Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Синтез функциональных магнитных наночастиц, их спряжение с Siderophore Фероксамин и его оценка для обнаружения бактерий

doi: 10.3791/60842 Published: June 16, 2020

Summary

Эта работа описывает протоколы для подготовки магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES) и его спряжения с deferoxamine с помощью succinyl moiety в качестве связучателя. Глубокое описание структурной характеристики и анализ бактерий захвата с помощью Y. enterocolitica для всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгированный также описаны в деталях.

Abstract

В настоящей работе, синтез магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) и его спряжение с deferoxamine, боковой дрофор признан Yersinia enterocolitica, используя succinyl moiety в качестве связувателя описаны.

Магнитные наночастицы (MNP) магнетита (Fe3O4) были подготовлены solvothermal методом и покрыты SiO2 (MNP@SiO2) с использованием процесса Стёбер следуют функционализации с APTES (MNP@SiO2@NH2). Затем, фероксамин был конъюгированных с MNP@SiO2@NH2 карбодиимид соединения дать MNP@SiO2@NH2@Fa. Морфология и свойства конъюгированных и промежуточных были изучены восемью различными методами, включая дифракцию порошкового рентгеновского излучения (XRD), фурье трансформировать инфракрасную спектроскопию (FT-IR), спектроскопию Романа, рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS), микроскопию электронов передачи (TEM) и энергетическую дисперсию X-Ray. Эта исчерпывающая характеристика подтвердила формирование конъюгата. Наконец, для того, чтобы оценить емкость и специфичность наночастиц, они были протестированы в захвате бактерий анализа с помощью Yersinia enterocolitica.

Introduction

Методы обнаружения бактерий с использованием MNP основаны на молекулярном распознавании антител, апгтемеров, биопротеинов, углеводов, спряженных к MNP патогенными бактериями1. Принимая во внимание, что siderophores признаются конкретных рецепторов на внешней мембране бактерий, они также могут быть связаны с MNP, чтобы увеличить их специфичность2. Siderophores являются небольшие органические молекулы, участвующие в Fe3 "поглощение бактериями3,4. О подготовке спряжений между бокофорами и МНП наряду с их оценкой для улавливания и изоляции бактерий пока не сообщалось.

Одним из важнейших шагов в синтезе конъюгированных магнитных наночастиц с небольшими молекулами является выбор типа связи или взаимодействия между ними для обеспечения того, чтобы небольшая молекула была прикреплена к поверхности MNP. По этой причине, процедура подготовки конъюгировать между магнитными наночастицами и фероксамином- siderophore признанных Yersinia enterocolitica-была сосредоточена на генерации модифицируемой поверхности MNP, чтобы увязать его ковалентно в siderophore карбодиимицидной химии. Для того, чтобы получить единый наночастицы магнетита (MNP) и улучшить нуклеацию и контроль размера, реакция solvolysis с бензиловым спиртом была проведена в тепловом блоке без встряхивания5. Затем кремнеземное покрытие было сгенерировано методом Стёбера для защиты и повышения устойчивости подвески наночастиц в aqueous media6. Принимая во внимание структуру фероксамина, введение аминь групп необходимо для производства подходящих наночастиц (MNP@SiO2@NH2),чтобы быть сопряжены с siderophore. Это было достигнуто путем конденсации (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) с алкогольными группами, присутствующими на поверхности кремнезема модифицированных наночастиц (MNP@SiO2) с использованием метода соль-геля7.

Параллельно комплекс фероксаминов железа (III) был подготовлен комплексом коммерческого дефероксамина с ацетонатом железа ацетилата в аквеевом растворе. N-succinylferoxamine, подшипник succinyl групп, которые будут выступать в качестве связунов, был получен реакцией фероксамина с сукциническим ангидридом.

