Her præsenterer vi en protokol til måling af eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler, der vil gøre det muligt for brugeren at evaluere lægemiddelinduceret forstyrrer af eIF4F-kompleks dynamik i screeningsformater.
Dannelsen af eIF4F-komplekset har vist sig at være den vigtigste downstream-node for konvergensen af signalveje, der ofte udsættes for onkogen aktivering hos mennesker. eIF4F er et cap-bindingskompleks, der er involveret i den mRNA-ribosome rekrutteringsfase, hvor oversættelsen påbegyndes. I mange cellulære og prækliniske kræftmodeller fører dereguleringen af eIF4F til øget oversættelse af specifikke mRNA-delsæt, der er involveret i kræftspredning og overlevelse. eIF4F er et hetero-trimerisk kompleks bygget af den kapselbindende underenhed eIF4E, helicase eIF4A og stilladsunderenheden eIF4G. Afgørende for samling af aktive eIF4F-komplekser er proteinproteininteraktionen mellem eIF4E- og eIF4G-proteiner. I denne artikel beskriver vi en protokol til måling af eIF4F-assembly, der overvåger status for eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler. Den eIF4e:4G celle-baserede protein-protein interaktion assay giver også mulighed for narkotika induceret ændringer i eIF4F komplekse integritet, der skal vurderes præcist og pålideligt. Vi forestiller os, at denne metode kan anvendes til at verificere aktiviteten af kommercielt tilgængelige forbindelser eller til yderligere screening af nye forbindelser eller modaliteter, der effektivt forstyrrer dannelsen af eIF4F-kompleks.
Kontrol af genekspression spiller en central rolle i den korrekte udførelse af cellulære programmer såsom vækstspredning og differentiering. Der kan udøves en reguleringskontrolmekanisme enten med hensyn til gentransskription eller med hensyn til mRNA-oversættelse. I det sidste årti er det blevet mere og mere tydeligt, at translationel kontrol ved graduering af indledningsprocessen snarere end de senere trin i forlængelse og afslutning fint kan regulere syntesen af specifikke delmængder af proteiner, der spiller en bred vifte af biologiske funktioner.
Øget oversættelse af mRNA’er, der er involveret i overlevelse, anti-autofagiske og antiapptotiske reaktioner, har været impliceret i flere kræftformer og er også blevet årsagssammenhæng med enten afvigende aktivering eller over ekspression af oversættelsesinitieringsfaktorer1.
eIF4F-komplekset er en overordnet regulator for oversættelsesinitiering. Ved at binde cap-strukturen på 5 ‘slutningen af mRNA’er, eIF4F driver indledende mRNA-ribosome rekruttering og til gengæld øge mRNA oversættelse effektivitet svagt oversat eukaryote mRNA2. eIF4F medieret oversættelse af kræft-relaterede mRNA’er er blevet rapporteret for mange kræftmodeller huser afvigende aktivering af RAS / MAPK eller AKT / TOR veje, tyder på, at kræftceller opregulere eIF4F at øge deres egen pro-neoplastiske aktivitet. Forstyrrelse af denne fremføringssløjfe ved at hæmme eIF4F-kompleksdannelse er derved en meget lovende terapeutisk strategi3,4.
eIF4F-komplekset består af (i) eIF4E, den cap-bindende underenhed af eIF4F, der interagerer med den cap struktur findes på 5 ‘UTR af mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase og (iii) eIF4G, stilladset protein, der interagerer med både eIF4A og eIF4E, og som i sidste ende rekrutter 40S ribosomal underenhed5. eIF4G-tilknytning til eIF4E er det hastighedsbegrænsende trin for samling af funktionelle eIF4F-komplekser, og det reguleres negativt af eIF4E-bindingsproteinerne (4MP’er, medlemmer 1, 2 og 3))6. Ved at konkurrere med eIF4G-binding til eIF4E via en grænseflade, der består af kanoniske og ikke-kanoniske eIF4E-bindingssekvenser7,8,9 (region, der spænder over aa 604-646 på human eIF4E), reducerer 4EBP puljen af eIF4E, der er aktivt involveret i oversættelse og forebyggelse af eIF4F-kompleks dannelse. Samspillet mellem disse proteinproteininteraktioner reguleres hovedsageligt af pattedyrsmålet for rapamycin (mTOR)-medieret fosforylering af 4EBP. Ved mitogen stimuli fosforerer mTOR direkte medlemmerne af 4E-BP-proteinfamilien, reducerer deres tilknytning til eIF4E og fremmer dermed eIF4E-eIF4G-interaktion og dannelse af funktionelle eIF4F-komplekser10.
På trods af den store indsats for at udvikle forbindelser rettet mod eIF4F kompleks integritet, har manglen på assays måle direkte afbrydelse af eIF4E-eIF4G interaktion i levende celler begrænset søgningen efter cellulære aktive hit forbindelser. Vi har anvendt en luciferase assay baseret på en coelenterazine analog (f.eks Nanoluc-baserede komplementering assay) til at overvåge i realtid status for eIF4F integritet gennem eIF4E-eIF4G interaktion. Luciferase komplementeringsproteinsystemet består af et 18 kDa proteinfragment (SubA) og 11 aminosyre peptidfragment (SubB), der er optimeret til minimal selvtilknytning og stabilitet11. Når de udtrykkes som et fusionsprodukt med den menneskelige eIF4E-længde og eIF4E-interaktionsdomænet fra human eiF4G1 (aa 604-646), vil de to interagerende proteiner bringe SubA- og SubB-fragmentet tæt på hinanden og fremkalde dannelsen af det aktive luciferase, der i nærværelse af en cellepermeabel substrat i sidste ende vil generere et lyst selvlysende signal (figur 1). Vi har andre steder rapporteret om konstruktion og validering af eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Her beskriver vi, hvordan eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystemet (tilgængeligt efter anmodning) kan anvendes til nøjagtigt at måle 4EBP1-medieret eIF4E-eIF4G-forstyrrelse i levende celler. Derudover demonstrerer vi dens nytte ved at måle virkningerne af flere mTOR-hæmmere, der i øjeblikket er under kliniske forsøg som potentielle kræftterapeutiske lægemidler12. Da off-target-effekter ofte maskerer stofspecifik aktivitet, beskriver vi også, hvordan alsidigheden af eIF4E:eIF4G604-646-systemmålingen kan udvides med ortogonale målinger af cellulær levedygtighed for at tage højde for disse.
Den metode, der er beskrevet i denne artikel, anvender en luciferasebaseret komplementeringsanalyse til kvantitativ overvågning af eIF4F-kompleks samling gennem direkte måling af eIF4G-eIF4E-interaktion i levende celler. Vi har givet oplysninger om brugen af eIF4E-eIF4G-komplementeringssystem, og vi har også vist, at systemet er ekstremt nøjagtigt til måling af lægemiddelinduceret 4EBP1-medieret dissociation af eIF4E-eIF4G-interaktion16. For at lette gennemstrømningen af denne analyse er de…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af kernebudgettet fra p53lab (BMSI, A * STAR) og JCO VIP-tilskuddet (A * STAR).
293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |