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Cancer Research

लाइव सेल में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन को मापने के द्वारा eIF4F विधानसभा की निगरानी

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/60850
Automatic Translation
, ,
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

Summary

यहां, हम लाइव कोशिकाओं में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो उपयोगकर्ता को स्क्रीनिंग प्रारूपों में eIF4F जटिल गतिशीलता के दवा प्रेरित क्षोभ का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाएगा।

Abstract

eIF4F परिसर के गठन के लिए संकेत रास्ते है कि अक्सर मनुष्यों में ऑन्कोजेनिक सक्रियण से गुजरना के अभिसरण के लिए महत्वपूर्ण डाउनस्ट्रीम नोड दिखाया गया है । eIF4F अनुवाद दीक्षा के एमआरएनए-राइबोसोम भर्ती चरण में शामिल एक कैप-बाध्यकारी परिसर है। कैंसर के कई सेलुलर और पूर्व नैदानिक मॉडल में, eIF4F के विनियमन विशिष्ट mRNA सबसेट है कि कैंसर के प्रसार और अस्तित्व में शामिल है के अनुवाद में वृद्धि की ओर जाता है । eIF4F एक हेट्रो-ट्राइमेरिक कॉम्प्लेक्स है जो कैप-बाइंडिंग सबयूनिट eIF4E, हेलीकेस eIF4A और मचान सबयूनिट eIF4G से बनाया गया है। सक्रिय eIF4F परिसरों की विधानसभा के लिए महत्वपूर्ण eIF4E और eIF4G प्रोटीन के बीच प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत है । इस लेख में, हम eIF4F असेंबली को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो लाइव कोशिकाओं में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन की स्थिति पर नज़र रखता है। eIF4e: 4G सेल आधारित प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख भी eIF4F जटिल अखंडता में दवा प्रेरित परिवर्तन सही और मज़बूती से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है । हम कल्पना करते हैं कि इस विधि को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यौगिकों की गतिविधि को सत्यापित करने या उपन्यास यौगिकों या तौर-तरीकों की आगे की स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जा सकता है जो eIF4F परिसर के गठन को कुशलतापूर्वक बाधित करते हैं।

Introduction

जीन अभिव्यक्ति का नियंत्रण विकास प्रसार और भेदभाव जैसे सेलुलर कार्यक्रमों के सही निष्पादन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एक नियामक नियंत्रण तंत्र या तो जीन प्रतिलेखन के स्तर पर या एमआरएनए अनुवाद के स्तर पर लगाया जा सकता है। पिछले दशक में, यह तेजी से स्पष्ट हो गया है कि विस्तार और समाप्ति के बाद के चरणों के बजाय दीक्षा प्रक्रिया के मॉड्यूलेशन द्वारा अनुवादात्मक नियंत्रण प्रोटीन के विशिष्ट सबसेट के संश्लेषण को बारीकी से विनियमित कर सकता है जो जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला खेलते हैं।

अस्तित्व में शामिल mRNAs के अनुवाद में वृद्धि, विरोधी ऑटोफैजिक और विरोधी apoptotic प्रतिक्रियाओं कई कैंसर में फंसाया गया है और यह भी कारण या तो गुमराह सक्रियण या अनुवाद दीक्षा कारकों की अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है1।

eIF4F परिसर अनुवाद दीक्षा का एक मास्टर नियामक है। mRNAs के 5 ' अंत पर टोपी संरचना बाध्यकारी द्वारा, eIF4F प्रारंभिक mRNA-ribosome भर्ती चला रहा है और बदले में कमजोर अनुवादित यूकेरियोटिक mRNAs2की mRNA अनुवाद दक्षता में वृद्धि । कैंसर से संबंधित mRNAs के eIF4F मध्यस्थता अनुवाद कई कैंसर आरएएस/MAPK या AKT/TOR रास्तों के गुमराह सक्रियण शरण मॉडल के लिए सूचित किया गया है, सुझाव है कि कैंसर की कोशिकाओं eIF4F को अपने स्वयं के समर्थक नियोप्लास्टिक गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए upregulate । eIF4F जटिल गठन को बाधित करके इस फीड-फॉरवर्ड लूप को बाधित करना एक बहुत ही आशाजनक चिकित्सीय रणनीतिहै 3,4.

eIF4F परिसर में (i) eIF4E शामिल हैं, eIF4F की कैप-बाध्यकारी सबयूनिट जो एमआरएनए के 5 यूटीआर में पाए जाने वाले कैप स्ट्रक्चर के साथ इंटरैक्ट करती है, (ii) eIF4A, आरएनए हेलीकेस और (iii) eIF4G, पाड़ प्रोटीन जो eIF4A और eIF4E दोनों के साथ बातचीत करता है और जो अंततः 40S रिबसोमलुनी सबट5की भर्ती करता है। eIF4E के साथ eIF4G एसोसिएशन कार्यात्मक eIF4F परिसरों की असेंबली के लिए दर-सीमित कदम है और यह eIF4E बाध्यकारी प्रोटीन (4EBPs, सदस्यों 1, 2 और 3))6द्वारा नकारात्मक रूप से विनियमित है। एक इंटरफ़ेस के माध्यम से eIF4E के लिए बाध्यकारी eIF4G के साथ प्रतिस्पर्धा करके जिसमें विहित और गैर-विहित eIF4E बाध्यकारी दृश्य7,8,9 (मानव eIF4E पर एए 604-646 फैले क्षेत्र) शामिल हैं, 4EBP सक्रिय रूप से अनुवाद में शामिल eIF4E के पूल को कम करता है और eIF4F जटिल गठन को रोकता है। इन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का इंटरप्ले मुख्य रूप से रैपामाइसिन (mTOR) के स्तनधारी लक्ष्य द्वारा विनियमित किया जाता है- 4EBP के मध्यस्थता फॉस्फोरिलेशन। मिटोजेनिक उत्तेजनाओं पर, mTOR सीधे 4E-BP प्रोटीन परिवार के सदस्यों को फॉस्फोरलेट करता है, जो eIF4E के साथ उनके सहयोग को कम करता है और इस तरह, eIF4E-eIF4G बातचीत को बढ़ावा देने और कार्यात्मक eIF4F परिसरोंके गठन 10।

eIF4F जटिल अखंडता को लक्षित यौगिकों के विकास में महान प्रयास के बावजूद, लाइव कोशिकाओं में eIF4E-eIF4G बातचीत के प्रत्यक्ष व्यवधान को मापने के परख की कमी सेलुलर सक्रिय हिट यौगिकों के लिए खोज सीमित है । हमने eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन के माध्यम से eIF4F अखंडता की स्थिति की वास्तविक समय में निगरानी करने के लिए एक कोएलेंटेरज़ीन एनालॉग (जैसे, नैनोल्यूक-आधारित पूरकता परख) के आधार पर एक लूसिफ़ेरेस परख लागू की है। लूसिफ़ेरेस पूरक प्रोटीन प्रणाली में 18 केडीए प्रोटीन टुकड़ा (SubA) और 11 अमीनो एसिड पेप्टाइड टुकड़ा (SubB) न्यूनतम आत्म-संघ औरस्थिरता 11के लिए अनुकूलित होता है। एक बार मानव पूर्ण लंबाई eIF4E और मानव eiF4G1 (एए 604-646) से eIF4E बातचीत डोमेन के साथ एक संलयन उत्पाद के रूप में व्यक्त किया, दो बातचीत प्रोटीन एक दूसरे के करीब निकटता में SubA और SubB टुकड़ा लाएगा और सक्रिय लूसिफ़ेरेस के गठन के लिए प्रेरित करेगा कि, एक सेल प्रतिमेबल सबस्ट्रेट की उपस्थिति में, अंततः एक उज्ज्वल ल्यूमिन्ससेंट सिग्नल(चित्रा 1)उत्पन्न करेगा। हमने कहीं और eIF4E के निर्माण और सत्यापन की सूचना दी है: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली16।

यहां, हम वर्णन करते हैं कि कैसे eIF4E: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली (अनुरोध पर उपलब्ध) को लाइव कोशिकाओं में 4EBP1-मध्यस्थता eIF4E-eIF4G व्यवधान को सटीक रूप से मापने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हम कई mTOR अवरोधकों के प्रभाव को मापने के द्वारा इसकी उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं जो वर्तमान में संभावित कैंसर चिकित्सीय दवाओं के रूप में नैदानिक परीक्षणों के तहत हैं12। क्योंकि ऑफ-टारगेट प्रभाव अक्सर दवा-विशिष्ट गतिविधि को मुखौटा करते हैं, हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे eIF4E की बहुमुखी प्रतिभा: eIF4G604-646 सिस्टम माप को इन को ध्यान में रखने के लिए सेलुलर व्यवहार्यता के ऑर्थोगोनल मापों के साथ बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

HEK293 सेल लाइन प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया गया था और Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 m L-ग्लूटामाइन, और १०० यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक । कोशिकाओं को एक आर्द्र वातावरण में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किया गया था।

1. eIF4E के माध्यम से eIF4F जटिल व्यवधान का मात्रात्मक मूल्यांकन: eIF4G604-646 पूरक परख

  1. सेल संस्कृति और eIF4E के क्षणिक क्षणिक संक्रमण: eIF4G604-646 पूरक परख
    1. सभी प्रयोगों के लिए 20 से कम मार्ग के साथ हौसले से गल कोशिकाओं का प्रयोग करें। 1 दिन, एक मानक सेल काउंटर का उपयोग कर सेल संख्या निर्धारित करें और ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि13का उपयोग करके कुल व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    2. मानक विकास माध्यम के 2 मिलील में एचईके 293 कोशिकाओं के 0.9 - 1.2 x 106 के साथ बीज 6-अच्छी प्लेटें।
      नोट: ऊपर बताए गए सेल लाइनों के भीतर सबसे अच्छी ट्रांसफैक्शन दक्षता प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि प्लेटेड कोशिकाएं सीडिंग के बाद दिन में 70-90% कन्फ्यूल हैं।
    3. दूसरे दिन की सुबह, उपा-eIF4E और eIF4G604-646-SubBप्लाज्मिड के साथ सह-ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं को लिपिड-आधारित ट्रांसफैक्शन रीएजेंट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके नीचे वर्णित है।
      1. प्रत्येक ट्रांसफेक्शन के लिए और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट के लिए फेनोल लाल (सामग्री की तालिकादेखें) के बिना कम सीरम माध्यम के 125 माइक्रोन युक्त ट्यूब में लिपोसोम-आधारित समाधान के 9 माइक्रोन को पतला करें।
      2. प्रत्येक ट्रांसफेक्शन ट्यूब के लिए कम सीरम माध्यम के 125 माइक्रोन में प्रत्येक प्लाज्मिड के 3 माइक्रोग्राम को कमजोर करके डीएनए का मास्टर मिश्रण तैयार करें।
