Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.
Abstract
A formação do complexo eIF4F tem se mostrado o nó fundamental a jusante para a convergência de vias de sinalização que muitas vezes sofrem ativação oncogênica em humanos. O eIF4F é um complexo de vinculação de tampas envolvido na fase de recrutamento mRNA-ribossomo de iniciação de tradução. Em muitos modelos celulares e pré-clínicos de cânceres, a desregulamentação do eIF4F leva ao aumento da tradução de subconjuntos específicos de mRNA que estão envolvidos na proliferação e sobrevivência do câncer. eIF4F é um complexo hetero-trimérico construído a partir da subunidade de ligação de tampa eIF4E, do eIF4A helicase e da subunidade de andaimes eIF4G. Fundamental para a montagem de complexos eIF4F ativos é a interação proteína-proteína entre proteínas eIF4E e eIF4G. Neste artigo, descrevemos um protocolo para medir o conjunto eIF4F que monitora o status da interação eIF4E-eIF4G em células vivas. O ensaio de interação proteína-proteína baseado em células eIF4e:4G também permite que as alterações induzidas por medicamentos na integridade complexa eIF4F sejam avaliadas com precisão e confiabilidade. Prevemos que este método possa ser aplicado para verificar a atividade de compostos disponíveis comercialmente ou para uma triagem adicional de novos compostos ou modalidades que interrompam eficientemente a formação do complexo eIF4F.
Introduction
O controle da expressão genética desempenha um papel fundamental na correta execução de programas celulares, como a proliferação do crescimento e a diferenciação. Um mecanismo de controle regulatório pode ser exercido tanto no nível da transcrição genética quanto no nível da tradução mRNA. Na última década, tornou-se cada vez mais evidente que o controle translacional pela modulação do processo de iniciação em vez das etapas posteriores de alongamento e término pode regular finamente a síntese de subconjuntos específicos de proteínas que desempenham uma ampla gama de funções biológicas.
O aumento da tradução das mRNAs envolvidas na sobrevivência, respostas anti-autofágicas e anti-apoptóticas foram implicadas em vários cânceres e também foram causadores mente ligadas à ativação aberrante ou à expressão dos fatores de iniciação da tradução1.
O complexo eIF4F é um regulador mestre da iniciação da tradução. Ao vincular a estrutura da tampa no final de 5' dos mRNAs, o eIF4F está impulsionando o recrutamento inicial mRNA-ribossomo e, por sua vez, aumentando a eficiência de tradução mRNA de mRNAs eucarióticas mal traduzidas2. A tradução mediada eIF4F de mRNAs relacionadas ao câncer tem sido relatada para muitos modelos de câncer que abrigam ativação aberrante de vias RAS/MAPK ou AKT/TOR, sugerindo que as células cancerígenas reregulam o eIF4F para impulsionar sua própria atividade pró-neoplásica. A interrupção deste loop de avanço alimentar inibindo a formação complexa eIF4F é, portanto, uma estratégia terapêutica muito promissora3,4.
O complexo eIF4F consiste em (i) eIF4E, a subunidade de ligação de tampa do eIF4F que interage com a estrutura da tampa encontrada no UTR de 5' de mRNA, (ii) eIF4A, o RNA helicase e (iii) eIF4G, a proteína do andaime que interage com o eIF4A e o eIF4E e que eventualmente recruta a subunidade ribossômica 40S5. a associação eIF4G com o eIF4E é o passo limitante de taxas para a montagem de complexos funcionais eIF4F e é regulada negativamente pelas proteínas de ligação eIF4E (4EBPs, membros 1, 2 e 3))6. Competindo com a vinculação eIF4G ao eIF4E através de uma interface que consiste em sequências de ligação eIF4E canônicas e canônicas7,8,9 (região que abrange aa 604-646 em eIF4E humano), o 4EBP reduz o pool de eIF4E ativamente envolvido na tradução e prevenção da formação do complexo eIF4F. A interação entre proteínas e proteínas é regulada principalmente pelo alvo mamífero da fosforilação mediada pela rapamicina (mTOR) de 4EBP. Após estímulos mitogênicos, o mTOR fosforila diretamente os membros da família de proteínas 4E-BP, diminuindo sua associação com o eIF4E e, assim, promovendo a interação eIF4E-eIF4G e a formação de complexos funcionais eIF4F10.
Apesar do grande esforço no desenvolvimento de compostos voltados para a integridade complexa eIF4F, a falta de ensaios que medem a interrupção direta da interação eIF4E-eIF4G em células vivas limitou a busca por compostos ativos celulares. Aplicamos um ensaio de luciferase baseado em um analógico coelenterazina (por exemplo, ensaio de complementação baseado em nanoluc) para monitorar em tempo real o status da integridade eIF4F através da interação eIF4E-eIF4G. O sistema de proteína de complementação da luciferase consiste em um fragmento de proteína de 18 kDa (SubA) e 11 fragmentos de peptídeos de aminoácidos (SubB) otimizados para auto-associação mínima e estabilidade11. Uma vez expressos como um produto de fusão com o eIF4E de comprimento total humano e o domínio de interação eIF4E do eiF4G1 humano (aa 604-646), as duas proteínas interativas trarão o fragmento SubA e SubB para uma proximidade entre si e induzirão a formação da luciferase ativa que, na presença de um substrato permeável celular, eventualmente gerará um sinal luminoso brilhante (Figura 1). Reportamos em outros lugares a construção e validação do sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 16.
Aqui, descrevemos como o sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 (disponível mediante solicitação) pode ser aplicado para medir com precisão a interrupção eIF4E-eIF4G mediada em células vivas. Além disso, demonstramos sua utilidade medindo os efeitos de vários inibidores de mTOR que estão atualmente sob testes clínicos como potenciais medicamentos terapêuticos de câncer12. Como os efeitos fora do alvo muitas vezes mascaram atividade específica de drogas, também descrevemos como a versatilidade da medição do sistema eIF4E:eIF4G604-646 pode ser estendida com medições ortogonais de viabilidade celular para levar isso em conta.
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Protocol
A linha celular HEK293 foi utilizada para o protocolo e foi cultivada no Medium De Águia Modificada de Dulbecco, suplementada com soro bovino fetal de 10%, 2 mM L-glutamina e 100 penicilina/estreptomicina U/mL. As células foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2 em um ambiente umidificado.
1. Avaliação quantitativa da interrupção do complexo eIF4F via ensaio de complementação eIF4E:eIF4G604-646
- Ensaio de complementação de cultura celular e transfecção transitória de eIF4E:eIF4G604-646 ensaio de complementação
- Use células recém-descongeladas com menos de 20 passagens para todos os experimentos. No primeiro dia, determine o número de célula usando um contador de células padrão e conte as células viáveis totais usando o método de exclusão azul Trypan13.
- Sementes 6-bem placas com 0.9 - 1.2 x 106 de células HEK 293 por poço em 2 mL de meio de crescimento padrão.
NOTA: Para alcançar a melhor eficiência de transfecção dentro das linhas celulares indicadas acima, certifique-se de que as células banhadas estejam 70-90% confluentes no dia seguinte à semeadura. - Na manhã do dia 2, células co-transfeito com SubA-eIF4E e eIF4G604-646-Plasmid SubB usando um reagente de transfecção à base de lipídio (ver Tabela de Materiais) conforme descrito abaixo.
- Diluir 9 μL de solução à base de lipossom em um tubo contendo 125 μL de meio soro reduzido sem vermelho fenol (ver Tabela de Materiais) para cada transfecção e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
- Prepare a mistura mestre do DNA diluindo 3 μg de cada plasmídeo em 125 μL de meio sérico reduzido para cada tubo de transfecção.
- Adicione 12 μL de reagentes de melhorador ao tubo de mistura mestre de DNA, misture bem e adicione imediatamente o DNA: melhore a mistura mestre de um tubo de lipossomos diluídos em uma proporção 1:1. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Adicione o complexo DNA-lipídide a cada poço e incuba as células em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2 por 24 h.
- Na manhã do dia 3, enxágue cada poço com 1 mL de PBS.
- Remova o PBS e incuba as células em cada poço com 0,3 mL de trippsina por 5 min a 37 °C.
- Neutralizar a trippsina adicionando 2 mL do meio de soro reduzido sem vermelho fenol contendo 0% de FCS em cada poço e transfira células transfeminadas em um tubo de 15 mL.
NOTA: O vermelho fenol pode interferir na atividade da luciferase; portanto, as células devem ser manuseadas a partir desta etapa em meio sem vermelho fenol. - Gire as células por 5 min a 290 x g e aspire o meio. Resuspend as células em 2 mL do meio sérico reduzido sem vermelho fenol contendo 0% de FCS. Conte como descrito na etapa 1.1.
- Sementes transfeinou células HEK 293 em 96 placas bem opacas a uma densidade de 30.000 células por poço em 90 μL de médio sem vermelho fenol contendo 0% de FCS. Para obter 3 réplicas técnicas dentro do mesmo experimento para 3 compostos diferentes, semente 60 poços das placas com células excluindo os poços nas bordas.
- Imediatamente após a semeadura das células transfeinadas, adicione 10 μL de solução composta DMSO de 10% (ver passo 1.2).
- Preparação composta
- Prepare soluções de estoque composto de 1 mM dissolvendo o composto de juros em DMSO 100% (v/v). Para ter 3 réplicas para cada titulação composta, use 8 μL da solução de estoque composto de 1 mM.
NOTA: O volume do composto de estoque de 1 mM utilizado é mais do que o necessário. Isso é feito para levar em conta os erros de pipetação, se houver. - Realize uma diluição serial de 2 vezes da solução composta de estoque com 4 μL do estoque de 1 mM em 4 μL de 100% DMSO para cada ponto de titulação.
NOTA: Para uma titulação composta completa, realize 9 diluições seriais do estoque inicial em 100% DMSO. Se vários compostos precisarem ser testados, use uma placa de 96 poços e uma pipeta multicanal para facilitar esta etapa e diluições subsequentes. - Adicione 36 μL de água estéril de grau HPLC para cada ponto da diluição serial de 2 vezes para preparar um 40 μL de soluções de trabalho de 10x em 10% DMSO (v/v) (ou seja. 100 μM a 0,39 μM série de ações DMSO 10% levará a uma solução final de 10 μM a 0,039 μM, em 1% DMSO quando adicionado às células). Quanto ao controle de tratamento, também prepare uma solução de estoque 10% DMSO somente em água estéril de grau HPLC.
- Adicione 10 μL de soluções de trabalho de 10x às células na placa 96 bem opaca, a fim de produzir a concentração final pretendida com uma concentração de DMSO residual de 1% (v/v) em um volume total de 100 μL e incubar por 3h a 37 °C com 5% v/v de CO atmosférico2.
- Prepare soluções de estoque composto de 1 mM dissolvendo o composto de juros em DMSO 100% (v/v). Para ter 3 réplicas para cada titulação composta, use 8 μL da solução de estoque composto de 1 mM.
- Ensaio de complementação e viabilidade da luciferase
- Após 3h de drogagem, comece a preparar o reagente do substrato de luciferase combinando 1 volume de substrato com 19 volumes do reagente de diluição (veja as instruções do fabricante).
NOTA: O ensaio de luciferase é realizado utilizando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). - Use uma pipeta multicanal para adicionar imediatamente 25 μL de reagente de substrato.
- Agite a placa a 350 rpm por 50 min em um agitador orbital à temperatura ambiente.
- Avalie a luminescência usando um leitor de placas. Para isso, coloque o leitor de espelhos em luminescência e o filtro de emissão em 455. Use uma altura de medição de 6,5 mm com um tempo de medição de 1 s.
- Para avaliar a viabilidade celular, adicione 33 μL de reagente de ensaio de viabilidade e, em seguida, remendo a luminescência novamente após 15 minutos à temperatura ambiente, usando o leitor de placas.
- Avalie a luminescência com o leitor de placas definindo o leitor de espelhos na Luminescência e o filtro de emissão em 600 nm. Use uma altura de medição de 6,5 mm com um tempo de medição de 1 s.
NOTA: A viabilidade é avaliada medindo o nível intracelular de ATP sobre a lise celular de acordo com as instruções do fabricante. Multiplexing é possível neste caso, uma vez que o ensaio de viabilidade usa uma luciferase diferente com um comprimento de onda de emissão diferente. - Use os dados para determinar os valores IC50 de cada composto por curva encaixando os dados em uma equação de curva de ajuste de 4 parâmetros:
Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B)) + D
Os valores numéricos D e A devem ser restringidos no processo de montagem da curva:
D = valor luminescente no eixo Y para assíntototo de curva mínima ou nível teórico mínimo de resposta esperado do ensaio de complementação eIF4E:4G.