Спюгация между MNP@SiO2@NH2 и N-succinylferoxamine дать MNP@SiO2@NHиФа была проведена через карбодииимид химии с использованием в качестве соединения реагентов бензорифотризол-1-й дифологтиуфос -оксофторофос (BOP) и 1-гидроксибензотриазол (HOBt) в мягком базовом носителе для активации терминальной кислотной группы в N-succinylferoxamine8. N

После того, как MNPs были охарактеризованы, мы оценили возможности голых и функциональных магнитных наночастиц для захвата дикого типа (WC-A) и мутант Y. enterocolitica не хватает фероксамина рецептора FoxA (FoxA WC-A 12-8). Равнины MNPs, функционализуемые MNPs и конъюгированных MNP@SiO2@NHФабыло разрешено взаимодействовать с каждым Y. enterocolitica штамма. Бактерии-конъюгированные агрегаты были отделены от бактерий подвески путем применения магнитного поля. Разделенные агрегаты дважды промывались фосфатным буферизированным физраствором (PBS), повторно приостанавливались в PBS для подготовки серийных разбавлений, а затем, они были покрыны для подсчета колоний. Этот протокол демонстрирует каждый шаг синтеза MNP@SiO2@NH@Fa, структурную характеристику всех промежуточных и конъюгированных, а также анализ захвата бактерии как простой способ оценить специфику спряжения по отношению к промежуточным. 9 9

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакций, выполняемых в условиях инертной атмосферы, вся стеклянная посуда была ранее высушена в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию, запечатана резиновой перегородкой и трижды продувается аргоном.

1. Синтез магнитных наночастиц, конъюгированных с фероксамином

  1. Синтез наночастиц магнитного синтеза Fe3O4 (MNPs)
    1. Добавьте 0,5 г Fe (acac)3 в стеклянный флакон 20 мл, а затем смешайте с 10 мЛ бензилового спирта.
    2. Sonicate эту смесь в течение 2 мин, затем передать в отопительный блок и тепла при температуре 180 градусов по Цельсию в течение 72 ч.
    3. После завершения реакции дайте флаконам остыть, промыть наночастицы 96% этанолом и центрифугой при 4000 х г в течение 30 мин. Повторите центрифугирование не менее двух раз.
    4. Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита неодимия (NdFeB) и отбросить остаточный растворитель.
    5. Промыть с 96% этанола повторяя шаг 1.1.4. и отбросить супернатант, чередующийся с звуковой в ванне в течение 1 мин при 40 кГц, пока растворитель не будет выглядеть ясным.
  2. Магнитные наночастицы SiO2 покрытие (MNP@SiO2)
    1. Подготовьте подвеску 2 г МНП в 80 мл изопропанола, а затем добавьте 4 мл 21% аммиака, 7,5 мл дистиллированной воды и 0,56 мл тетраэтил ортилического ортосиликата (TEOS) (в этом порядке) в круглую нижнюю колбу с магнитной решеткой.
    2. Нагрейте смесь при температуре 40 градусов по Цельсию при непрерывном перемешивании, а затем sonicate в течение 1 ч.
    3. Отделить MNP с магнитом, отбросить супернатант, и разогнать его в 30 мл изопропанола.
    4. Повторите шаги 1.2.1. и 1.2.2.
    5. Удалить и вымыть магнитного перемешать бар с 96% этанола, чтобы восстановить весь материал.
