Summary
Her presenterer vi en protokoll for å måle eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler som vil gjøre det mulig for brukeren å evaluere legemiddelindusert perturbasjon av eIF4F-kompleks dynamikk i screeningformater.
Abstract
Dannelse av eIF4F-komplekset har vist seg å være nøkkelen nedstrøms node for konvergens av signalveier som ofte gjennomgår onkogen aktivering hos mennesker. eIF4F er et cap-bindende kompleks involvert i mRNA-ribosomet rekrutteringsfasen av oversettelsesinitiering. I mange cellulære og prekliniske kreftmodeller fører dereguleringen av eIF4F til økt oversettelse av spesifikke mRNA-undergrupper som er involvert i kreftproliferasjon og overlevelse. eIF4F er et hetero-trimerisk kompleks bygget av den cap-bindende underenheten eIF4E, helicase eIF4A og stillasunderenheten eIF4G. Kritisk for montering av aktive eIF4F-komplekser er proteinproteininteraksjonen mellom eIF4E- og eIF4G-proteiner. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å måle eIF4F-montering som overvåker statusen til eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler. Den eIF4e:4G cellebaserte proteinproteininteraksjonsanalysen gjør det også mulig å vurdere legemiddelinduserte endringer i eIF4F-kompleks integritet nøyaktig og pålitelig. Vi ser for oss at denne metoden kan brukes til å verifisere aktiviteten til kommersielt tilgjengelige forbindelser eller for videre screening av nye forbindelser eller modaliteter som effektivt forstyrrer dannelsen av eIF4F-komplekset.
Introduction
Kontroll av genuttrykk spiller en sentral rolle i riktig utførelse av cellulære programmer som vekstproliferasjon og differensiering. En regulatorisk kontrollmekanisme kan utøves enten på nivået av gentranskripsjon eller på nivået av mRNA-oversettelse. I løpet av det siste tiåret har det blitt stadig tydeligere at translasjonskontroll ved modulering av initieringsprosessen i stedet for de senere trinnene for forlengelse og oppsigelse kan regulere syntesen av spesifikke undergrupper av proteiner som spiller et bredt spekter av biologiske funksjoner.
Økt oversettelse av mRNAer involvert i overlevelse, anti-autofagiske og anti-apoptotiske responser har blitt involvert i flere kreftformer og har også vært årsaksmessig knyttet til enten avvikende aktivering eller over uttrykk for oversettelse initieringsfaktorer1.
eIF4F-komplekset er en hovedregulator for oversettelsesstart. Ved å binde cap-strukturen på 5' enden av mRNAs, eIF4F kjører innledende mRNA-ribosome rekruttering og i sin tur øke mRNA oversettelse effektivitet av svakt oversatt eukaryotic mRNAs2. eIF4F mediert oversettelse av kreftrelaterte mRNAer er rapportert for mange kreftmodeller som har avvikende aktivering av RAS/MAPK- eller AKT/TOR-veier, noe som tyder på at kreftceller oppregulerer eIF4F for å øke sin egen pro-neoplastiske aktivitet. Forstyrrelse av denne feed-forward sløyfen ved å hemme eIF4F kompleks dannelse er dermed en svært lovende terapeutisk strategi3,4.
eIF4F-komplekset består av (i) eIF4E, cap-bindende underenhet av eIF4F som samhandler med hettestrukturen som finnes ved 5' UTR av mRNA, (ii) eIF4A, RNA-helikase og (iii) eIF4G, stillasproteinet som samhandler med både eIF4A og eIF4E og som til slutt rekrutterer 40S ribosomal subenhet5. eIF4G-tilknytning til eIF4E er det hastighetsbegrensende trinnet for montering av funksjonelle eIF4F-komplekser, og det er negativt regulert av eIF4E-bindende proteiner (4EBPer, medlem 1, 2 og 3))6. Ved å konkurrere med eIF4G-binding til eIF4E gjennom et grensesnitt som består av kanoniske og ikke-kanoniske eIF4E-bindingssekvenser7,8,9 (region som spenner over aa 604-646 på human eIF4E), reduserer 4EBP utvalget av eIF4E som er aktivt involvert i oversettelse og forhindrer eIF4F-kompleks dannelse. Samspill mellom disse proteinproteininteraksjonene er hovedsakelig regulert av pattedyrmålet for rapamycin (mTOR)-mediert fosforylering av 4EBP. Ved mitogene stimuli, mTOR direkte fosforylater medlemmene av 4E-BP proteinfamilien, reduserer deres tilknytning til eIF4E og dermed fremmer eIF4E-eIF4G interaksjon og dannelse av funksjonelle eIF4F komplekser10.
Til tross for den store innsatsen i å utvikle forbindelser rettet mot eIF4F kompleks integritet, har mangelen på analyser som måler direkte forstyrrelse av eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler begrenset søket etter cellulære aktive treffforbindelser. Vi har brukt en luciferaseanalyse basert på en coelenterazin-analog (f.eks. Nanoluc-basert komplementasjonsanalyse) for å overvåke statusen til eIF4F-integriteten i sanntid gjennom eIF4E-eIF4G-interaksjonen. Luciferase komplementering protein system består av en 18 kDa protein fragment (SubA) og 11 aminosyre peptid fragment (SubB) optimalisert for minimal selv-assosiasjon og stabilitet11. Når det uttrykkes som et fusjonsprodukt med eIF4E i full lengde og eIF4E-interaksjonsdomenet fra humant eiF4G1 (aa 604-646), vil de to interagerende proteinene bringe SubA- og SubB-fragmentet i nærheten av hverandre og vil indusere dannelsen av den aktive luciferase som i nærvær av et cellegjennomtrengelig substrat til slutt vil generere et sterkt lysende signal (Figur 1). Vi har rapportert andre steder bygging og validering av eIF4E: eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Her beskriver vi hvordan eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonssystem (tilgjengelig på forespørsel) kan brukes til å måle nøyaktig 4EBP1-mediert eIF4E-eIF4G-forstyrrelse i levende celler. I tillegg demonstrerer vi nytten ved å måle effekten av flere mTOR-hemmere som for tiden er under kliniske studier som potensielle kreftterapeutiske legemidler12. Fordi off-target effekter ofte maskerer narkotikaspesifikk aktivitet, beskriver vi også hvordan allsidigheten til eIF4E:eIF4G604-646 systemmåling kan utvides med ortogonale målinger av cellulær levedyktighet for å ta hensyn til disse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HEK293 cellelinje ble brukt til protokollen og ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium supplert med 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin / streptomycin. Celler ble dyrket ved 37 °C med 5 % CO2 i et fuktig miljø.
1. Kvantitativ vurdering av eIF4F-komplekse forstyrrelser via eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonsanalyse
- Cellekultur og forbigående transfeksjon av eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonsanalyse
- Bruk nytinte celler med mindre enn 20 passasjer for alle eksperimenter. På dag 1 bestemmer du cellenummeret ved hjelp av en standard celleteller og teller de totale levedyktige cellene ved hjelp av den blå Utelukkelsesmetoden Trypan13.
- Frø 6-brønnsplater med 0,9 - 1,2 x 106 hek 293 celler per brønn i 2 ml standard vekstmedium.
MERK: For å oppnå den beste transfeksjonseffektiviteten i cellelinjene som er angitt ovenfor, må du sørge for at de belagte cellene er 70-90% sammenfallende dagen etter sådd. - På morgenen på dag 2, co-transfektceller med SubA-eIF4E og eIF4G604-646-SubB plasmid ved hjelp av en lipidbasert transfeksjon reagens (se Tabell over materialer) som beskrevet nedenfor.
- Fortynn 9 μL liposombasert oppløsning i et rør som inneholder 125 μL redusert serummedium uten fenolrød (se Materialtabell) for hver transfeksjon og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Forbered masterblanding av DNA ved å fortynne 3 μg av hver plasmid i 125 μL redusert serummedium for hvert transfeksjonsrør.
- Tilsett 12 μL forsterkerreagenser til DNA master mix tube, bland godt og legg umiddelbart til DNA: enhancer master mix til hvert rør med fortynnede liposomer i forholdet 1:1. Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Tilsett DNA-lipidkomplekset til hver brønn og inkuber cellene i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 i 24 timer.
- På morgenen på dag 3, skyll hver brønn med 1 ml PBS.
- Fjern PBS og inkuber celler i hver brønn med 0,3 ml trypsin i 5 min ved 37 °C.
- Nøytraliser trypsin ved å tilsette 2 ml av det reduserte serummediet uten fenolrød som inneholder 0% FCS i hver brønn og overfør transfiserte celler til et 15 ml rør.
MERK: Fenolrød kan forstyrre luciferaseaktiviteten; Derfor må celler håndteres fra dette trinnet og fremover i medium uten fenolrød. - Spinn ned celler i 5 min ved 290 x g og aspirer mediet. Resuspend cellene i 2 ml av redusert serum medium uten fenol rød inneholder 0% FCS. Tell som beskrevet i trinn 1.1.
- Frø transfekterte HEK 293 celler i 96 brønn ugjennomsiktige plater med en tetthet på 30.000 celler per brønn i 90 μL medium uten fenolrød som inneholder 0% FCS. For å oppnå 3 tekniske repliker i samme eksperiment for 3 forskjellige forbindelser, frø 60 brønner av platene med celler unntatt brønnene på kantene.
- Umiddelbart etter sådd av de transfekterte cellene, tilsett 10 μL 10% DMSO sammensatt løsning (se trinn 1.2).
- Sammensatt forberedelse
- Forbered 1 mM sammensatte lagerløsninger ved å oppløse forbindelsen av interesse i 100% DMSO (v / v). For å ha 3 repliker for hver sammensatt titrering, bruk 8 μL av 1 mM sammensatt lagerløsning.
MERK: Volumet på 1 mM lagerforbindelse som brukes er mer enn det som trengs. Dette gjøres for å ta hensyn til pipetteringsfeil hvis noen. - Utfør en 2 ganger seriell fortynning av lagersammensetningsløsningen med 4 μL av 1 mM-lageret i 4 μL 100% DMSO for hvert titreringspunkt.
MERK: For en fullstendig sammensatt titrering, utfør 9 serielle fortynninger fra startlageret i 100% DMSO. Hvis flere forbindelser må testes, bruk en 96 brønnplate og en flerkanals pipette for å lette dette trinnet og etterfølgende fortynninger. - Tilsett 36 μL sterilt vann av HPLC-klasse for hvert punkt i den 2 ganger serielle fortynning for å forberede en 40 μL 10x arbeidsløsninger i 10% DMSO (v / v) (dvs. 100 μM til 0,39 μM 10% DMSO lagerserie vil føre til en endelig løsning på 10 μM til 0,039 μM, i 1% DMSO når den legges til celler). Når det gjelder behandlingskontroll, må du også tilberede en 10 % DMSO eneste lagerløsning i sterilt hplc-klasse vann.
- Tilsett 10 μL 10x arbeidsløsninger til cellene i den 96 brønn ugjennomsiktige platen for å gi den tiltenkte endelige konsentrasjonen med en gjenværende DMSO-konsentrasjon på 1% (v / v) i et totalt volum på 100 μL og inkubere i 3 timer ved 37 ° C med 5% v / v atmosfærisk CO2.
- Forbered 1 mM sammensatte lagerløsninger ved å oppløse forbindelsen av interesse i 100% DMSO (v / v). For å ha 3 repliker for hver sammensatt titrering, bruk 8 μL av 1 mM sammensatt lagerløsning.
- Luciferase komplementering og levedyktighetsanalyse
- Etter 3 timers medikamentering, begynn å forberede luciferase substratreagenset ved å kombinere 1 volum substrat med 19 volumer av fortynningsreagenset (se produsentens instruksjoner).
MERK: Luciferase-analysen utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialliste). - Bruk en flerkanals pipette for umiddelbart å tilsette 25 μL substratreagens.
- Rist platen ved 350 o/min i 50 min på en orbital shaker ved romtemperatur.
- Vurder luminescens ved hjelp av en plateleser. For å gjøre dette, sett speilleseren på luminescens og utslippsfilteret på 455. Bruk en målehøyde på 6,5 mm med en måletid på 1 s.
- For å asses celle levedyktighet, tilsett 33 μL levedyktighet analyse reagens og deretter måle luminescens igjen etter 15 min ved romtemperatur, ved hjelp av plateleseren.
- Vurder luminescens med plateleseren ved å sette speilleseren på Luminescence og utslippsfilteret på 600 nm. Bruk en målehøyde på 6,5 mm med en måletid på 1 s.
MERK: Levedyktigheten vurderes ved å måle det intracellulære nivået av ATP på cellelys i henhold til produsentens instruksjoner. Multipleksing er mulig i dette tilfellet siden levedyktighetsanalysen bruker en annen luciferase med en annen utslippsbølgelengde. - Bruk dataene til å bestemme IC50-verdiene for hver forbindelse ved å tilpasse dataene til en 4-parametertilpasningskurveformel:
Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D
De numeriske verdiene D og A må begrenses i kurvetilpasningsprosessen:
D = lysende verdi på Y-aksen for minimal kurveasymptot eller minimalt teoretisk responsnivå som forventes fra eIF4E:4G-komplementasjonsanalysen.
A = lysende verdi på Y-aksen for maksimal kurveasymptot eller maksimal teoretisk nivårespons som forventes fra eIF4E:4G-komplementasjonsanalysen.
MERK: Verdien for minimal respons er avledet fra 1% DMSO (v / v) kontrollbehandling og verdien for maksimal respons er avledet fra maksimal respons av en høy affinitet mTOR-hemmer som har platået uten effekt på celle levedyktighet.
- Etter 3 timers medikamentering, begynn å forberede luciferase substratreagenset ved å kombinere 1 volum substrat med 19 volumer av fortynningsreagenset (se produsentens instruksjoner).
2. Korrelere eIF4E:eIF4G604-646 analysehemming med eIF4F komplekse forstyrrelser i celler
- For å bekrefte at signalet som måles av analysen tilsvarer den fysiske forstyrrelsen av eIF4E-eIF4G-interaksjon ved forbindelsen, frøceller som beskrevet i trinn 1.1.
- Dagen etter, erstatt mediet med 1 ml redusert serummedium som ikke inneholder fenolrød og inkuberer i 4 timer med interesseforbindelsen. Sørg for gjenværende DMSO-konsentrasjon på 1 % (v/v) i et totalt volum på 1 ml.
MERK: For å enkelt tillate en korrelasjon med resultatet, bruk sammensatte konsentrasjoner i begynnelsen, midtpunktet og endepunktet til den målte komplementeringsanalysetitreringskurven. - Lyse celler og utført m7GTP trekke ned for å isolere eIF4F og eIF4E:4EBP1 komplekser. Detaljerte prosedyrer for hvordan du utfører m7GTP-nedtrekkseksperimentet finner du andre steder14.
- Oppdag m7GTP bundet eIF4G, eIF4E og 4EBP1 proteinnivåer ved vestlig blot analyse, og korreler deretter med eIF4F komplekse forstyrrelser med komplementasjon analyse signalinhibering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å validere følsomheten til eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonssystem ble 4EBP1 mediert hemming av eIF4F kompleks montering vurdert ved hjelp av mTOR-hemmere. Ved å hemme mTORC1 kinase avhengig fosforylering av 4EBP proteinfamilien, forbedrer mTOR-hemming 4EBP1-tilknytning til eIF4E og derfor eIF4F demontering15. To klasser av mekanistisk forskjellige hemmere av mTOR kinases ble testet: rapaloger (f.eks. Rapamycin) som er allosteriske hemmere av mTORC1, men ikke mTORC2 og ATP konkurransebaserte inhibitorer (f.eks. PP242) som er designet for å spesifikt hemme både mTORC1 og mTORC2 kinase katalytisk aktivitet.
HEK293-celler ble transfektert med eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem som beskrevet i trinn 1. Etter 24 timers transfeksjon ble cellene re-sådd og behandlet med mTOR-hemmerne PP242 og rapamycin (som beskrevet i trinn 1.2). Fire timer etter behandlingen ble luminescens vurdert, som beskrevet tidligere, etterfulgt av celle levedyktighet. Som vist i figur 2produserer PP242 en doseavhengig hemming av signalet med en beregnet IC50 på 0,72 ± 0,04 μM, mens en IC50 på 6,88 ± 0,88 μM er avledet for rapamycin (figur 2A). Platene ble deretter multiplekset for cellulær levedyktighetsanalyse (figur 2D). Denne analysen viser at verken PP242 eller rapamycin gir en betydelig reduksjon i celle levedyktighet, noe som viser at nedgangen i luminescens i eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem ikke skyldes ikke-spesifikk celledød, men snarere gjennom forstyrrelse av eIF4E:4G-interaksjonen.
En m7GTP trekke ned eksperiment utført ved å inkubere utransfected celler med sammensatte konsentrasjoner som tilsvarer begynnelsen, midt- og sluttpunktene i den målte titreringskurven i figur 2A viser at 4EBP1-mediert forstyrrelse av endogen eIF4E-eIF4G-interaksjon korrelerer med det målte eIF4E:eIF4G604-646 analysesignalet (Figur 2B, 2C). I samsvar med disse resultatene, PP242 er vist å være en mer potent hemmer av totalt 4EBP1 fosforylering enn rapamycin under eksperimentelle forhold testet i HEK 293 celler ( Figur3A), mens begge inhibitors viste en innvirkning på mTOR signalering normalt, med rapamycin være mer aktiv mot mTORC1 substrater og PP242 målretting både mTORC1 og mTORC2 (Figur B3
Samlet sett viste disse resultatene at PP242 er mer effektiv i å forstyrre eIF4F-kompleks dannelse enn rapamycin i HEK293-celler og videre demonstrere at eIF4E:eIF4G604-646-systemet nøyaktig kan måle eIF4F-kompleks montering i levende celler.
