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Chemistry

Síntese de Nanopartículas Magnéticas Funcionalizadas, Sua Conjugação com a Feroxamina Siderophore e sua Avaliação para Detecção de Bactérias

doi: 10.3791/60842 Published: June 16, 2020

Summary

Este trabalho descreve protocolos para a preparação de nanopartículas magnéticas, seu revestimento com SiO2,seguido por sua funcionalização de amina com (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) e sua conjugação com deferoxamina usando uma moiety de succinil como linker. Uma descrição profunda da caracterização estrutural e um ensaio de bactérias de captura usando Y. enterocolitica para todas as nanopartículas intermediárias e o conjugado final também são descritos em detalhes.

Abstract

No presente trabalho, a síntese de nanopartículas magnéticas, seu revestimento com SiO2,seguido de sua funcionalização amina com (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e sua conjugação com deferoxamina, um siderophore reconhecido por Yersinia enterocolitica,usando um moiety de succinyl como linker são descritos.

As nanopartículas magnéticas (MNP) de magnetita (Fe3O4) foram preparadas pelo método solvothermal e revestidas com SiO2 (MNP@SiO2) utilizando o processo stöber seguido de funcionalização com APTES (MNP@SiO2@NH2). Em seguida, a feroxamina foi conjugada com o MNP@SiO2@NH2 por acoplamento de carbodiimídeo para dar MNP@SiO2@NH2@Fa. A morfologia e as propriedades dos conjugados e intermediários foram examinadas por oito métodos diferentes, incluindo difração de raios-X em pó (XRD), espectroscopia infravermelha de transformação fourier (FT-IR), espectroscopia de Raman, espectroscopia fotoeletrântrica de raios-X (XPS), microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e mapeamento de raios-X dispersivos de energia (EDX). Essa caracterização exaustiva confirmou a formação do conjugado. Finalmente, para avaliar a capacidade e especificidade das nanopartículas, elas foram testadas em um ensaio de bactérias de captura utilizando Yersinia enterocolitica.

Introduction

Os métodos de detecção de bactérias que utilizam MNP baseiam-se no reconhecimento molecular de anticorpos, aptamers, bioproteínas, carboidratos conjugados ao MNP pela bactéria patogênica1. Levando-se em conta que os siderophores são reconhecidos por receptores específicos na membrana externa das bactérias, eles também podem estar ligados ao MNP para aumentar sua especificidade2. Siderophores são pequenas moléculas orgânicas envolvidas na absorção do Fe3+ por bactérias3,4. A preparação de conjugados entre siderophores e MNP, juntamente com sua avaliação para a captura e isolamento de bactérias ainda não foi relatada.

Um dos passos cruciais na síntese de conjugados de nanopartículas magnéticas com pequenas moléculas é a seleção do tipo de ligação ou interação entre eles para garantir que a pequena molécula seja anexada à superfície do MNP. Por essa razão, o procedimento para preparar o conjugado entre nanopartículas magnéticas e feroxamina — o siderophore reconhecido pela Yersinia enterocolitica— foi focado na geração de uma superfície modificável do MNP para permitir ligá-lo covalentemente ao siderophore pela química de carbodiimídeo. A fim de obter uma nanopartículas magnetita uniforme (MNP) e melhorar a nucleação e controle de tamanho, uma reação de solvolise com álcool benzílico foi transportada em um bloco térmico sem tremer5. Em seguida, um revestimento de sílica foi gerado pelo método Stöber para conferir proteção e melhorar a estabilidade da suspensão das nanopartículas na mídia aquosa6. Levando-se em conta a estrutura da feroxamina, a introdução de grupos de amina é necessária para produzir nanopartículas adequadas (MNP@SiO2@NH2) a serem conjugadas com o siderophore. Isso foi conseguido por condensação de (3-aminopropil)triethoxysilano (APTES) com os grupos de álcool presentes na superfície das nanopartículas modificadas de sílica (MNP@SiO2) utilizando um método sol-gel7.

Paralelamente, o complexo de ferro feroxamina (III) foi preparado pela complexidade da deferoxamina comercialmente disponível com acetonato de acetil de ferro em solução aquosa. N-succinylferoxamina, com grupos de succinil que atuarão como eloers, foi obtido pela reação de feroxamina com anidrido succinico.

A conjugação entre MNP@SiO2@NH2 e N-succinylferoxamine para dar MNP@SiO2@NH@Fa foi realizada através da química de carbodiícida usando como reagentes de acoplamento benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfônio hexafluorophosphate (BOP) e 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) em uma mídia básica suave para ativar o grupo ácido terminal em N-succinylferoxamina8.

Uma vez caracterizados os MNPs, avaliamos as capacidades de nanopartículas magnéticas nuas e funcionalizadas para capturar o tipo selvagem (WC-A) e um mutante de Y. enterocolitica sem receptor de feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). MNPs simples, MNPs funcionalizados e os MNP@SiOconjugados 2@NH@Fa foram autorizados a interagir com cada cepa Y. enterocolitica. Os agregados de bactérias conjugadas foram separados da suspensão das bactérias pela aplicação de um campo magnético. Os agregados separados foram enxaguados duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), re-suspenso na PBS para preparar diluições seriais e, em seguida, foram banhados para contagem de colônias. Este protocolo demonstra cada passo da síntese de MNP@SiO2@NH@Fa, a caracterização estrutural de todos os intermediários e do conjugado, e um ensaio de captura de bactérias como uma forma fácil de avaliar a especificidade do conjugado em relação aos intermediários. 9

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Protocol

NOTA: Para as reações realizadas em condições de atmosfera inerte, todos os vidros foram previamente secos em um forno a 65 °C, selados com um septo de borracha e purgados com argônio três vezes.