      3. डीएनए मास्टर मिक्स ट्यूब में एन्हांसर रिएजेंट्स के 12 माइक्रोन जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं और तुरंत डीएनए जोड़ें: अनुपात 1:1 में पतला लिपोसोम की प्रत्येक ट्यूब में वर्धक मास्टर मिक्स। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      4. प्रत्येक अच्छी तरह से डीएनए लिपिड परिसर जोड़ें और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. 3 दिन की सुबह, पीबीएस के 1 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला।
    5. पीबीएस और इनक्यूबेट कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं में 0.3 एमएल ट्राइप्सिन के साथ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर निकालें।
    6. प्रत्येक कुएं में 0% एफसीएस युक्त फिनॉल लाल के बिना कम सीरम माध्यम के 2 मिलील जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें और संक्रमित कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: फिनोल लाल लूसिफ़ेरेस गतिविधि में हस्तक्षेप कर सकता है; इसलिए, कोशिकाओं को इस चरण से आगे मध्यम में फिनोल लाल के बिना संभाला जाना चाहिए।
    7. 290 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें और माध्यम को एस्पिरेट करें। 0% एफसीएस युक्त फिनॉल लाल के बिना कम सीरम माध्यम के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। चरण 1.1 में वर्णित गणना करें।
    8. बीज संक्रमित HEK 96 अच्छी तरह से अपारदर्शी प्लेटों में 30,000 कोशिकाओं के घनत्व पर प्रति अच्छी तरह से 90 μL मध्यम में 0% FCS युक्त फिनोल लाल बिना। 3 विभिन्न यौगिकों के लिए एक ही प्रयोग के भीतर 3 तकनीकी प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए, किनारों पर कुओं को छोड़कर कोशिकाओं के साथ प्लेटों के बीज ६० कुओं ।
    9. संक्रमित कोशिकाओं को सीडिंग करने के तुरंत बाद, 10% DMSO यौगिक समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें (चरण 1.2 देखें)।
  2. यौगिक तैयारी
    1. 100% DMSO (v/v) में ब्याज के यौगिक को भंग करके 1 एमएमएम कंपाउंड स्टॉक समाधान तैयार करें। प्रत्येक यौगिक टिटरेशन के लिए 3 प्रतिकृति बनाने के लिए, 1 एमएम यौगिक स्टॉक समाधान के 8 माइक्रोन का उपयोग करें।
      नोट: 1 mm स्टॉक यौगिक की मात्रा का इस्तेमाल किया क्या यह जरूरत है की तुलना में अधिक है । यह यदि कोई हो तो पिपटिंग त्रुटियों को ध्यान में रखने के लिए किया जाता है।
    2. प्रत्येक टिटरेशन पॉइंट के लिए 1 एमएम स्टॉक के 4 माइक्रोन के साथ स्टॉक कंपाउंड सॉल्यूशन को 100% DMSO के 4 माइक्रोन में 2 गुना सीरियल कमजोर करें।
      नोट: एक पूर्ण यौगिक टिटरेशन के लिए, 100% DMSO में शुरुआती स्टॉक से 9 सीरियल कमजोर करने का प्रदर्शन करें। यदि कई यौगिकों का परीक्षण करने की आवश्यकता है, तो इस कदम और बाद में कमजोर पड़ने की सुविधा के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
    3. 10% DMSO (v/v) (यानी) में 10x काम समाधान के एक ४० μL तैयार करने के लिए 2 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के प्रत्येक बिंदु के लिए HPLC ग्रेड बाँझ पानी के ३६ μL जोड़ें । 100 माइक्रोन से 0.39 माइक्रोन 10% DMSO स्टॉक श्रृंखला कोशिकाओं में जोड़े जाने पर 1% डीएमएसओ में 10 माइक्रोएम से 0.039 माइक्रोन का अंतिम समाधान करेगी। उपचार नियंत्रण के लिए, एचपीएलसी ग्रेड बाँझ पानी में 10% DMSO केवल स्टॉक समाधान भी तैयार करें।
