Syntese av funksjonaliserte magnetiske nanopartikler, deres bøyning med Siderophore Feroxamine og dens evaluering for bakterier deteksjon

Summary

Dette arbeidet beskriver protokoller for fremstilling av magnetiske nanopartikler, dets belegg med SiO₂, etterfulgt av sin aminfunksjonalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens bøyning med deferoksamin ved hjelp av en succinyl moiety som linker. En dyp strukturell karakteriseringsbeskrivelse og en fangstbakterieranalyse ved hjelp av Y. enterocolitica for alle mellomliggende nanopartikler og den endelige konjugaten er også beskrevet i detalj.

Abstract

I det nåværende arbeidet, syntesen av magnetiske nanopartikler, dens belegg med SiO₂, etterfulgt av sin aminfunksjonalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens konjugering med deferoxamin, en siderophore anerkjent av Yersinia enterolitica, ved hjelp av en succinyl moiety som en linker er beskrevet.

Magnetiske nanopartikler (MNP) av magnetitt (Fe₃O₄) ble utarbeidet av solvotermisk metode og belagt med SiO₂ (MNP@SiO₂) ved hjelp av Stöber-prosessen etterfulgt av funksjonalisering med APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Deretter ble feroxamin konjugert med MNP@SiO₂@NH₂ av karboksodiimidekobling for å gi MNP@SiO₂@NH₂@Fa. Morfologien og egenskapene til konjugat og mellomprodukter ble undersøkt av åtte forskjellige metoder, inkludert pulver X-Ray diffraction (XRD), Fourier forvandle infrarød spektroskopi (FT-IR), Raman spektroskopi, røntgen fotoelektronspektroskopi (XPS), overføring elektronmikroskopi (TEM) og energidispergering X-Ray (EDX) kartlegging. Denne uttømmende karakteriseringen bekreftet dannelsen av konjugatet. Til slutt, for å evaluere kapasiteten og spesifisiteten til nanopartiklene, ble de testet i en fangstbakterianalyse ved hjelp av Yersinia enterocolitica.

Introduction

Bakteriedeteksjonsmetodene ved hjelp av MNP er basert på molekylær anerkjennelse av antistoffer, aptamers, bioprotein, karbohydrater konjugert til MNP av de patogene bakteriene¹. Tatt i betraktning at siderophores er anerkjent av spesifikke reseptorer på den ytre membranen av bakterier, kan de også knyttet til MNP for å øke deres spesifisitet². Siderophores er små organiske molekyler involvert i Fe^{3 +} opptaket av bakterier^3,4. Utarbeidelsen av konjugater mellom siderophores og MNP sammen med deres evaluering for fangst og isolering av bakterier er ennå ikke rapportert.

Et av de avgjørende trinnene i syntesen av konjugater av magnetiske nanopartikler med små molekyler er valg av type binding eller interaksjon mellom dem for å sikre at det lille molekylet er festet til overflaten av MNP. Av denne grunn var prosedyren for å forberede konjugaten mellom magnetiske nanopartikler og feroxamin – siderophore anerkjent av Yersinia enterocolitica– fokusert på generering av en modifiserbar overflate av MNP for å tillate å knytte den kovalent til siderophore av karmodiimidkjemi. For å få en jevn magnetitt nanopartikler (MNP) og for å forbedre kjernedannelse og størrelseskontroll, ble en solvolyse reaksjon med benzylalkohol båret i en termisk blokk uten å riste⁵. Deretter ble et silikabelegg generert av Stöber-metoden for å gi beskyttelse og forbedre stabiliteten til nanopartiklene suspensjon i vandige medier⁶. Med tanke på strukturen av feroxamin, er innføringen av amingrupper nødvendig for å produsere egnede nanopartikler (MNP@SiO₂@NH₂) som skal konjugeres med siderophore. Dette ble oppnådd ved kondens av (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med alkoholgruppene tilstede på overflaten av silikamodifiserte nanopartikler (MNP@SiO₂) ved hjelp av en sol-gel metode⁷.

Parallelt ble feroxaminjern(III)-komplekset utarbeidet ved kompleksisering av kommersielt tilgjengelig deferoksamin med jernacetylacetonat i vandig løsning. NN-succinylferoxamin, med ravngrupper som vil fungere som linkers, ble oppnådd ved reaksjonen av feroxamin med ravnanhydrid.

Bøyningen mellom MNP@SiO₂@NH₂ og N-succinylferoxamine for å gi MNP@SiO₂@NH_@Fa ble utført gjennom karboksodiimidkjemi ved hjelp av som koblingsreagenser benzotriazol-1-yl-oxy -tris-(dimethylamino)-fosfonium heksafluorofosfat (BOP) og 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) i et mykt grunnleggende media for å aktivere terminalsyregruppen i N-succinylferoxamine⁸.

Når parlamentsmedlemmene ble karakterisert, evaluerte vi egenskapene til nakne og funksjonaliserte magnetiske nanopartikler for å fange villtype (WC-A) og en mutant av Y. enterocolitica som mangler feroxaminreseptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Vanlige parlamentsmedlemmer, funksjonaliserte parlamentsmedlemmer og konjugere MNP@SiO₂@NH_@Fa fikk lov til å samhandle med hver Y. enterocolitica stamme. Bakteriekonjugat aggregater ble skilt fra bakteriesuspensjon ved påføring av et magnetfelt. De separerte aggregatene ble skyllet to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), re-suspendert i PBS for å forberede seriefortynninger og deretter ble de belagt for kolonitelling. Denne protokollen demonstrerer hvert trinn i syntesen av MNP@SiO₂@NH@Fa, strukturell karakterisering av alle mellomliggende og konjugat, og en bakteriefangstanalyse som en enkel måte å evaluere konjugatens spesifisitet i forhold til mellomliggendene. ^9.

Protocol

MERK: For reaksjonene som ble utført under inerte atmosfæreforhold, ble alt glasset tidligere tørket i en ovn ved 65 °C, forseglet med en gummiseptum og renset med argon tre ganger. 1. Syntese av magnetiske nanopartikler konjugert med feroxamin Syntese av Fe3O4 magnetiske nanopartikler (parlamentsmedlemmer) Tilsett 0,5 g Fe(acac)3 i et 20 ml hetteglass i glass og bland deretter med 10 ml benzylalkohol. Sonicate denne blandingen …

Representative Results

En uttømmende strukturell karakterisering utføres for å bestemme morfologien og egenskapene til hvert mellomliggende og den endelige konjugatet. For dette formålet brukes teknikkene XRD, FT-IR, Raman spektroskopi, TGA, TEM, EDX kartlegging og XPS for å demonstrere dannelsen av konjugeringen. Oksidasjonstilstander av atomer på overflaten av nanopartiklene ervervet av røntgenfosterspektroskopi (XPS) er de mest relevante dataene for å bekrefte dannelsen av kovalente bindinger mellom nanopartikkelen og siderophore. I…

Discussion

Denne protokollen beskriver syntesen av en konjugat mellom magnetiske nanopartikler og siderophore feroxamin ved kovalent binding. Syntesen av magnetitt ble utført ved hjelp av protokollen rapportert av Pinna et al.⁵ etterfulgt av silikabelegg for å beskytte den magnetiske kjernen av korrosjon i vandige systemer, for å minimere aggregeringen og for å gi en passende overflate for funksjonalisering⁶. Silikabeleggprosessen ble endret. I stedet for å utføre tre belegg som…

Materials

1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578