Syntes av funktionaliserade magnetiska nanopartiklar, deras konjugation med Siderophore Feroxamine och dess utvärdering för bakterier upptäckt

Summary

Detta arbete beskriver protokoll för beredning av magnetiska nanopartiklar, dess beläggning med SiO₂, följt av dess amin funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) och dess konjugation med deferoxamin med hjälp av en succinyl moiety som en länker. En djup strukturell karakterisering beskrivning och en fånga bakterier analys med Y. enterocolitica för alla mellanliggande nanopartiklar och den slutliga konjugat beskrivs också i detalj.

Abstract

I det nuvarande arbetet, syntesen av magnetiska nanopartiklar, dess beläggning med SiO₂, följt av dess amin funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) och dess konjugation med deferoxamin, en siderophore erkänns av Yersinia enterocolitica, med hjälp av en succinyl moiety som en länkare beskrivs.

Magnetiska nanopartiklar (MNP) av magnetit (Fe₃O₄) har utarbetats med solvotermisk metod och belagda med SiO₂ (MNP@SiO₂) med stöberprocessen följt av funktionalisering med APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Sedan var feroxamin konjugerad med MNP@SiO₂@NH₂ av carbodiimide koppling för att ge MNP@SiO₂@NH₂@Fa. Konjugatens och intermediärernas morfologi och egenskaper undersöktes av åtta olika metoder, inklusive pulverröntgendiffraktion (XRD), Fourier transform infrared spektroskopi (FT-IR), Raman spektroskopi, röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS), transmissionselektronmikroskopi (TEM) och energidispersive X-Ray (EDX) kartläggning. Denna uttömmande karakterisering bekräftade bildandet av konjugat. Slutligen, för att utvärdera nanopartiklarnas kapacitet och specificitet, testades de i en analys av avskiljningsbakterier med hjälp av Yersinia enterocolitica.

Introduction

De metoder för detektion av bakterier som använder MNP baseras på molekylär igenkänning av antikroppar, aptamerer, bioprotein, kolhydrater som konjugerats till MNP av de patogena bakterierna¹. Med hänsyn till att sideroforer känns igen av specifika receptorer på bakteriernas yttre membran, kan de också kopplas till MNP för att öka deras specificitet². Siderophores är små organiska molekyler som deltar i Fe^{3 +} upptag av bakterier^3,,4. Beredningen av konjugat mellan siderophores och MNP tillsammans med deras utvärdering för fångst och isolering av bakterier har ännu inte rapporterats.

Ett av de avgörande stegen i syntesen av konjugat av magnetiska nanopartiklar med små molekyler är valet av typ av bindning eller interaktion mellan dem för att säkerställa att den lilla molekylen är fäst vid MNP:s yta. Av denna anledning var förfarandet för att förbereda konjugatet mellan magnetiska nanopartiklar och feroxamin-siderophore erkänns av Yersinia enterocolitica-fokuseradepå generering av en modifierbar yta av MNP att tillåta att koppla den kovalent till siderofor av karbodiimid kemi. För att få en enhetlig magnetit nanopartiklar (MNP) och för att förbättra kärnbildning och storlekskontroll, en solvolys reaktion med bensylalkohol bars i ett termiskt block utan skakning⁵. Därefter genererades en kiseldioxidbeläggning med Stöber-metoden för att ge skydd och förbättra stabiliteten hos nanopartiklarnas suspension i vattenhaltigt medium⁶. Med hänsyn till feroxaminens struktur är införandet av amingrupper nödvändigt för att producera lämpliga nanopartiklar (MNP@SiO₂@NH₂) som skall konjugeras med sideroforen. Detta uppnåddes genom kondensering av (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med de alkoholgrupper som finns på ytan av de kiseldioxidmodifierade nanopartiklarna (MNP@SiO₂) med hjälp av en sol-gel metod⁷.

Parallellt med detta har feroxaminjärn(III) komplexet utarbetats genom complexation av kommersiellt tillgängliga deferoxamin med järn acetylactonat i vattenlösning. N-succinylferoxamine, med succinyl grupper som kommer att fungera som länkare, erhölls genom reaktionen av feroxamin med succinic anhydride.

Konjugationen mellan MNP@SiO₂@NH₂ och N-succinylferoxamin för att ge MNP@SiO₂@NH_@Fa utfördes genom karbodiimidkemi med hjälp av som kopplingsreagenser benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimetylamino)-fosfonium hexafluorophosphate (BOP) och 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) i en mjuk basmedia för att aktivera terminalsyragruppen i N-succinylferoxamin⁸.

När MNPs karakteriserades, utvärderade vi funktionerna hos nakna och funktionella magnetiska nanopartiklar för att fånga vilda typer (WC-A) och en mutant av Y. enterocolitica saknar feroxaminreceptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Vanliga parlamentsledamöter, funktionaliserade parlamentsledamöter och konjugat MNP@SiO₂@NH_@Fa fick interagera med varje Y. enterocolitica stam. Bakteriekonjugataggregaten separerades från bakterieupphängningen genom tillämpning av ett magnetfält. De separerade aggregat sköljdes två gånger med fosfat buffrad saltlösning (PBS), åter avbrytas i PBS att förbereda seriell utspädningar och sedan var de pläterade för kolonin räkna. Detta protokoll visar varje steg i syntesen av MNP@SiO₂@NH@Fa, den strukturella karakterisering av alla intermediärer och konjugat, och en bakterie fånga analys som ett enkelt sätt att utvärdera specificitetkonjugat i förhållande till intermediärer. ^9.

Protocol

OBS: För de reaktioner som utfördes under inert atmosfär villkor, var alla glas tidigare torkas i en ugn vid 65 °C, förseglade med en gummi septum och rensas med argon tre gånger. 1. Syntes av magnetiska nanopartiklar konjugerade med feroxamin Syntes av Fe3O4 magnetiska nanopartiklar (MNPs) Tillsätt 0,5 g Fe(acac)3 i en 20 ml glasflaska och blanda sedan med 10 ml bensylalkohol. Sonicate denna blandning i 2 min, sedan överfö…

Representative Results

En uttömmande strukturell karakterisering utförs för att bestämma morfologi och egenskaperna hos varje mellanliggande och den slutliga konjugat. För detta ändamål används teknikerna XRD, FT-IR, Raman spektroskopi, TGA, TEM, EDX-kartläggning och XPS för att påvisa konjugatets bildande. Atomernas oxidationstillstånd vid ytan av de nanopartiklar som förvärvats genom röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) är de mest relevanta uppgifterna för att bekräfta bildandet av kovalenta bindningar mellan nanopartikeln…

Discussion

Detta protokoll beskriver syntesen av en konjugat mellan magnetiska nanopartiklar och siderophore feroxamin genom kovalent bindning. Syntesen av magnetit utfördes med hjälp av det protokoll som rapporterats av Pinna et al.⁵ följt av kiseldioxidbeläggning för att skydda korrosions magnetiska kärna i vattensystem, för att minimera aggregering och för att ge en lämplig yta för funktionalisering⁶. Kiseldioxidbeläggningsprocessen ändrades. Istället för att utföra …

Materials

1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578