, karbohydrater konjugert til MNP av de patogene bakteriene1. Tatt i betraktning at siderophores er anerkjent av spesifikke reseptorer på den ytre membranen av bakterier, kan de også knyttet til MNP for å øke deres spesifisitet2. Siderophores er små organiske molekyler involvert i Fe3 + opptaket av bakterier3,4. Utarbeidelsen av konjugater mellom siderophores og MNP sammen med deres evaluering for fangst og isolering av bakterier er ennå ikke rapportert.

Et av de avgjørende trinnene i syntesen av konjugater av magnetiske nanopartikler med små molekyler er valg av type binding eller interaksjon mellom dem for å sikre at det lille molekylet er festet til overflaten av MNP. Av denne grunn var prosedyren for å forberede konjugaten mellom magnetiske nanopartikler og feroxamin – siderophore anerkjent av Yersinia enterocolitica– fokusert på generering av en modifiserbar overflate av MNP for å tillate å knytte den kovalent til siderophore av karmodiimidkjemi. For å få en jevn magnetitt nanopartikler (MNP) og for å forbedre kjernedannelse og størrelseskontroll, ble en solvolyse reaksjon med benzylalkohol båret i en termisk blokk uten å riste5. Deretter ble et silikabelegg generert av Stöber-metoden for å gi beskyttelse og forbedre stabiliteten til nanopartiklene suspensjon i vandige medier6. Med tanke på strukturen av feroxamin, er innføringen av amingrupper nødvendig for å produsere egnede nanopartikler (MNP@SiO2@NH2) som skal konjugeres med siderophore. Dette ble oppnådd ved kondens av (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med alkoholgruppene tilstede på overflaten av silikamodifiserte nanopartikler (MNP@SiO2) ved hjelp av en sol-gel metode7.

Parallelt ble feroxaminjern(III)-komplekset utarbeidet ved kompleksisering av kommersielt tilgjengelig deferoksamin med jernacetylacetonat i vandig løsning. NN-succinylferoxamin, med ravngrupper som vil fungere som linkers, ble oppnådd ved reaksjonen av feroxamin med ravnanhydrid.

Bøyningen mellom MNP@SiO2@NH2 og N-succinylferoxamine for å gi MNP@SiO2@NH@Fa ble utført gjennom karboksodiimidkjemi ved hjelp av som koblingsreagenser benzotriazol-1-yl-oxy -tris-(dimethylamino)-fosfonium heksafluorofosfat (BOP) og 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) i et mykt grunnleggende media for å aktivere terminalsyregruppen i N-succinylferoxamine8.

Når parlamentsmedlemmene ble karakterisert, evaluerte vi egenskapene til nakne og funksjonaliserte magnetiske nanopartikler for å fange villtype (WC-A) og en mutant av Y. enterocolitica som mangler feroxaminreseptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Vanlige parlamentsmedlemmer, funksjonaliserte parlamentsmedlemmer og konjugere MNP@SiO2@NH@Fa fikk lov til å samhandle med hver Y. enterocolitica stamme. Bakteriekonjugat aggregater ble skilt fra bakteriesuspensjon ved påføring av et magnetfelt. De separerte aggregatene ble skyllet to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), re-suspendert i PBS for å forberede seriefortynninger og deretter ble de belagt for kolonitelling. Denne protokollen demonstrerer hvert trinn i syntesen av MNP@SiO2@NH@Fa, strukturell karakterisering av alle mellomliggende og konjugat, og en bakteriefangstanalyse som en enkel måte å evaluere konjugatens spesifisitet i forhold til mellomliggendene. 9.

Protocol

MERK: For reaksjonene som ble utført under inerte atmosfæreforhold, ble alt glasset tidligere tørket i en ovn ved 65 °C, forseglet med en gummiseptum og renset med argon tre ganger. 1. Syntese av magnetiske nanopartikler konjugert med feroxamin Syntese av Fe3O4 magnetiske nanopartikler (parlamentsmedlemmer) Tilsett 0,5 g Fe(acac)3 i et 20 ml hetteglass i glass og bland deretter med 10 ml benzylalkohol. Sonicate denne blandingen …

Representative Results

En uttømmende strukturell karakterisering utføres for å bestemme morfologien og egenskapene til hvert mellomliggende og den endelige konjugatet. For dette formålet brukes teknikkene XRD, FT-IR, Raman spektroskopi, TGA, TEM, EDX kartlegging og XPS for å demonstrere dannelsen av konjugeringen. Oksidasjonstilstander av atomer på overflaten av nanopartiklene ervervet av røntgenfosterspektroskopi (XPS) er de mest relevante dataene for å bekrefte dannelsen av kovalente bindinger mellom nanopartikkelen og siderophore. I…

Discussion

Denne protokollen beskriver syntesen av en konjugat mellom magnetiske nanopartikler og siderophore feroxamin ved kovalent binding. Syntesen av magnetitt ble utført ved hjelp av protokollen rapportert av Pinna et al.5 etterfulgt av silikabelegg for å beskytte den magnetiske kjernen av korrosjon i vandige systemer, for å minimere aggregeringen og for å gi en passende overflate for funksjonalisering6. Silikabeleggprosessen ble endret. I stedet for å utføre tre belegg som…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkjenner takknemlig professor Klaus Hantke (Universitetet i Tübingen, Tyskland) for vennlig å levere Yersinia enterocolitica stammer som brukes i dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd AGL2015-63740-C2-1/2-R og RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) fra State Agency for Research (AEI) i Spania, co-finansiert av FEDER-programmet fra EU. Arbeidet ved Universitetet i Santiago de Compostela og Universitetet i La Coruña ble også støttet av tilskudd GRC2018/018, GRC2018/039 og ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC strategisk gruppe) fra Xunta de Galicia. Til slutt vil vi takke Nuria Calvo for hennes store samarbeid med å gjøre av denne videoprotokollen.

Materials

1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

References

  1. Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
  2. Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
  3. Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
  4. Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
  5. Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
  6. Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta – Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
  7. Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
  8. El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
  9. Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
  10. Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
  11. Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
  12. González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
  13. Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
  14. You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
  15. Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
  16. Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
  17. Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
  18. Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
  19. Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).

Play Video

Cite This Article
Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

View Video