A = valor luminescente no eixo Y para assíntotototo de curva máxima ou resposta de nível teórico máximo esperada do ensaio de complementação eIF4E:4G.
NOTA: O valor para a resposta mínima é derivado do tratamento de controle DMSO (v/v) de 1% e o valor para a resposta máxima é derivado da resposta máxima de um inibidor mTOR de alta afinidade que tem nivelado sem efeito sobre a viabilidade celular.
- Após 3h de drogagem, comece a preparar o reagente do substrato de luciferase combinando 1 volume de substrato com 19 volumes do reagente de diluição (veja as instruções do fabricante).
2. Correlacionando eIF4E:eIF4G604-646 ensaio inibição com interrupção complexa eIF4F em células
- Para confirmar que o sinal que está sendo medido pelo ensaio corresponde à interrupção física da interação eIF4E-eIF4G pelo composto, células de sementes como descrito na etapa 1.1.
- No dia seguinte, substitua o meio por 1 mL de meio de soro reduzido não contendo fenol vermelho e incubar por 4h com o composto de juros. Assegurar concentração de DMSO residual de 1% (v/v) em um volume total de 1 mL.
NOTA: Para permitir facilmente uma correlação com o resultado, utilize concentrações compostas no início, ponto médio e ponto final da curva de titulação do ensaio de complementação medido. - As células lyse e realizaram m7GTP puxar para baixo para isolar os complexos eIF4F e eIF4E:4EBP1. Procedimentos detalhados sobre como realizar o experimento de retirada m7GTP podem ser encontrados em outros lugares14.
- Detecte os níveis de proteína eIF4G, eIF4E e 4EBP1 vinculados a m7GTP por análise de manchas ocidentais e, em seguida, correlacionar-se com a interrupção do complexo eIF4F com a inibição do sinal de ensaio de complementação.
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Representative Results
Para validar a sensibilidade do sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646, a inibição mediada de 4EBP1 do conjunto complexo eIF4F foi avaliada por meio de inibidores mTOR. Ao inibir a fosforilação dependente mTORC1 quinase da família de proteínas 4EBP, a inibição do mTOR aumenta a associação 4EBP1 para eIF4E e, portanto, a desmontagem eIF4F15. Duas classes de inibidores mecanicamente diferentes de quinases mTOR foram testadas: rapalogs (por exemplo, Rapamicina) que são inibidores aostêmicos de mTORC1, mas não inibidores de base competitiva de MTORC2 e ATP (por exemplo, PP242) que são projetados para inibir especificamente tanto a atividade catraca mTORC1 quanto a atividade catáltica mTORC2.
As células HEK293 foram transfeinadas com o sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646, conforme descrito na etapa 1. Após 24h de transfecção, as células foram re-semeadas e tratadas com os inibidores mTOR PP242 e rapamicina (conforme descrito na etapa 1.2). Quatro horas após o tratamento, a luminescência foi avaliada, como descrito anteriormente, seguida pela viabilidade celular. Como mostrado na Figura 2, PP242 produz uma inibição dependente de dose do sinal com IC50 calculado de 0,72 ± 0,04 μM, enquanto um IC50 de 6,88 ± 0,88 μM é derivado para rapamicina (Figura 2A). As placas foram então multiplexadas para o ensaio de viabilidade celular(Figura 2D). Esta análise mostra que nem o PP242 nem a rapamicina produzem uma diminuição significativa da viabilidade celular, provando que a diminuição da luminescência no sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 não se deve à morte celular inespecífica, mas sim à interrupção da interação eIF4E:4G.
Um experimento m7GTP puxado para baixo realizado incubando células não transtravadas com concentrações compostas que correspondem ao início, pontos médios e finais da curva de titulação medida na Figura 2A mostram que a interrupção mediada por 4EBP1 da interação endógena eIF4E-eIF4G correlaciona-se com o sinal de ensaio medido eIF4E:eIF4G604-646 (Figura 2B, 2C). Consistente com esses resultados, Pp242 é mostrado como um inibidor mais potente de fosforilação total de 4EBP1 do que a rapamicina sob as condições experimentais testadas em células HEK 293(Figura 3A),enquanto ambos os inibidores mostraram impacto na sinalização mTOR normalmente, com a rapamicina sendo mais ativa contra substratos mTORC1 e PP242 visando mTORC1 e mTORC2 (Figura 3B).