1. Síntese de nanopartículas magnéticas conjugadas com feroxamina

  1. Síntese de Nanopartículas magnéticas Fe3O4 (MNPs)
    1. Adicione 0,5 g de Fe(acac)3 em um frasco de vidro de 20 mL e depois misture com 10 mL de álcool benzílico.
    2. Sonicar esta mistura por 2 minutos, depois transfira para um bloco de aquecimento e aqueça a 180 °C por 72 h.
    3. Depois que a reação for concluída, deixe os frascos esfriarem, enxágue as nanopartículas com 96% de etanol e centrífuga a 4000 x g por 30 minutos. Repita a centrifugação pelo menos duas vezes.
    4. Separe as nanopartículas do supernante por atração magnética usando um ímã de neodímio (NdFeB) e descarte o solvente residual.
    5. Enxágüe com 96% de etanol repetindo passo 1.1.4. e descarte o supernatante alternando com sônica em um banho por 1 min a 40 kHz até que o solvente pareça claro.
  2. Revestimento de nanopartículas magnéticas SiO2 (MNP@SiO2)
    1. Prepare uma suspensão de 2 g de MNP em 80 mL de isopropanol e, em seguida, adicione 4 mL de amônia de 21%, 7,5 mL de água destilada e 0,56 mL de ortossilicato de tetraetila (TEOS) (nesta ordem) em um frasco de fundo redondo com uma barra de agitação magnética.
    2. Aqueça a mistura a 40 °C por 2h com agitação contínua e depois sonicar por 1h.
    3. Separe o MNP com um ímã, descarte o supernasce e disperse-o em 30 mL de isopropanol.
    4. Repita as etapas 1.2.1. e 1.2.2.
    5. Retire e lave a barra de agitação magnética com 96% de etanol para recuperar todo o material.
    6. Separe as nanopartículas do supernante por atração magnética usando um ímã.
    7. Descarte o supernaspeuta e enxágue as nanopartículas com 96% de etanol três vezes alternadamente com sônica.
    8. Seque as nanopartículas sob vácuo à temperatura ambiente por 12 h.
  3. Funcionalização de MNP@SiO2 com (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES)
    1. Enxágüe 500 mgs do MNP@SiO2 obtidos da etapa anterior com N-dimetilformamida (DMF) em atmosfera inerte e depois sonicate por 1 min a 40 kHz. Em seguida, descarte o supernaspe e repita esse processo três vezes.
    2. Suspenda as partículas em um frasco fundo redondo, em mexer com uma barra de agitação magnética e adicione 9 mL de APTES.
    3. Mexa a mistura a 60 °C por 12 h.
    4. Descarte o supernaspeuta e enxágue as nanopartículas com 96% de etanol três vezes alternadamente com sônica.
  4. Síntese de feroxamina
    1. Dissolver 100 mgs (0,15 mmol) de sal mesilto deferoxamina e 53,0 mgs (0,15 mmol) de Fe(acac)3 em 5 mL de água destilada e agitar a mistura durante a noite à temperatura ambiente.
    2. Lave o produto resultante três vezes com 20 mL de EtOAc em um funil de separação e, em seguida, remova o solvente orgânico sob vácuo usando um evaporador rotativo.
    3. Congele a fase aquosa para permitir a feroxamina como um sólido vermelho.
  5. Síntese de NN-succinylferoxamina
    1. Adicione 350 mg (3,50 mmol) de anidrido succininico a uma solução de 100 mgs (0,17 mmol) de feroxamina em 5 mL de piridina em um frasco redondo de fundo redondo de 50 mL sob atmosfera inerte.
    2. Mexa a mistura resultante à temperatura ambiente por 16 h. Após esse tempo, remova o excesso de piridina sob pressão reduzida em um evaporador rotativo para dar um sólido vermelho escuro.
    3. Dissolva a reação bruta em 3 mL de metanol.
    4. Transfira a solução metodólica em uma coluna Sephadex (20 cm de Sephadex em uma coluna de 20 mm de diâmetro) e elute a 0,5 mL/min.
    5. Colete a fração vermelha e remova o metanol sob vácuo usando um evaporador rotativo.
  6. Síntese do conjugado MNP@SiO2@NH@Fa
    1. Enxágüe 30 mg de MNP@SiOseco 2@NH 2 duasvezes com DMF e sonicar as nanopartículas em um frasco de 100 mL Erlenmeyer por 30 minutos sob atmosfera inerte.
    2. Prepare uma solução de N-succinylferoxamine (200 mgs, 0,30 mmol), benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfônio hexafluorofosfato (BOP, 173 mgs, 0,45 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 46 mgs, 0,39 mmol) e N,N-diisopropylethylamina (DIPEA, 128,8 mgs, 1,21 mmol) em 10 mL de DMF (Mix A) em um flaskert de fundo redondo de 50 mL sob atmosfera inserção.
    3. Suspenda o MNP@SiO anteriormente enxaguado2@NH2 em 3 mL de DMF sob sônica em condições secas sob condições livres de oxigênio usando uma atmosfera de gás argônio (Mix B).
    4. Adicione a mistura A para misturar B dropwise.
    5. Agite a mistura final usando um agitador orbital à temperatura ambiente durante a noite.
    6. Separe o conjugado resultante (MNP@SiO2@NH@Fa) da suspensão usando um ímã.
    7. Enxágüe o sólido resultante e, em seguida, sonicate-lo cinco vezes com 10 mL de etanol.
    8. Seque o sólido sob vácuo por 24 h.

2. Ensaio bacteriano com cepas enterocoliticas de Y. para quantificar a captura de bactérias patogênicas com nanopartículas