    6. Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита.
    7. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
    8. Высушите наночастицы при вакууме при комнатной температуре в течение 12 ч.
  3. Функционализации MNP@SiO2 с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES)
    1. Промыть 500 мг MNP@SiO2, полученных от предыдущего шага с N,N-диметилформамид (DMF) под инертной атмосферой, а затем sonicate в течение 1 мин на 40 кГц. Затем отбросьте супернатант и повторите этот процесс три раза.
    2. Повторно приостановить частицы в круглой нижней колбе, под перемешиванием с магнитной бар перемешать и добавить 9 мл APTES.
    3. Перемешать смесь при 60 градусов по Цельсию на 12 ч.
    4. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
  4. Синтез фероксамина
    1. Растворите 100 мг (0,15 ммоль) соли дефоксамина мезилата и 53,0 мг (0,15 ммоль) Fe (acac)3 в 5 мл дистиллированной воды и перемешайте смесь на ночь при комнатной температуре.
    2. Вымойте полученный продукт три раза с 20 мл EtOAc в разделительной воронке, а затем удалить органический растворитель под вакуумом с помощью вращательного испарителя.
    3. Заморозить-сухой aqueous фазы позволить себе фероксамин, как красный твердый.
  5. Синтез N-сукцинильфероксимин
    1. Добавьте 350 мг (3,50 ммоль) сучцинического ангидрида в раствор 100 мг (0,17 ммоль) фероксамина в 5 л пиризина в 50-м л круглой нижней колбе под инертной атмосферой.
    2. Перемешать полученную смесь при комнатной температуре в течение 16 ч. По истечении этого времени, удалить избыток пиридин под пониженным давлением в ротатор испаритель, чтобы дать темно-красный твердый.
    3. Растворите реакцию сырой в 3 мл метанола.
    4. Перенесите метаноловый раствор в колонку Sephadex (20 см Sephadex в столбе диаметром 20 мм) и elute на 0,5 м/мин.
    5. Соберите красную фракцию и удалите метанол под вакуум с помощью ротатора испарительного.
  6. Синтез сопряженного MNP@SiO2@NH@Fa
    1. Промыть 30 мг сухого MNP@SiO2@NH2 дважды с DMF и sonicate наночастицы в 100 мл Erlenmeyer колбу в течение 30 минут под инертной атмосферой.
    2. Приготовьте раствор NN-succinylferoxamine (200 мг, 0,30 ммоль), бензотриазол-1-ил-окс-трис-(диметиламино)-фосфоний гексафторосфат (БОП, 173 мг, 0,45 ммоль), 1-гидроксибензотриоз (HOBt, 46 мг, 0,39 ммоль) и N,N-diisopropythylamine (DIPEA, 128,8 мг, 1,21 ммоль) в 10 ммл DMF (Mix A) в 50 мЛ круглое дном в атмосфере.
    3. Приостановить ранее промыть MNP@SiO2@NH2 в 3 мЛ DMF под sonication в сухих в условиях, свободных от кислорода с использованием аргона газовой атмосферы (Mix B).
    4. Добавить смесь А, чтобы смешать B dropwise.
    5. Встряхните окончательную смесь с помощью орбитального шейкера при комнатной температуре на ночь.
    6. Отделите полученную конъюгированную (MNP@SiO2@NH@Fa) от подвески с помощью магнита.
    7. Промыть полученный твердый, а затем, sonicate его пять раз с 10 мл этанола.
    8. Высушите твердое тело под вакуумом на 24 ч.