Juntos, esses resultados mostraram que o PP242 é mais eficaz na interrupção da formação complexa eIF4F do que a rapamicina nas células HEK293 e demonstram ainda que o sistema eIF4E:eIF4G604-646 pode medir com precisão a montagem complexa eIF4F em células vivas.
Figura 1: sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646. A representação esquemática mostrando como a interação entre proteína X (eIF4E) e proteína Y (eIF4G604-646) permite que as fusões SubA e SubB se aproximassem entre si e reconstituam a luciferase ativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Interrupção mediada por 4EBP1 do complexo eIF4F. (A) PP242 e rapamycina eIF4E:eIF4G604-646 ensaio titulação modelando a interação entre eIF4E e eIF4G em células HEK 293 transfectadas. (B,C) Análise de manchas ocidentais mostrando nível endógeno de eIF4E, eIF4G e 4EBP1 em extratos hek 293 e em m7GTP puxar para baixo após a incubação de células cultivadas com diferente concentração de PP242 ou Rapamicina, respectivamente. (D) Células tratadas em A onde multiplexado para viabilidade celular e luminescência avaliadas. Todos os valores representam ± média SD (n=3). Este número foi modificado a partir de16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeito diferencial da inibição do mTOR na foshorilação 4EBP1. (A) Análise de manchas ocidentais do estado de fosforilação de 4EBP1 em células HEK293 não transfeinadas tratadas com concentração indicada de PP242 e rapamicina. (B) Análise de manchas ocidentais do estado de fosforilação AKT e S6 em células HEK293 não transfiliram tratadas com os inibidores duplos do local ativo MTORC1/2 PP242, ou o inibidor a allotérico da Rapamicina mTORC1. Beta actin foi visualizado para controle de carregamento, bem como total 4EBP1, AKT e S6. Este número foi modificado a partir de16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito neste artigo utiliza um ensaio de complementação baseado em luciferase para monitorar quantitativamente o conjunto complexo eIF4F através da medição direta da interação eIF4G-eIF4E em células vivas. Fornecemos detalhes para o uso do sistema de complementação eIF4E-eIF4G e também mostramos que o sistema é extremamente preciso na medição da dissociação mediada por medicamentos 4EBP1 da interação eIF4E-eIF4G16. Para facilitar o throughput deste ensaio, a configuração experimental descrita neste artigo foi projetada para um uso de formato de microplacão de 96 poços.
Para obter resultados ideais, duas etapas críticas devem ser consideradas ao realizar o ensaio. Em primeiro lugar, a eficiência de transfecção entre os experimentos deve permanecer semelhante. Isso pode ser assegurado através do uso de células de baixo número de passagem, e contando rigorosamente as células no dia da semeadura. A confluência celular também deve ser avaliada antes da transfecção do DNA ser realizada, pois não é recomendado transfetar células com reagente de transfecção à base de lipídio se a confluência celular for inferior a 70-90%. Em segundo lugar, é importante multiplex o ensaio de complementação com um ensaio de viabilidade celular. Alguns compostos podem impactar o sinal de luciferase principalmente diminuindo o número de células viáveis através de efeitos deletérios. É, portanto, importante medir a viabilidade da célula imediatamente após o ensaio de complementação eIF4E:eIF4G604-646 para abordar efeitos fora do alvo e não específicos.
As interfaces proteína-proteína, tais como as entre eIF4E e eIF4G, que são desprovidas de fissuras hidrofóbicas e relativamente grandes e planares, são geralmente consideradas "não-drogadas" pelas terapêuticas convencionais de pequenas moléculas (<500 MW)17. Assim, há um crescente interesse no desenvolvimento de novas modalidades que interagem eficientemente com esse tipo de superfície (por exemplo, compostos macrocíclicos e peptidomióticos). No entanto, muitas dessas novas modalidades não são inatamente capazes de atravessar a membrana celular e engajar seu alvo. Para contornar essas questões, muitos grupos de pesquisa estão realizando pesquisas sobre novas estratégias de otimização química e entrega celular. Imaginamos que o ensaio PPI de células vivas eIF4E:eIF4G604-646 e outros ensaios derivados do PPI semelhantes desempenharão um papel fundamental na promoção dessas estratégias e validá-las.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo orçamento central do p53lab (BMSI, A*STAR) e da concessão VIP JCO (A*STAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
References
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