  1. Prepare a suspensão de todas as nanopartículas intermediárias e o conjugado final em PBS a 1 mg/mL em tubos estéreis de 2 mL.
  2. Prepare uma cultura de Y. enterocolitica em 5 mL de caldo de Luria Bertani (LB) durante a noite incubando a 37 °C.
  3. Prepare um caldo de soja tripptic deficiente de ferro (TSB) adicionando 50 μL de 10 mM 2,2′-bipyridyl.
  4. Inocular os 5 mL de TSB deficiente de ferro com 50 μL da cultura pernoite de Y. enterocolitica e, em seguida, incubar a 37 °C com agitação até que um OD600 = 0,5\u20120.8 seja atingido.
  5. Tome 100 μL da cultura obtida na etapa 2.4 e dilua em um tubo de 2,0 mL contendo 900 μL de PBS para obter uma primeira diluição de 1/10. Em seguida, prepare uma diluição de 1/100 da primeira diluição usando o mesmo procedimento para obter uma concentração de células bacterianas em 1 x 106 Unidades de Formação de Colônias (UFC)/mL aproximadamente.
  6. Adicione 100 μL de suspensão de nanopartículas a 1 mg/mL a 1 mL da diluição de 1/100 da suspensão bacteriana em um tubo de 2,0 mL e homogeneize com vórtice.
  7. Incubar a cultura a 20 °C por 1 h.
  8. Separe os agregados MNP/bactéria usando um ímã e descarte cuidadosamente o supernasce.
  9. Enxágüe as nanopartículas separadas duas vezes com 1 mL PBS usando um vórtice.
  10. Suspenda as nanopartículas em 1 mL de PBS para contar a quantidade de captura bacteriana em UFC/mL.
  11. Prepare quatro diluições consecutivas de 1/10 da suspensão anterior até que uma diluição de 1 x10 -4 seja alcançada.
  12. Placa 10 μL de cada diluição em placas de ágar TS e incuba-as a 37 °C durante a noite.
  13. Fotografe a placa com um digitalizador de gel no modo epi branco. Processe a imagem com um software apropriado para amplificar um local para contar o número de colônias individuais.
    NOTA: Cada intermediário MNP foi caracterizado para acompanhar o andamento da síntese. Em primeiro lugar, os MNPs nus foram estudados pela XRD para verificar a estrutura cristalina. Em seguida, o espectro FT-IR de cada intermediário foi executado para verificar as alterações ocorridas na reação correspondente. A análise da espectroscopia de Raman de cada intermediário também foi realizada para confirmar as conclusões deduzidas dos espectros FT-IR. A análise da TGA nos permitiu estimar o peso de perda dos intermediários portadores de material orgânico em sua estrutura. A morfologia e o tamanho de cada intermediário foram estudados pelo TEM. Finalmente, a análise da XPS foi fundamental para determinar os estados de oxidação do átomo em cada superfície intermediária de MNP e confirmar a formação de vínculo covalente no conjugado MNP@SiO2@NH@Fa.

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Representative Results

Uma caracterização estrutural exaustiva é realizada a fim de determinar a morfologia e as propriedades de cada intermediário e o conjugado final. Para isso, as técnicas XRD, FT-IR, Raman spectroscopia, TGA, TEM, mapeamento EDX e XPS são utilizadas para demonstrar a formação do conjugado. Os estados de oxidação dos átomos na superfície das nanopartículas adquiridas pela espectroscopia de fotoeletrões de raios-X (XPS) são os dados mais relevantes para confirmar a formação de ligações covalentes entre a nanopartícula e o siderophore. De acordo com esses resultados, este protocolo é reprodutível.

MNP nu, MNPs funcionalizados e o conjugado são misturados com cada cepa Y. enterocolitica na solução PBS. Os agregados bacterianas-MNPs são separados da suspensão usando um ímã. Depois de enxaguar os agregados duas vezes com a PBS, eles são reins suspendidos na PBS para preparar diluições seriais que são banhadas para a contagem de colônias.

Os intermediários e o conjugado final preparados por meio deste protocolo foram submetidos a diversas técnicas para exibir as mudanças que ocorrem em cada etapa da síntese. A espectroscopia infravermelha e Raman constituem uma maneira fácil e rápida de monitorar cada passo da síntese. A presença de bandas características correspondentes a Si-O, C-Si-C, Fe-O, vibração amida O=C, vibração de ácido hidroxamicar O=C-N nos espectros FT-IR e Raman (veja abaixo) foram os primeiros indicadores das alterações químicas que estavam ocorrendo na superfície das nanopartículas magnéticas em cada passo da síntese.

Difrutorgrama XRD

A Figura 1 mostra a análise XRD utilizada para confirmar a composição e a estrutura cristalina das nanopartículas magnéticas sintéticas (MNP) de magnetita em comparação com o arquivo JCPDS 00-003-0863.

Análise TEM

A Figura 2C exibe pontos brilhantes do padrão de difração eletrônica que correspondem aos planos de difração (111), (220), (311), (400), (422), (511) e (440) de magnetita correspondentes a d-espaçamentos de 4,9, 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 e 1.4 Å, respectivamente. Por outro lado, a Figura 2D e a Figura 4E mostram imagens TEM de MNP@SiO2@NH2@Fa correspondentes a partículas MNP dispersas (~10 nm) embutidas no material iormoríaco-orgânico. A espessura do revestimento é superior a ~10 nm.