2. Бактериальный анализ с штаммами Y. enterocolitica для количественной оценки улавливания патогенных бактерий с помощью наночастиц

  1. Подготовьте суспензию всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгации в PBS на 1 мг/мл в стерильных 2 мЛ трубках.
  2. Приготовьте культуру Y. enterocolitica в 5 мл бульона Лурия Бертани (LB) ночью инкубации при 37 градусов по Цельсию.
  3. Приготовьте 5 мл железа дефицитный триптический соевый бульон (TSB), добавив 50 мл 10 мМ 2,2'-bipyridyl.
  4. Прививайте 5 мл железа дефицитным TSB с 50 мл ночной культуры Y. enterocolitica, а затем, инкубировать при 37 градусов по Цельсию с агитацией до тех пор, пока не будет достигнут OD600 и 0.5'u20120.8.
  5. Возьмите 100 мл культуры, полученной в шаге 2.4 и разбавляйте в трубке 2,0 мл, содержащей 900 мл PBS, чтобы получить первое разбавление 1/10. Затем подготовьте разбавление 1/100 от первого разбавления с помощью той же процедуры, чтобы получить концентрацию бактериальных клеток на 1 х 106 колонии Формация единиц (CFU)/mL примерно.
  6. Добавьте 100 мл наночастиц суспензии при 1 мг/мл до 1 мл от 1/100 разбавления бактериальной подвески в трубке 2,0 мл и гомогенизировать вихрем.
  7. Инкубировать культуру при 20 градусов по Цельсию на 1 ч.
  8. Разделите агрегаты MNP/bacteria с помощью магнита и тщательно отбросьте супернатант.
  9. Промыть разделенные наночастицы дважды с 1 mL PBS с помощью вихря.
  10. Приостановите наночастицы в 1 мл PBS, чтобы подсчитать количество бактериального захвата в CFU/mL.
  11. Подготовка четырех последовательных 1/10 разбавления от бывшей подвески до 1 х 10-4 разбавления достигается.
  12. Плита 10 мл каждого разбавления на пластины агара TS и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
  13. Фотография пластины с гелевым диджитализатором в эпи-белом режиме. Обработайте изображение с соответствующим программным обеспечением для усиления пятна для подсчета количества отдельных колоний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый промежуточный MNP был охарактеризован для наблюдения за ходом синтеза. Во-первых, голые депутаты были изучены XRD, чтобы проверить кристаллическую структуру. Затем, FT-IR спектр каждого промежуточного был запущен, чтобы проверить изменения, которые произошли в соответствующей реакции. Был также проведен анализ спектроскопии каждого промежуточного анализа Романа, с тем чтобы подтвердить выводы, сделанные из спектра FT-IR. Анализ TGA позволил оценить вес потери промежуточных веществ, несущих органический материал в его структуре. Морфология и размер каждого промежуточного были изучены TEM. Наконец, анализ XPS имеет решающее значение для определения состояния окисления атома на каждой промежуточной поверхности МНП и подтверждения образования ковалентных связей в конъюгированном MNP@SiO2@NH@Fa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для определения морфологии и свойств каждого промежуточного и окончательного спряжения проводится исчерпывающая структурная характеристика. Для этого для демонстрации формирования конъюгации используются методы XRD, FT-IR, Рамановской спектроскопии, TGA, TEM, EDX mapping и XPS. Состояния окисления атомов на поверхности наночастиц, приобретенные рентгеновской фотоэлектронной спектроскопией (XPS), являются наиболее актуальными данными, подтверждающими образование ковалентных связей между наночастицами и бокофором. В соответствии с этими результатами этот протокол воспроизводится.

Голые MNP, функционализированные MNPs и конъюгации смешиваются с каждым Y. enterocolitica штамма в решении PBS. Агрегаты бактерий-МНМп отделены от подвески с помощью магнита. После полоскания агрегатов дважды с PBS, они повторно приостановлены в PBS для подготовки серийных разбавлений, которые покрыты для подсчета колоний.

Промежуточные и окончательные спряжения, подготовленные с использованием этого протокола, были представлены нескольким методам отображения изменений, происходящих на каждом этапе синтеза. Инфракрасная и Рамановская спектроскопия представляют собой простой и быстрый способ мониторинга каждого шага синтеза. Присутствие характерных полос, соответствующих спектрам Si-O, C-Si-C, Fe-O, O'C amide, вибрации гидроксамической кислоты O'C-N в спектре FT-IR и Raman (см. ниже) были первыми индикаторами химических изменений, происходящих на поверхности магнитных наночастиц на каждом этапе синтеза.

Диффрактограмма XRD

На рисунке 1 показан анализ XRD, используемый для подтверждения состава и кристаллической структуры синтетических магнитных наночастиц (MNP) магнетита по сравнению с файлом JCPDS 00-003-0863.

Анализ TEM

Рисунок 2C отображает яркие пятна шаблона дифракции электронов, которые совпадают с (111), (220), (311), (400), (422), (511) и (440) дифракционных плоскостей магнетита, соответствующих d-интервалам 4,9, 2,9, 2,4, 2,0, 1,7, 1,6 и 1,4 евро соответственно. С другой стороны, на рисунке 2D и рисунке 4E показаны изображения TEM2MNP@SiO2@NH 2 @Fa, соответствующие рассеянным MNP частиц (10 нм), встроенным в аморфный неорганический органический материал. Толщина покрытия составляет более 10 нм.

Анализ EDX

На картах EDX отображается распределение элементов Fe, O, Si и C на поверхности. На рисунке 3A отчетливо видно присутствие Si на поверхности MNP@SiO2. После деентализации амина и спряжения с фероксамином, приращение C на поверхности наночастиц для MNP@SiO2@NH@Fa показано на рисунке 3B как свидетельство успешного спряжения.