Figur 1: eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem. Skjematisk representasjon som viser hvordan samspillet mellom protein X (eIF4E) og protein Y (eIF4G604-646) gjør det mulig for SubA- og SubB-fusjoner å komme i nærheten av hverandre og rekonstituere den aktive luciferase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: 4EBP1-mediert forstyrrelse av eIF4F-komplekset. (A) PP242 og rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 analysetitrering som modellerer samspillet mellom eIF4E og eIF4G i transfekterte HEK 293-celler. (B,C) Vestlig flekkanalyse som viser endogent nivå av eIF4E, eIF4G og 4EBP1 i HEK 293 ekstrakter og i m7GTP trekker ned etter inkubasjon av dyrkede celler med forskjellig konsentrasjon av henholdsvis PP242 eller Rapamycin. (D) Behandlede celler i A der multipleksed for celle levedyktighet og luminescens vurdert. Alle verdier representerer middelverdi ± SD (n=3). Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Differensialeffekt av mTOR-hemming på 4EBP1 fosforylering. (A) Vestlig flekkanalyse av fosforyleringsstatus på 4EBP1 i ikke-transfekerte HEK293-celler behandlet med indikert konsentrasjon av PP242 og rapamycin. (B) Vestlig flekkanalyse av AKT og S6 fosforyleringsstatus i ikke-transfekerte HEK293-celler behandlet med enten de doble MTORC1/2 aktive stedshemmerne PP242, eller den allosteriske hemmeren av mTORC1 Rapamycin. Beta actin ble visualisert for lastekontroll samt total 4EBP1, AKT og S6. Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet i denne artikkelen bruker en luciferase-basert komplementeringsanalyse for kvantitativt å overvåke eIF4F kompleks montering gjennom direkte måling av eIF4G-eIF4E interaksjon i levende celler. Vi har gitt detaljer for bruk av eIF4E-eIF4G komplementeringssystem, og vi har også vist at systemet er ekstremt nøyaktig i måling av legemiddelindusert 4EBP1-mediert dissosiasjon av eIF4E-eIF4G interaksjon16. For å lette gjennomstrømningen av denne analysen, er det eksperimentelle oppsettet beskrevet i denne artikkelen designet for bruk av 96 brønnmikroplateformat.
For optimale resultater bør to kritiske trinn vurderes når du utfører analysen. For det første bør transfeksjonseffektiviteten mellom eksperimenter forbli lik. Dette kan sikres ved bruk av celler med lavt passasjenummer, og ved å telle celler grundig på sådddagen. Cellesammenstrømning bør også vurderes før DNA-transfeksjon utføres, da det ikke anbefales å transfekte celler med lipidbasert transfeksjonsreagens hvis cellesammenløpet er mindre enn 70-90%. For det andre er det viktig å multipleks komplementeringsanalysen med en celle levedyktighetsanalyse. Noen forbindelser kan påvirke luciferasesignalet først og fremst ved å redusere antall levedyktige celler gjennom skadelige effekter. Det er derfor viktig å måle levedyktigheten til cellen umiddelbart etter eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalyse for å håndtere off-target og ikke-spesifikke effekter.
Proteinproteingrensesnitt, slik som den mellom eIF4E og eIF4G, som er blottet for hydrofobe kløfter og er relativt store og planare, anses generelt å være "un-druggable" av konvensjonelle små molekylterapeutiske (<500 MW)17. Dermed er det en økende interesse for utvikling av nye modaliteter som effektivt samhandler med denne typen overflater (f.eks. makrosykliske og peptidomimetiske forbindelser). Imidlertid er mange av disse nye modalitetene ikke medfødt i stand til å krysse cellemembranen og engasjere sitt mål. For å omgå disse problemstillingene forsker mange forskningsgrupper på nye kjemiske optimaliserings- og cellulære leveringsstrategier. Vi ser for oss at eIF4E:eIF4G604-646 live celle PPI-analyse og andre lignende PPI-avledede analyser vil spille en sentral rolle i å fremme disse strategiene og validere dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av kjernebudsjettet fra p53lab (BMSI, A *STAR) og JCO VIP grant (A *STAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
References
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819 (2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