Análise EDX

Os mapas EDX exibem a distribuição dos elementos Fe, O, Si e C na superfície. Figura 3A mostra claramente a presença de Si na superfície de MNP@SiO2. Após a functionalização e conjugação da amina com feroxamina, o incremento de C na superfície das nanopartículas para MNP@SiO2@NH@Fa é mostrado na Figura 3B como evidência de uma conjugação bem sucedida.

Análise de RI

Espectro FTIR de MNP nu, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa é mostrado na Figura 4. Todos os espectros FTIR exibem o início de uma banda dentro da faixa espectral da análise em 600 cm-1 que estava relacionada com vibrações Fe-O. A presença de uma banda larga a 1050 cm-1— atribuída à vibração de alongamento si-o-si — no espectro FTIR de MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa confirmou o revestimento de sílica.

O espectro FTIR de MNP@SiO2 (Figura 4) exibe uma faixa ampla entre 830 e 1275 cm-1 (ligação Si-O); torna-se mais intenso após sua funcionalização com APTES no espectro FTIR de MNP@SiO2@NH2, provavelmente devido à ligação Si-C (esperada entre 1175 e 1250 cm-1). Finalmente, as bandas a 2995 cm-1 (ligações de alongamento C-H), 1640 cm-1 (vibração O=C-NH amide II) e 1577 cm-1 (vibração de ácido hidroxamic) observada no espectro FTIR de MNP@SiO2@NH@Fa confirmou a conjugação da feroxamina com as nanopartículas10.

Análise termogravimetria

Os dados da termogravimetria são mostrados na Figura 5,que exibe a perda de peso devido à adição de material orgânico e água.

Análise de Raman

O revestimento de sílica e a funcionalização do MNP nu também foram confirmados pela análise de Raman de cada intermediário e MNP@SiO2@NH@Fa (Figura 6). Todos os espectros de Raman mostram picos de 305,8, 537,2 e 665,6 cm-1, correspondentes às vibrações fe-o(Figura 6A)11, e um ombro no pico de 713,5 cm-1, relativo às vibrações de Si-O-Si(Figura 6B)12. Após a funcionalização de APTES, o espectro Raman de MNP@SiO2@NH2 apresenta picos intensos em 1001,5 e 1027,4 cm-1, correspondendo à presença de SiO2, e em 1578,6 e 1597,9 cm-1, confirmando a formação de títulos Si-C. Além disso, a presença de um ombro do pico em 703,0 cm-1 também confirmou a presença de APTES (Figura 6C)13,14. Finalmente, o amplo pico entre 1490 e 1700 cm-1 (centrado em ~1581 cm-1), correspondente aos laços Si-C e grupos de amida no espectro raman de MNP@SiO2@NH@Fa, estão de acordo com a formação do conjugado (Figura 6D)14.

Análise XPS

O estudo do estado de oxidação dos átomos na superfície foi realizado pela análise xps e confirmou a formação de ligações nas estruturas. A Figura 7 mostra os espectros XPS dos MNPs nus e diferentes funcionalizados. Para mnp, um pico estreito em C1s pode ser devido a impurezas no manuseio da amostra durante a síntese. A introdução do carbono é observada como ligações C-C e C-H em MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa espectros. A análise do pico em 399 eV no espectro N1s juntamente com sua atenuação observada para MNP@SiO2@NH@Fa confirma a formação de laços de amida entre o MNP@SiO2@NH2 e feroxamina. Além disso, a existência de ligação N-O de moieties hidroxamic está em acordo com a presença de um pico de 402 eV. A presença de um pico de 102 eV em Espectros estreitos Si2p em todos os intermediários e o conjugado está de acordo com a energia vinculante para o grupo siloxano15,16.