ИК-анализ

FTIR спектры голые MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa показано на рисунке 4. Все спектры FTIR отображают начало полосы в спектральном диапазоне анализа на уровне 600 см-1, что было связано с вибрациями Fe-O. Наличие широкой полосы на 1050 см-1- связано с Si-O-Si растяжения вибрации-в FTIR спектра MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa подтвердил кремнезем покрытие.

Спектр FTIR MNP@SiO2 (рисунок 4) отображает широкую полосу между 830 и 1275 см-1 (Si-O облигаций); он становится более интенсивным после его функционализации с APTES в спектре FTIR MNP@SiO2@NH2, вероятно, из-за Si-C облигаций (ожидается между 1175 и 1250 см-1). Наконец, полосы на 2995 см-1 (C-H растяжения связей), 1640 см-1 (O'C-NH амиде II вибрации) и 1577 см-1 (O'C-N гидроксамической кислоты вибрации) наблюдается в спектре FTIR MNP@SiO2@NH@Fa подтвердил конъюгации фероксамина с наночастицами10.

Анализ термогравиметрии

Данные термогравиметрии приведены на рисунке 5,который отображает потерю веса из-за добавления органического материала и воды.

Анализ Романа

Покрытие кремнезема и функционализации голого MNP были также подтверждены Анализом Романа каждого промежуточного и MNP@SiO2@NH@Fa(рисунок 6). Все Спектры Рамана показывают пики на 305,8, 537,2 и 665,6 см-1,соответствующие вибрациям Fe-O(рисунок 6A)11, и плечо на пике на 713,5 см-1, относящиеся к вибрациям Si-O-Si(рисунок 6B)12. После функционализации APTES спектр MNP@SiO2@NH2 отображает интенсивные пики на уровне 1001,5 и 1027,4 см-1,что соответствует присутствию SiO2,и на 1578,6 и 1597,9 см-1,что подтверждает образование si-C облигаций. Кроме того, наличие плеча пика на уровне 703,0 см-1 также подтвердило наличие APTES(рисунок 6C)13,14. Наконец, широкий пик между 1490 и 1700 см-1 (в центре на 1581 см-1), соответствующие Si-C облигаций и амид групп в спектре Раман MNP@SiO2@NH@Fa, в согласии с формированием конъюгации (Рисунок 6D)14.

Анализ XPS

Изучение состояния окисления атомов на поверхности было проведено с помощью анализа XPS и подтвердило образование связей в структурах. На рисунке 7 показаны XPS спектры голых и различных функциональных MNPs. Для MNP, узкий пик в C1s может быть связано с примесями в обработке образца во время синтеза. Введение углерода наблюдается как C-C и C-H облигаций в MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa спектра. Анализ пика на 399 эВ в спектре N1s вместе с его затуханием, наблюдаемым в течение MNP@SiO2@NH@Fa подтверждает формирование амидных связей между MNP@SiO2@NH2 и фероксамином. Кроме того, существование N-O связи гидроксамических moieties находится в согласии с наличием пика на 402 eV. Наличие пика на 102 eV в Si2p узкие спектры во всех промежуточных и конъюгации в согласии с обязательной энергии для силоксан группы15,16.

Потенциал

Потенциальные значения отображаются в таблице 1. Результаты отрицательные, -25,21 и -29,35 мВ, по MNP и MNP@SiO2, соответственно. Функционализация с APTES, чтобы дать MNP@SiO2@NH2 изменила поверхностный заряд с отрицательного на положительный. Этот факт был приписан аминь групп и поверхностный заряд остается положительным для MNP@SiO2@NH@Fa. Положительная поверхность потенциал может объяснить взаимодействие между бактериями (чья поверхность является отрицательным) и спряжение17,18,19.