    4. 96 अच्छी तरह से अपारदर्शी प्लेट में कोशिकाओं के लिए 10x काम समाधान के 10 μL जोड़ें ताकि 100 μL की कुल मात्रा में 1% (v/v) की एक अवशिष्ट DMSO एकाग्रता के साथ इच्छित अंतिम एकाग्रता उपज और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 5% v/v वायुमंडलीय CO2.
  3. लूसिफ़ेरेस पूरकता और व्यवहार्यता परख
    1. नशीली दवाओं के 3 घंटे के बाद, कमजोर पड़ने के अभिवाख के 19 संस्करणों के साथ सब्सट्रेट की 1 मात्रा के संयोजन से ल्यूसिफ़ेरेस सब्सट्रेट रिएजेंट तैयार करना शुरू करें (निर्माता के निर्देश देखें)।
      नोट: लूसिफ़ेरेस परख व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जाता है।
    2. मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग तुरंत सब्सट्रेट रिएजेंट के 25 माइक्रोन जोड़ने के लिए करें।
    3. कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेखर पर ५० मिनट के लिए ३५० आरपीएम पर थाली हिलाएं ।
    4. प्लेट रीडर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस का आकलन करें। ऐसा करने के लिए, ल्यूमिनेसेंस पर दर्पण रीडर और 455 पर उत्सर्जन फिल्टर सेट करें। 1 एस के माप समय के साथ 6.5 मिमी की माप ऊंचाई का उपयोग करें।
    5. सेल व्यवहार्यता को गधे करने के लिए, प्लेट रीडर का उपयोग करके, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के बाद फिर से व्यवहार्यता परख रिएजेंट के 33 माइक्रोन जोड़ें और फिर फिर से ल्यूमिनेसेंस को फिर से मापें।
    6. ल्यूमिनेसेंस पर मिरर रीडर और 600 एनएम पर उत्सर्जन फिल्टर सेट करके प्लेट रीडर के साथ ल्यूमिनेसेंस का आकलन करें। 1 एस के माप समय के साथ 6.5 मिमी की माप ऊंचाई का उपयोग करें।
      नोट: निर्माता निर्देशों के अनुसार सेल लाइसिस पर एटीपी के इंट्रासेलुलर स्तर को मापकर व्यवहार्यता का आकलन किया जाता है। इस मामले में मल्टीप्लेक्सिंग संभव है क्योंकि व्यवहार्यता परख एक अलग उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक अलग लूसिफ़ेरेस का उपयोग करती है।
    7. डेटा को 4 पैरामीटर फिटिंग कर्व समीकरण में फिटिंग करके प्रत्येक यौगिक के IC50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए डेटा का उपयोग करें:
      Y = ((A-D)/(1+(x/C)^B)) + डी
      संख्यात्मक मूल्यों डी और एक वक्र फिटिंग प्रक्रिया में विवश किया जाना चाहिए:
      D = ईआईएफ 4ई: 4जी पूरक परख से अपेक्षित न्यूनतम वक्र समानता या न्यूनतम सैद्धांतिक स्तर की प्रतिक्रिया के लिए वाई-एक्सिस पर ल्यूमिनेसेंट मूल्य।
      EIF4E: 4G पूरक परख से अपेक्षित अधिकतम वक्र असिंपेटोटे या अधिकतम सैद्धांतिक स्तर की प्रतिक्रिया के लिए वाई-एक्सिस पर एक = ल्यूमिनेसेंट मूल्य।
      नोट: न्यूनतम प्रतिक्रिया के लिए मूल्य 1% DMSO (v/v) नियंत्रण उपचार से प्राप्त होता है और अधिकतम प्रतिक्रिया के लिए मूल्य एक उच्च आत्मीयता mTOR अवरोधक की अधिकतम प्रतिक्रिया से प्राप्त होता है जो कोशिका व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं डालता है।

2. सहसंबद्ध eIF4E: eIF4G604-646 परख कोशिकाओं में eIF4F जटिल व्यवधान के साथ अवरोध

  1. इस बात की पुष्टि करने के लिए कि परख द्वारा मापा जा रहा संकेत यौगिक द्वारा eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन के शारीरिक व्यवधान से मेल खाती है, बीज कोशिकाओं के रूप में चरण १.१ में वर्णित है ।
  2. दिन के बाद, कम सीरम माध्यम के 1 एमसीएल के साथ माध्यम की जगह फिनोल लाल और ब्याज के यौगिक के साथ 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट युक्त नहीं है । 1 मिलीएल की कुल मात्रा में 1% (v/v) की अवशिष्ट डीएमएसओ एकाग्रता सुनिश्चित करें।
    नोट: परिणाम के साथ आसानी से सहसंबंध की अनुमति देने के लिए, मापा पूरकता परख तीतर वक्र के शुरुआत, मिडपॉइंट और एंडपॉइंट पर यौगिक सांद्रता का उपयोग करें।
  3. Lyse कोशिकाओं और प्रदर्शन एम7GTP eIF4F और eIF4E: 4EBP1 परिसरों को अलग करने के लिए नीचे खींचो । एम7जीटीपी पुल डाउन प्रयोग करने के तरीके के बारे में विस्तृत प्रक्रियाएंकहींऔर पाई जा सकती हैं ।
  4. पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा एम7जीटीपी बाध्य eIF4G, eIF4E और 4EBP1 प्रोटीन के स्तर का पता लगाएं, और फिर पूरकता परख संकेत निषेध के साथ eIF4F जटिल व्यवधान से सहसंबंधित ।

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Representative Results

eIF4E: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली की संवेदनशीलता को मान्य करने के लिए, mTOR अवरोधकों का उपयोग करके eIF4F कॉम्प्लेक्स असेंबली के 4EBP1 मध्यस्थता अवरोध का आकलन किया गया था। 4EBP प्रोटीन परिवार के mTORC1 kinase निर्भर फॉस्फोरिलेशन को बाधित करके, mTOR अवरोध eIF4E के लिए 4EBP1 एसोसिएशन को बढ़ाता है और इसलिए, eIF4F disassembly15। mTOR kinases के यंत्रवादी रूप से अलग अवरोधक के दो वर्गों का परीक्षण किया गया: रैपलॉग (उदाहरण के लिए, Rapamycin) जो mTORC1 के एलोस्टेरिक अवरोधक हैं, लेकिन mTORC2 और एटीपी प्रतिस्पर्धी आधारित अवरोधक (जैसे, पीपी242) जो विशेष रूप से mTORC1 और mTORC2 kinase उत्प्रेरक गतिविधि दोनों को रोकता है।

HEK293 कोशिकाओं eIF4E के साथ संक्रमित थे: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली के रूप में कदम 1 में वर्णित है । 24 h ट्रांसफैक्शन के बाद, कोशिकाओं को फिर से वरीयता दी गई और mTOR अवरोधकों PP242 और रैपामाइसिन (जैसा कि चरण 1.2 में वर्णित) के साथ इलाज किया गया। उपचार के चार घंटे बाद, ल्यूमिनेसेंस का आकलन किया गया, जैसा कि पहले वर्णित है, इसके बाद सेल व्यवहार्यता। जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, PP242 0.72 ± 0.04 माइक्रोएम की गणना आईसी50 के साथ सिग्नल की खुराक पर निर्भर अवरोध पैदा करता है, जबकि 6.88 ± 0.88 माइक्रोन का एक आईसी50 रैपामाइसिन(चित्रा 2ए)के लिए प्राप्त किया जाता है। इसके बाद प्लेटों को सेलुलर फिजिबिलिटी परख(चित्रा 2डी)के लिए मल्टीप्लेक्स किया गया । इस विश्लेषण से पता चलता है कि न तो PP242 और न ही rapamycin सेल व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी पैदा करता है, साबित करना है कि eIF4E में चिकनाई में कमी: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली गैर विशिष्ट सेल मौत के कारण नहीं है बल्कि eIF4E: 4G बातचीत के व्यवधान के माध्यम से ।

एक एम7जीटीपी यौगिक सांद्रता के साथ असंक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग द्वारा किए गए प्रयोग को नीचे खींचता है जो चित्रा 2में मापा गया टिटरेशन वक्र के शुरुआत, मध्य और अंत बिंदुओं के अनुरूपहै, एक शो है कि 4EBP1-एंडोजेनस eIF4E-eIF4G बातचीत के मध्यस्थता व्यवधान मापा eIF4E: eIF4G604-646 assay(चित्रा 2B, 2C)के साथ संबंधित है । इन परिणामों के अनुरूप, PP242 को एचईसी 293 कोशिकाओं(चित्रा 3ए)में परीक्षण की गई प्रायोगिक स्थितियों के तहत रैपामाइसिन की तुलना में कुल 4EBP1 फॉस्फोरिलेशन का अधिक शक्तिशाली अवरोधक दिखाया गया है, जबकि दोनों अवरोधकों ने सामान्य रूप से एमटोर सिग्नलिंग के लिए प्रभाव दिखाया, रैपमाइसिन mTORC1 सबस्ट्रेट्स और पीपी242 दोनों mTORC1 और mTORC2(चित्रा 3B)के खिलाफ अधिक सक्रिय होने के साथ।

एक साथ लिया, इन परिणामों से पता चला है कि PP242 HEK293 कोशिकाओं में rapamycin की तुलना में eIF4F जटिल गठन को बाधित करने में अधिक प्रभावी है और आगे प्रदर्शित करता है कि eIF4E: eIF4G604-646 प्रणाली जीवित कोशिकाओं में eIF4F जटिल विधानसभा को सही ढंग से मापसकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: eIF4E: eIF4G604-646 पूरक प्रणाली। योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखा रहा है कि कैसे प्रोटीन एक्स (eIF4E) और प्रोटीन वाई (eIF4G604-646)की बातचीत SubA और SubB संलयन एक दूसरे के साथ निकटता में आने के लिए और सक्रिय लूसिफ़ेरेस का पुनर्गठन करने में सक्षम बनाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 4EBP1-eIF4F परिसर के मध्यस्थता व्यवधान । (A)PP242 और rapamycin eIF4E: eIF4G604-646 परख टाइटेशन मॉडलिंग eIF4E और eIF4G के बीच बातचीत ट्रांस संक्रमित HEK २९३ कोशिकाओं में । (B,C) पश्चिमी दाग विश्लेषण एचईके 293 अर्क में eIF4E, eIF4G और 4EBP1 के अंतर्जात स्तर को दिखाता है और m7GTP में क्रमशः PP242 या Rapamycin की विभिन्न एकाग्रता के साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं की इनक्यूबेशन के बाद नीचे खींच । (घ)एक में प्रॉपर कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया जहां कोशिका व्यवहार्यता और ल्यूमिनेसेंस के लिए मल्टीप्लेक्स का मूल्यांकन किया गया । सभी मूल्यों का प्रतिनिधित्व ± एसडी (n = 3) । इस आंकड़े को16से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 4EBP1 फॉशोरिलेशन पर mTOR अवरोध का अंतर प्रभाव। (A)गैर-संक्रमित HEK293 कोशिकाओं में 4EBP1 की फॉस्फोरिलेशन स्थिति का पश्चिमी दाग विश्लेषण PP242 और rapamycin की संकेत एकाग्रता के साथ इलाज किया । (ख)गैर-संक्रमित HEK293 कोशिकाओं में AKT और S6 फॉस्फोरिलेशन स्थिति का पश्चिमी दाग विश्लेषण या तो दोहरी MTORC1/2 सक्रिय साइट अवरोधक PP242, या mTORC1 Rapamycin के एलोस्टेरिक अवरोधक के साथ इलाज किया । बीटा ऐक्टिन लोडिंग नियंत्रण के साथ-साथ कुल 4EBP1, AKT और S6 के लिए कल्पना की गई थी। इस आंकड़े को16से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस लेख में वर्णित विधि लाइव कोशिकाओं में eIF4G-eIF4E इंटरैक्शन के प्रत्यक्ष माप के माध्यम से eIF4F परिसर असेंबली की मात्रात्मक निगरानी करने के लिए एक लूसिफ़ेरेस-आधारित पूरकता परख का उपयोग करती है। हमने eIF4E-eIF4G पूरक प्रणाली के उपयोग के लिए विवरण प्रदान किया है और हमने यह भी दिखाया है कि यह प्रणाली ईआईएफ4ईई-eIF4G इंटरैक्शन16के दवा-प्रेरित 4EBP1-मध्यस्थता वियोजन को मापने में बेहद सटीक है । इस परख के थ्रूपुट को सुविधाजनक बनाने के लिए, इस लेख में वर्णित प्रायोगिक सेटअप को 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट प्रारूप उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है।

इष्टतम परिणामों के लिए, परख करते समय दो महत्वपूर्ण चरणों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, प्रयोगों के बीच ट्रांसफैक्शन दक्षता समान रहनी चाहिए। यह कम मार्ग संख्या कोशिकाओं के उपयोग के माध्यम से सुनिश्चित किया जा सकता है, और बीज बोने के दिन कोशिकाओं को कड़ाई से गिनती करके। डीएनए ट्रांसफेक्शन किए जाने से पहले सेल कंफ्लेरेंसी का भी आकलन किया जाना चाहिए, क्योंकि अगर सेल कंफ्लेरेंसी 70-90% से कम है तो लिपिड-आधारित ट्रांसफेक्शन रीएजेंट के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करने की सिफारिश नहीं की जाती है । दूसरा, यह एक सेल व्यवहार्यता परख के साथ पूरक परख मल्टीप्लेक्स के लिए महत्वपूर्ण है । कुछ यौगिक मुख्य रूप से हानिकारक प्रभावों के माध्यम से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को कम करके लूसिफ़ेरेस सिग्नल को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, eIF4E के तुरंत बाद सेल की व्यवहार्यता को मापना महत्वपूर्ण है: eIF4G604-646 पूरकता परख ऑफ-टारगेट और गैर-विशिष्ट प्रभावों को संबोधित करने के लिए।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरफेस, eIF4E और eIF4G के बीच एक, जो हाइड्रोफोबिक फांकों से रहित हैं और अपेक्षाकृत बड़े और प्लानर हैं, आम तौर पर पारंपरिक छोटे अणु चिकित्सीय (<500 मेगावाट)17द्वारा "संयुक्त राष्ट्र-नशा" माना जाता है। इस प्रकार, उपन्यास के तौर-तरीकों के विकास में रुचि बढ़ रही है जो इस प्रकार की सतहों (जैसे, मैक्रोसाइक्लिक और पेप्टिडोमेटिक यौगिकों) के साथ कुशलतापूर्वक बातचीत करते हैं। हालांकि, इनमें से कई उपन्यास के तौर-तरीके सहज रूप से कोशिका झिल्ली को पार करने और अपने लक्ष्य को संलग्न करने में सक्षम नहीं हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, कई अनुसंधान समूह नए रासायनिक अनुकूलन और सेलुलर वितरण रणनीतियों में अनुसंधान कर रहे हैं । हम कल्पना करते हैं कि eIF4E: eIF4G604-646 लाइव सेल पीपीआई परख और अन्य समान पीपीआई व्युत्पन्न परख इन रणनीतियों को बढ़ावा देने और उन्हें मान्य करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को p53lab (BMSI, A * STAR) और जेसीओ वीआईपी ग्रांट (ए * स्टार) से कोर बजट द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom greiner bio-one 655083
Cell titer Glo 2.0 PROMEGA G9241
Envision Multilabel Reader PerkinElmer not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml Thermo Fisher Scientific 4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml Thermo Fisher Scientific 4662050
FUGENE6 PROMEGA E2692
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems PROMEGA N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11058021
Orbital shaker Eppendorf not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose Jena Bioscience AC-155S

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 159 सेलुलर बायोलॉजी eIF4F कॉम्प्लेक्स ट्रांसलेशनल कंट्रोल लूसिफ़ेरेस पूरण परख एमटीओर सिग्नलिंग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन
लाइव सेल में eIF4E-eIF4G इंटरैक्शन को मापने के द्वारा eIF4F विधानसभा की निगरानी
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Frosi, Y., Ramlan, S. R., Brown, C.… More

Frosi, Y., Ramlan, S. R., Brown, C. J. Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells. J. Vis. Exp. (159), e60850, doi:10.3791/60850 (2020).

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