Z Potencial

Os valores potenciais de Z são exibidos na Tabela 1. Os resultados são negativos, -25,21 e -29,35 mV, para MNP e MNP@SiO2, respectivamente. A funcionalização com APTES para dar MNP@SiO2@NH2 alterou a carga de superfície de negativa para positiva. Este fato foi atribuído aos grupos de amina e a carga superficial permanece positiva para MNP@SiO2@NH@Fa. O potencial positivo da superfície Z poderia explicar a interação entre bactérias (cuja superfície é negativa) e a conjugada17,,18,19.

Ensaio de captura de bactérias

O número de células de Y. enterocolitica WC-A e FoxA WC-A 12-8 capturadas com intermediários MNP e MNP@SiO2@NH@Fa foram quantificadas nessas diluições onde 40\u201260 colônias foram separadas e facilmente visualizadas. O número de células capturadas nuas, MNP@SiO2e MNP@SiO2@NH2 não apresenta diferenças significativas entre elas(Figura 8). As forças eletrostáticas devido aos grupos de amina livre em MNP@SiO2@NH2 e a baixa concentração de receptor de membrana de feroxamina em bactérias podem justificar a falta de especificidade de ligação esperada.

Este protocolo poderia ser aplicado na síntese de diferentes tipos de conjugados, principalmente aqueles que usam a química de carbodiimídeo. É versátil o suficiente para introduzir modificações a fim de obter melhores resultados. A caracterização completa de todos os intermediários e do conjugado final, utilizando as técnicas descritas, permite que se siga cada etapa da síntese e confirme a formação do vínculo do desejo. A contagem de colônias no ensaio de captura de bactérias, usando uma gota de 10 μL, permite testar todas as amostras ao mesmo tempo em uma placa que facilita a reprodução e a realização de ensaios em diferentes condições.

Figure 1
Figura 1: Comparação de difrugramas MNP (Fe3O4) (roxo) e magnetita (preto).
Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens tem de campo brilhante e difração eletrônica de MNP nua (A, B e C), e de MNP@SiO2@NH@Fa (D, E e F).
As imagens estão em média e altas resoluções. Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Mapas EDX de MNP@SiO2: Imagem HAADF e os correspondentes mapas Fe, Si, O e C de A. MNP@SiO2 e B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Espectros FT-IR deóxidode ferro nu (Fe 3 O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise termogravimétrica de MNP, MNP@SiO2@NH2e MNP@SiO2@NH@Fa.
Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Espectros raman deóxidode ferro nu (Fe 3 O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) e MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Outras fases de óxido de ferro, provavelmente formadas a partir da transformação da magnetita pelo poder laser. Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: XpS espectro estreito de MNP, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa. Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: CFU de Y. enterocolitica capturada por 100 μg de nanopartículas magnéticas: nuas, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (tipo selvagem) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutante sem receptor de feroxamina FoxA) e imagem SEM de MNP@SiO2@NH@Fa interagindo com Y. enterocolitica. Este valor foi modificado a partir de Martínez-Matamoros et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra Z Potencial
Mnp -25.21
MNP@SiO2 -29.35
2 MNP@SiO2@NH2 17.03
22MNP@SiO @NH@Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH@Fa 10.96

Tabela 1: Medidas potenciais Z. Esta tabela foi obtida de Martínez-Matamoros et al.9.

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Discussion

Este protocolo descreve a síntese de um conjugado entre nanopartículas magnéticas e feroxamina siderophore por ligação covalente. A síntese de magnetita foi realizada utilizando-se o protocolo relatado por Pinna et al.5 seguido de revestimento de sílica para proteger o núcleo magnético da corrosão em sistemas aquosos, minimizar a agregação e fornecer uma superfície adequada para a funcionalização6. O processo de revestimento de sílica foi modificado. Em vez de realizar três revestimentos relatados por Li et al.6,os MNPs foram revestidos com duas camadas de sílica neste método (Figura 2D), o que foi suficiente para continuar com a etapa de funcionalização com APTES7.

A deferoxamina foi complexada com ferro (III) porque é suscetível à degradação dentro de algumas horas à temperatura ambiente. A melhor maneira de obter o complexo de ferro é usando acetonato de acetil de ferro porque sua purificação por extração líquido-líquido é muito simples e a feroxamina é obtida em um rendimento quantitativo. A feroxamina é estável e Npode ser modificada para dar N-succinylferoxamina usando anidrido succinico para adicionar um grupo ácido terminal como linker. A purificação por cromatografia de exclusão de tamanho permite a remoção do excesso de anidrido succinico e ácido suculento de N-succinylferoxamine.

O nanocomposto de amina Nfoi usado para ligar N-succinylferoxamina covalentemente na superfície. A ressonância magnética nuclear (RMN) não pode ser utilizada para a elucidação estrutural dos produtos devido ao comportamento paramagnético do óxido de ferro. Por essa razão, cada passo de reação foi monitorado por FT-IR e, em seguida, confirmado pela espectroscopia de Raman. Os picos de desconvolução e montagem foram feitos com um software conveniente levando em conta que o espectro de Raman incluía dez medidas de 300 s com um tempo de medida total de 3.000 s. Morfologia e tamanho foram medidos pelo TEM observando o magnetite de forma pseudoférica com uma distribuição de tamanho homogêneo de 10 nm(Figura 2A,B). A medida de espessura conjugada do revestimento mostra uma camada homogênea de 10 nm(Figura 2D,E).

É muito difícil obter um campo TEM onde nanopartículas podem ser observadas individualmente devido ao seu caráter magnético e sua tendência a aglomerar. O mapeamento EDX foi utilizado para obter informações sobre a composição de cada elemento na superfície (Figura 3A). A densidade de carbono foi claramente aumentada no conjugado MNP@SiO2@NH@Fa (Figura 3B) em relação à do MNP@SiO intermediário2.

O ensaio de captura de bactérias foi projetado para testar a capacidade do conjugado para capturar bactérias através do receptor de proteína da membrana externa feroxamina. Yersinia enterocolitica A cepa WC-A foi selecionada porque expressa o receptor de feroxamina FoxA e é fácil de crescer. O passo crítico neste procedimento foi a remoção de bactérias não capturadas. Isso foi conseguido através da lavagem e vórtice com PBS estéril duas vezes seguido pela recuperação dos agregados conjugados de bactérias usando um ímã. Os números de células capturadas por cada uma das mnp intermediárias, utilizadas como controle, e o conjugado MNP@SiO2@NH@Fa foram determinados pela contagem de colônias a partir do método de diluição. O uso de gotas de 10 μL facilita o procedimento experimental e permite lidar com mais de quatro amostras reduzindo o custo do teste em termos de tempo e material em comparação com o método clássico de colônias de contagem de placas.

A limitação mais importante da síntese do MNP@SiO2@NH@Fa conjugar é que não é possível confirmar a formação de vínculos pela RMN. Embora a preparação de MNP@SiO2@NH@Fa pareça simples, o uso das técnicas de caracterização estrutural é crucial para confirmar a ligação entre o siderophore e o MNP através de um vínculo covalente.

Seguindo o presente protocolo, é possível gerar conjugados utilizando a química de carbodiimídeo. Para isso, é necessária a presença de grupos de amino na superfície dos MNPs e uma funcionalidade de ácido carboxílico no composto de juros. Testar diferentes linkers e revestir a superfície dos MNPs com outros grupos funcionais para evitar criar cargas positivas sobre ele poderia melhorar a discriminação de captura bacteriana.

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Disclosures

Não temos nada para revelar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem com gratidão o professor Klaus Hantke (Universidade de Tübingen, Alemanha) por fornecer gentilmente as cepas enterocoliticas de Yersinia usadas neste trabalho. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas AGL2015-63740-C2-1/2-R e RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) da Agência Estatal de Pesquisa (AEI) da Espanha, co-financiada pelo Programa FEDER da União Europeia. O trabalho na Universidade de Santiago de Compostela e na Universidade de A Coruña também foi apoiado pelas bolsas GRC2018/018, GRC2018/039 e ED431E 2018/03 (grupo estratégico CICA-INIBIC) da Xunta de Galícia. Finalmente, queremos agradecer a Nuria Calvo por sua grande colaboração fazendo o protocolo de dublador deste vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

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References

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Síntese de Nanopartículas Magnéticas Funcionalizadas, Sua Conjugação com a Feroxamina Siderophore e sua Avaliação para Detecção de Bactérias
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Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).More

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

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