Бактерии захвата анализа

Количество клеток Y. enterocolitica WC-A и FoxA WC-A 12-8, захваченных с MNP промежуточных и MNP@SiO2@NH@Fa были количественно в тех разбавлений, где 40'u201260 колоний были разделены и легко визуализированы. Количество захваченных клеток голыми, MNP@SiO2,и MNP@SiO2@NH2 не показывает существенных различий между ними(рисунок 8). Электростатические силы из-за свободных групп амина в MNP@SiO2@NH2 и низкая концентрация рецептора фероксамина мембраны в бактериях может оправдать отсутствие ожидаемой связывающей специфичности.

Этот протокол может быть применен в синтезе различных типов конъюгированных веществ, в основном тех, которые используют карбодиимид химии. Это достаточно универсальный, чтобы ввести модификации для того, чтобы получить лучшие результаты. Полная характеристика всех промежуточных и окончательных спряжений, используя описанные методы, позволяет следить за каждым этапом синтеза и подтверждать формирование связи желания. Подсчет колоний в бактериях захвата анализа, используя 10 МЛ падение, позволяет проверить все образцы в то же время в одной пластине, что делает легче получить репликации и выполнять анализы в различных условиях.

Figure 1
Рисунок 1: Сравнение MNP (Fe3O4) (фиолетовый) и магнетитового рисунка (черный) диффрактограмм.
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Яркое поле TEM и электронные дифракционные изображения голых MNP (A, B и C), а также MNP@SiO2@NH@Fa (D, E и F).
Изображения имеют среднее и высокое разрешение. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: EDX карты MNP@SiO2: HAADF изображения и соответствующие Fe, Si, O и C карты A. MNP@SiO2 и B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: FT-IR спектры голого оксида железа (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Термогравиметрический анализ MNP, MNP@SiO2@NH2, и MNP@SiO2@NH@Fa.
Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Раман спектра голого оксида железа (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) и MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (яп.) Другие фазы оксида железа, вероятно, формируется в результате преобразования магнетита лазерной энергии. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: УЗКИе спектры XPS MNP, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: CFU Y. enterocolitica захватили на 100 мкг магнитных наночастиц: голые, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 и MNP@SiO2@NH@Fa.
()WC-A (дикий тип) (B) FoxA WC-A 12-8 (мутант отсутствует рецептор фероксамина FoxA) и SEM изображение MNP@SiO2@NH@Fa взаимодействующих с Y. enterocolitica. Эта цифра была изменена с Мартинес-Матаморос и др.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Образец Потенциал
Mnp -25.21
MNP@SiO2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO2@NH@Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH@Fa 10.96

Таблица 1: Потенциальные измерения. Эта таблица была получена от Мартинес-Матаморос и др.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает синтез спряжения между магнитными наночастицами и бокофором фероксамином путем ковалентной связи. Синтез магнетита был проведен с использованием протокола, о которого сообщает Pinna et al.5 с последующим кремнеземным покрытием для защиты магнитного ядра коррозии в аквеи, чтобы свести к минимуму агрегацию и обеспечить подходящую поверхность для функционализации6. Был изменен процесс кремнеземного покрытия. Вместо того, чтобы проводить три покрытия, как сообщает Li et al.6,депутаты были покрыты двумя слоями кремнезема в этомметоде (Рисунок 2D),который был достаточно, чтобы продолжить с шагом функционализации с APTES7.

Дефероксамин был комплекс с железом (III), потому что он подвержен деградации в течение нескольких часов при комнатной температуре. Лучший способ получить железный комплекс – использовать ацетил ацетонат железа, потому что его очистка с помощью жидкой жидкости очень проста и фероксамин получается в количественном урожае. Фероксамин стабилен и может Nбыть изменен, чтобы дать N-succinylferoxamine с помощью succinic ангидрид, чтобы добавить терминальной кислой группы в качестве связучателя. Очистка по размеру исключения хроматографии позволяет удалить избыток сукцинического Nангидрида и сукциновой кислоты из N-succinylferoxamine.

Амин нанокомпозит был использован Nдля связи N-succinylferoxamine ковалентно на поверхности. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) не может быть использован для структурного выяснения продуктов из-за парамагнитного поведения оксида железа. По этой причине каждый шаг реакции отслеживался FT-IR, а затем подтверждался спектроскопией Романа. Пики деконволюции и фитинга были сделаны с удобным программным обеспечением, учитывая, что Спектры Романа включали десять мер 300 с общим временем измерения 3000 с. Морфология и размер измерялись ТЕМ, наблюдая за псевдосферическим магнетитом формы с однородным распределением размера 10 Нм(рисунок 2A,B). Измерение толщины конъюгированного покрытия показывает 10 нм однородного слоя(Рисунок 2D,E).

Очень трудно получить поле TEM, где наночастицы могут наблюдаться индивидуально из-за его магнитного характера и его склонности к агломерату. EDX отображение было использовано для получения информации о составе каждого элемента на поверхности(рисунок 3A). Плотность углерода была явно увеличена в конъюгированном MNP@SiO2@NHФа(Рисунок 3B) по сравнению с промежуточным MNP@SiO2.

Бактерии захвата анализ был разработан для того, чтобы проверить способность конъюгации для захвата бактерий через фероксамин наружной мембраны белка рецептора. Yersinia enterocolitica Штамм WC-A был выбран, потому что он выражает рецептор фероксамина FoxA и легко растет. Критическим шагом в этой процедуре было удаление не захваченных бактерий. Это было достигнуто путем полоскания и вихря с стерильными PBS дважды следуют восстановления бактерий конъюгированных агрегатов с помощью магнита. Количество захваченных клеток каждым из промежуточных MNP, используемых в качестве контроля, и сопряжение MNP@SiO2@NH@Fa определялись колонией, подсчитывая от метода разбавления. Использование 10 капель Л облегчает экспериментальную процедуру и позволяет обрабатывать более четырех образцов, снижающих стоимость теста с точки зрения времени и материала по сравнению с классическим методом подсчета бляшек колоний.

Наиболее важным ограничением синтеза MNP@SiO2@NH@Fa сопряжения является то, что невозможно подтвердить образование облигаций NMR. Хотя подготовка MNP@SiO2@NH@Fa представляется простой, использование методов структурной характеристики имеет решающее значение для подтверждения связи между боковым форором и MNP через ковалентную связь.

В соответствии с настоящим протоколом можно создавать конъюгации с использованием карбодиимидовой химии. Для достижения этой цели необходимо наличие аминокислот на поверхности MNPs и функции карбокцилиновой кислоты в комплексе интересов. Тестирование различных связующих и покрытие MNPs поверхности с другими функциональными группами, чтобы избежать создания положительных зарядов на нем может улучшить бактериальной дискриминации захвата.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы с благодарностью признают профессора Клауса Хантке (Университет Тюбингена, Германия) за любезное снабжение штаммов Yersinia enterocolitica, используемых в этой работе. Эта работа была поддержана грантами AGL2015-63740-C2-1/2-R и RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) от Государственного агентства по исследованиям (AEI) Испании, финансируемого программой FEDER от Европейского союза. Работа в Университете Сантьяго-де-Компостела и Университете А Корунья также была поддержана грантами GRC2018/018, GRC2018/039 и ED431E 2018/03 (стратегическая группа CICA-INIBIC) от Сюй-де-Галиции. Наконец, мы хотим поблагодарить Нурия Кальво за ее большое сотрудничество делать голос-офф этого видео-протокола.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41, (7), 2912-2942 (2012).
  2. Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
  3. Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27, (5), 637-657 (2010).
  4. Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109, (10), 4580-4595 (2010).
  5. Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17, (15), 3044-3049 (2005).
  6. Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76, (5), 484-489 (2010).
  7. Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
  8. El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129, (44), 13392-13393 (2007).
  9. Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9, (24), 13533-13542 (2019).
  10. Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788, (1-3), 1-6 (2006).
  11. Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174, (4), 424-430 (2003).
  12. González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320, (12), 92-99 (2003).
  13. Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14, (3-7), 1051-1056 (2005).
  14. You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93, (10), 103111-103113 (2008).
  15. Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603, (18), 2849-2860 (2009).
  16. Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137, (1-4), 179-183 (2002).
  17. Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
  18. Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
  19. Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
Синтез функциональных магнитных наночастиц, их спряжение с Siderophore Фероксамин и его оценка для обнаружения бактерий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).More

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter