Summary
Her præsenterer vi en protokol til måling af eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler, der vil gøre det muligt for brugeren at evaluere lægemiddelinduceret forstyrrer af eIF4F-kompleks dynamik i screeningsformater.
Abstract
Dannelsen af eIF4F-komplekset har vist sig at være den vigtigste downstream-node for konvergensen af signalveje, der ofte udsættes for onkogen aktivering hos mennesker. eIF4F er et cap-bindingskompleks, der er involveret i den mRNA-ribosome rekrutteringsfase, hvor oversættelsen påbegyndes. I mange cellulære og prækliniske kræftmodeller fører dereguleringen af eIF4F til øget oversættelse af specifikke mRNA-delsæt, der er involveret i kræftspredning og overlevelse. eIF4F er et hetero-trimerisk kompleks bygget af den kapselbindende underenhed eIF4E, helicase eIF4A og stilladsunderenheden eIF4G. Afgørende for samling af aktive eIF4F-komplekser er proteinproteininteraktionen mellem eIF4E- og eIF4G-proteiner. I denne artikel beskriver vi en protokol til måling af eIF4F-assembly, der overvåger status for eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler. Den eIF4e:4G celle-baserede protein-protein interaktion assay giver også mulighed for narkotika induceret ændringer i eIF4F komplekse integritet, der skal vurderes præcist og pålideligt. Vi forestiller os, at denne metode kan anvendes til at verificere aktiviteten af kommercielt tilgængelige forbindelser eller til yderligere screening af nye forbindelser eller modaliteter, der effektivt forstyrrer dannelsen af eIF4F-kompleks.
Introduction
Kontrol af genekspression spiller en central rolle i den korrekte udførelse af cellulære programmer såsom vækstspredning og differentiering. Der kan udøves en reguleringskontrolmekanisme enten med hensyn til gentransskription eller med hensyn til mRNA-oversættelse. I det sidste årti er det blevet mere og mere tydeligt, at translationel kontrol ved graduering af indledningsprocessen snarere end de senere trin i forlængelse og afslutning fint kan regulere syntesen af specifikke delmængder af proteiner, der spiller en bred vifte af biologiske funktioner.
Øget oversættelse af mRNA'er, der er involveret i overlevelse, anti-autofagiske og antiapptotiske reaktioner, har været impliceret i flere kræftformer og er også blevet årsagssammenhæng med enten afvigende aktivering eller over ekspression af oversættelsesinitieringsfaktorer1.
eIF4F-komplekset er en overordnet regulator for oversættelsesinitiering. Ved at binde cap-strukturen på 5 'slutningen af mRNA'er, eIF4F driver indledende mRNA-ribosome rekruttering og til gengæld øge mRNA oversættelse effektivitet svagt oversat eukaryote mRNA2. eIF4F medieret oversættelse af kræft-relaterede mRNA'er er blevet rapporteret for mange kræftmodeller huser afvigende aktivering af RAS / MAPK eller AKT / TOR veje, tyder på, at kræftceller opregulere eIF4F at øge deres egen pro-neoplastiske aktivitet. Forstyrrelse af denne fremføringssløjfe ved at hæmme eIF4F-kompleksdannelse er derved en meget lovende terapeutisk strategi3,4.
eIF4F-komplekset består af (i) eIF4E, den cap-bindende underenhed af eIF4F, der interagerer med den cap struktur findes på 5 'UTR af mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase og (iii) eIF4G, stilladset protein, der interagerer med både eIF4A og eIF4E, og som i sidste ende rekrutter 40S ribosomal underenhed5. eIF4G-tilknytning til eIF4E er det hastighedsbegrænsende trin for samling af funktionelle eIF4F-komplekser, og det reguleres negativt af eIF4E-bindingsproteinerne (4MP'er, medlemmer 1, 2 og 3))6. Ved at konkurrere med eIF4G-binding til eIF4E via en grænseflade, der består af kanoniske og ikke-kanoniske eIF4E-bindingssekvenser7,8,9 (region, der spænder over aa 604-646 på human eIF4E), reducerer 4EBP puljen af eIF4E, der er aktivt involveret i oversættelse og forebyggelse af eIF4F-kompleks dannelse. Samspillet mellem disse proteinproteininteraktioner reguleres hovedsageligt af pattedyrsmålet for rapamycin (mTOR)-medieret fosforylering af 4EBP. Ved mitogen stimuli fosforerer mTOR direkte medlemmerne af 4E-BP-proteinfamilien, reducerer deres tilknytning til eIF4E og fremmer dermed eIF4E-eIF4G-interaktion og dannelse af funktionelle eIF4F-komplekser10.
På trods af den store indsats for at udvikle forbindelser rettet mod eIF4F kompleks integritet, har manglen på assays måle direkte afbrydelse af eIF4E-eIF4G interaktion i levende celler begrænset søgningen efter cellulære aktive hit forbindelser. Vi har anvendt en luciferase assay baseret på en coelenterazine analog (f.eks Nanoluc-baserede komplementering assay) til at overvåge i realtid status for eIF4F integritet gennem eIF4E-eIF4G interaktion. Luciferase komplementeringsproteinsystemet består af et 18 kDa proteinfragment (SubA) og 11 aminosyre peptidfragment (SubB), der er optimeret til minimal selvtilknytning og stabilitet11. Når de udtrykkes som et fusionsprodukt med den menneskelige eIF4E-længde og eIF4E-interaktionsdomænet fra human eiF4G1 (aa 604-646), vil de to interagerende proteiner bringe SubA- og SubB-fragmentet tæt på hinanden og fremkalde dannelsen af det aktive luciferase, der i nærværelse af en cellepermeabel substrat i sidste ende vil generere et lyst selvlysende signal (figur 1). Vi har andre steder rapporteret om konstruktion og validering af eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Her beskriver vi, hvordan eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystemet (tilgængeligt efter anmodning) kan anvendes til nøjagtigt at måle 4EBP1-medieret eIF4E-eIF4G-forstyrrelse i levende celler. Derudover demonstrerer vi dens nytte ved at måle virkningerne af flere mTOR-hæmmere, der i øjeblikket er under kliniske forsøg som potentielle kræftterapeutiske lægemidler12. Da off-target-effekter ofte maskerer stofspecifik aktivitet, beskriver vi også, hvordan alsidigheden af eIF4E:eIF4G604-646-systemmålingen kan udvides med ortogonale målinger af cellulær levedygtighed for at tage højde for disse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HEK293 celle linje blev brugt til protokollen og blev dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium suppleret med 10% Føtal Kvæg Serum, 2 mM L-glutamin, og 100 U / mL penicillin / streptomycin. Cellerne blev dyrket ved 37 °C med 5% CO2 i et befugtet miljø.
1. Kvantitativ vurdering af eIF4F-komplekse forstyrrelser via eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalyse
- Cellekultur og forbigående transfekt af eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalyse
- Brug frisk optøede celler med mindre end 20 passager til alle forsøg. På dag 1 skal du bestemme cellenummeret ved hjælp af en standardcelletæller og tælle de samlede levedygtige celler ved hjælp af trypanblå udeladelsesmetode13.
- Frø 6-brønds plader med 0,9 - 1,2 x 106 af HEK 293 celler per brønd i 2 mL standard vækstmedium.
BEMÆRK: For at opnå den bedste transfekteffektivitet inden for de ovenfor anførte cellelinjer skal det sikres, at de forgyldte celler har et sammenløb på 70-90 % dagen efter såningen. - Om morgenen på dag 2, co-transfect celler med SubA-eIF4E og eIF4G604-646-SubB plasmid ved hjælp af en lipid-baseret transfection reagens (se Tabel over materialer) som beskrevet nedenfor.
- 9 μL liposombaseret opløsning fortyndes i et rør, der indeholder 125 μL reduceret serummedium uden phenolrød (se materialetabel)for hver transfekt og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Forbered masterblandingen af DNA ved at fortynde 3 μg af hvert plasmid i 125 μL reduceret serummedium for hvert transfekturerør.
- Der tilsættes 12 μL forstærkerreagenser til DNA-masterblandingsrøret, blandes godt og straks tilsættes DNA: forstærker master mix til hvert rør af fortyndede liposomer i et forhold 1:1. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Dna-lipidkomplekset tilsættes til hver brønd og inkuber cellerne i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i 24 timer.
- Om morgenen på dag 3 skylles hver brønd med 1 mL PBS.
- PBS fjernes, og cellerne inkuberes i hver brønd med 0,3 mL trypsin i 5 min ved 37 °C.
- Trypsin neutraliseres ved at tilsætte 2 mL af det reducerede serummedium uden phenolrød indeholdende 0% FCS i hver brønd og overføre transfected celler til et 15 mL rør.
BEMÆRK: Phenolrød kan forstyrre luciferaseaktiviteten; derfor skal celler håndteres fra dette trin og frem i medium uden phenolrød. - Spin ned celler i 5 min ved 290 x g og indsug mediet. Resuspend cellerne i 2 mL af den reducerede serum medium uden phenol rød indeholder 0% FCS. Tæl som beskrevet i trin 1.1.
- Frø transfected HEK 293 celler i 96 godt uigennemsigtige plader med en densitet på 30.000 celler per brønd i 90 μL medium uden phenol rød indeholder 0% FCS. For at opnå 3 tekniske replikater inden for samme forsøg for 3 forskellige forbindelser, frø 60 brønde af pladerne med celler, bortset fra brønde på kanterne.
- Umiddelbart efter såning af de transfected celler tilsættes 10 μL 10% DMSO sammensat opløsning (se trin 1.2).
- Sammensat præparat
- Forbered 1 mM sammensatte stamopløsninger ved at opløse den sammensatte interesse i 100% DMSO (v/ v). For at få 3 replikater for hver sammensat titrering skal der anvendes 8 μL af 1 mM sammensat stamopløsning.
BEMÆRK: Mængden af 1 mM lagerforbindelse, der anvendes, er mere end hvad det er nødvendigt. Dette gøres for at tage hensyn til pipetting fejl, hvis nogen. - Der udføres en 2 gange seriel fortynding af stammasseopløsningen med 4 μL af 1 mM-bestanden i 4 μL på 100% DMSO for hvert titreringspunkt.
BEMÆRK: For en komplet sammensat titrering skal der udføres 9 serielle fortyndinger fra startlageret i 100% DMSO. Hvis flere forbindelser skal testes, skal du bruge en 96 brøndplade og en multikanalpipette for at lette dette trin og efterfølgende fortyndinger. - Der tilsættes 36 μL sterilt vand af HPLC-kvalitet for hvert punkt i den 2-dobbelte serielle fortynding for at forberede en 40 μL af 10x arbejdsopløsninger i 10% DMSO (v/v) (dvs. 100 μM til 0,39 μM 10% DMSO lagerserie vil føre til en endelig opløsning på 10 μM til 0,039 μM,i 1% DMSO ved tilsætning til celler). Hvad angår behandlingskontrol, skal du også forberede en 10% DMSO kun lageropløsning i sterilt vand af HPLC-kvalitet.
- Der tilsættes 10 μL af 10x arbejdsopløsninger til cellerne i den 96 godt uigennemsigtige plade for at give den tilsigtede endelige koncentration med en resterende DMSO-koncentration på 1% (v/v) i et samlet volumen på 100 μL og inkuberes i 3 h ved 37 °C med 5% v/v atmosfærisk CO2.
- Forbered 1 mM sammensatte stamopløsninger ved at opløse den sammensatte interesse i 100% DMSO (v/ v). For at få 3 replikater for hver sammensat titrering skal der anvendes 8 μL af 1 mM sammensat stamopløsning.
- Luciferase komplementering og levedygtighed analyse
- Efter 3 timers lægemiddelbehandling skal du begynde at forberede luciferase substratreagenset ved at kombinere 1 volumen substrat med 19 mængder fortyndingsreagens (se producentens anvisninger).
BEMÆRK: Luciferase-analysen udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt (se Materialeoversigt). - Brug en multikanalpipette til straks at tilsætte 25 μL reagens til substrat.
- Ryst pladen ved 350 omdrejninger i minuttet i 50 minutter på en orbital shaker ved stuetemperatur.
- Vurder luminescens ved hjælp af en pladelæser. For at gøre dette skal du indstille spejllæseren på luminescens og emissionsfilteret på 455. Brug en målehøjde på 6,5 mm med en måletid på 1 s.
- For at øge celle levedygtighed, tilføje 33 μL af levedygtighed assay reagens og derefter re-måle luminescens igen efter 15 min ved stuetemperatur, ved hjælp af pladelæseren.
- Vurder luminescens med pladelæseren ved at indstille spejllæseren på Luminescence og emissionsfilteret på 600 nm. Brug en målehøjde på 6,5 mm med en måletid på 1 s.
BEMÆRK: Levedygtigheden vurderes ved at måle ATP'ens intracellulære niveau på celle lysis i henhold til producentens anvisninger. Multiplexing er mulig i dette tilfælde, da levedygtighedsanalysen bruger en anden luciferase med en anden emissionsbølgelængde. - Brug dataene til at bestemme IC50-værdierne for hver forbindelse efter kurve, der tilpasser dataene til en kurveligning med fire parametre:
Y = ((A-D)/(1+(x/C)^B))) + D
De numeriske værdier D og A skal begrænses i kurvetilpasningsprocessen:
D = selvlysende værdi på Y-aksen for minimal kurve asymptote eller minimal teoretisk responsniveau, der forventes af eIF4E:4G-komplementeringsanalysen.
A = selvlysende værdi på Y-aksen for maksimal kurve asymptote eller maksimal teoretisk niveaurespons, der forventes fra eIF4E:4G-komplementeringsanalysen.
BEMÆRK: Værdien for den minimale respons er afledt af 1% DMSO (v/v) kontrolbehandling, og værdien for den maksimale respons er afledt af den maksimale respons fra en høj affinitet mTOR-hæmmer, der har plateaued uden effekt på celle levedygtighed.
- Efter 3 timers lægemiddelbehandling skal du begynde at forberede luciferase substratreagenset ved at kombinere 1 volumen substrat med 19 mængder fortyndingsreagens (se producentens anvisninger).
2. Korrelering af eIF4E:eIF4G604-646 assay hæmning med eIF4F kompleks forstyrrelse i celler
- For at bekræfte, at det signal, der måles ved analysen, svarer til den fysiske forstyrrelse af eIF4E-eIF4G-interaktionen fra forbindelsen, frøceller som beskrevet i trin 1.1.
- Dagen efter udskiftes mediet med 1 mL reduceret serummedium, der ikke indeholder phenolrødt og inkuberes i 4 timer med forbindelsen af interesse. Restkoncentrationen af DMSO på 1% (v/v) i et samlet volumen på 1 mL.
BEMÆRK: For nemt at muliggøre en korrelation med resultatet skal der anvendes sammensatte koncentrationer i begyndelsen, midtpunktet og slutpunktet af den målte komplementationsanalysetitreringskurve. - Lyse celler og udført m7GTP trække ned for at isolere eIF4F og eIF4E:4EBP1 komplekser. Detaljerede procedurer for, hvordan man udfører m7GTP pull down eksperiment kan findes andre steder14.
- Detektere m7GTP-bundet eIF4G-, eIF4E- og 4EBP1-proteinniveauer ved western blot-analyse og derefter korrelere til eIF4F-kompleks forstyrrelse med komplementationsanalysesignalhæmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at validere følsomheden af eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystemet blev 4EBP1 medieret hæmning af eIF4F kompleks samling vurderet ved hjælp af mTOR-hæmmere. Ved at hæmme mTORC1 kinaseafhængig fosforylering af 4EBP-proteinfamilien øger mTOR-hæmning 4EBP1-tilknytningen til eIF4E og derfor eIF4F demontering15. To klasser af mekanistisk forskellige hæmmere af mTOR kinases blev testet: rapalogs (f.eks Rapamycin), der er allosteriske hæmmere af mTORC1, men ikke mTORC2 og ATP konkurrencebaserede hæmmere (f.eks PP242), der er designet til specifikt at hæmmer både mTORC1 og mTORC2 kinase katalytisk aktivitet.
HEK293-celler blev transfected med eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystemet som beskrevet i trin 1. Efter 24 timers transfekt blev cellerne resået og behandlet med mTOR-hæmmerne PP242 og rapamycin (som beskrevet i trin 1.2). Fire timer efter behandlingen blev luminescens vurderet, som beskrevet tidligere, efterfulgt af celle levedygtighed. Som vist i figur 2frembringer PP242 en dosisafhængig hæmning af signalet med en beregnet IC50 på 0,72 ± 0,04 μM, mens en IC50 på 6,88 ± 0,88 μM udledes for rapamycin (figur 2A). Pladerne blev derefter multixeret for cellulær levedygtighedsanalyse (Figur 2D). Denne analyse viser, at hverken PP242 eller rapamycin medfører et betydeligt fald i celle levedygtighed, der beviser, at faldet i luminescens i eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem ikke skyldes uspecifik celledød, men snarere forstyrrelse af eIF4E:4G-interaktionen.
Et m7GTP-pull-down-forsøg udført ved at inkubere ikke-overførte celler med sammensatte koncentrationer, der svarer til begyndelsen, midten og slutpunkterne i den målte titreringskurve i figur 2A, viser, at 4EBP1-medieret forstyrrelse af endogen eIF4E-eIF4G-interaktion korrelerer med det målte eIF4E:eIF4G604-646 assaysignal (Figur 2B, 2C). I overensstemmelse med disse resultater, PP242 er vist sig at være en mere potent hæmmer af i alt 4EBP1 fosforylering end rapamycin under de eksperimentelle forhold testet i HEK 293 celler (Figur 3A), mens begge hæmmere viste en indvirkning på mTOR signalering normalt, med rapamycin er mere aktiv mod mTORC1 substrater og PP242 rettet mod både mTORC1 og mTORC2 (Figur 3B).
Samlet set viste disse resultater, at PP242 er mere effektiv til at forstyrre eIF4F-kompleksdannelse end rapamycin i HEK293-celler, og de viser endvidere, at eIF4E:eIF4G604-646-systemet præcist kan måle eIF4F-kompleks samling i levende celler.
Figur 1: eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem. Skematisk repræsentation, der viser, hvordan samspillet mellem protein X (eIF4E) og protein Y (eIF4G604-646)gør det muligt for SubA- og SubB-fusioner at komme i nærheden af hinanden og rekonstruere den aktive luciferase. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: 4EBP1-medieret afbrydelse af eIF4F-kompleks. (A) PP242 og rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 assay titrering modellering samspillet mellem eIF4E og eIF4G i transfected HEK 293 celler. (B,C) Western blot analyse viser endogene niveau af eIF4E, eIF4G og 4EBP1 i HEK 293 ekstrakter og i m7GTP trække ned efter inkubation af dyrkede celler med forskellige koncentration af PP242 eller Rapamycin hhv. (D) Behandlede celler i A, hvor multiplekseret for celle levedygtighed og luminescens vurderet. Alle værdier repræsenterer middelværdien ± SD (n=3). Dette tal er blevet ændret fraden 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Differentialeffekt af mTOR-hæmning på 4EBP1-phoshorylation. (A) Vestlig blotanalyse af 4EBP1's fosforyleringsstatus i ikke-transfected HEK293-celler behandlet med den angivne koncentration af PP242 og rapamycin. (B) Western blot analyse af AKT og S6 fosforylering status i ikke-transfected HEK293 celler behandlet med enten den dobbelte MTORC1/2 aktive site hæmmere PP242, eller den allosteriske hæmmer af mTORC1 Rapamycin. Beta actin blev visualiseret til lastning kontrol samt i alt 4EBP1, AKT og S6. Dette tal er blevet ændret fraden 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode, der er beskrevet i denne artikel, anvender en luciferasebaseret komplementeringsanalyse til kvantitativ overvågning af eIF4F-kompleks samling gennem direkte måling af eIF4G-eIF4E-interaktion i levende celler. Vi har givet oplysninger om brugen af eIF4E-eIF4G-komplementeringssystem, og vi har også vist, at systemet er ekstremt nøjagtigt til måling af lægemiddelinduceret 4EBP1-medieret dissociation af eIF4E-eIF4G-interaktion16. For at lette gennemstrømningen af denne analyse er den eksperimentelle opsætning, der er beskrevet i denne artikel, designet til en 96 godt mikropladeformatbrug.
For at opnå optimale resultater bør der tages hensyn til to kritiske trin, når analysen udføres. For det første bør transfekteffektiviteten mellem eksperimenterne forblive den samme. Dette kan sikres ved brug af celler med lavt passagetal og ved nøje at tælle celler på såningsdagen. Cellekonfluens bør også vurderes, før DNA-transfekt udføres, da det ikke anbefales at transfektere celler med lipidbaseret transfektreagens, hvis cellekonfluens er mindre end 70-90%. For det andet er det vigtigt at multiplex komplementering assay med en celle levedygtighed assay. Nogle forbindelser kan påvirke luciferasesignalet primært ved at reducere antallet af levedygtige celler gennem skadelige virkninger. Det er derfor vigtigt at måle cellens levedygtighed umiddelbart efter eIF4E:eIF4G604-646-komplementeringsanalysen for at imødegå ikke-målmæssige og ikke-specifikke virkninger.
Proteinproteingrænseflader, såsom grænsefladerne mellem eIF4E og eIF4G, som er blottet for hydrofobe kløfter og er relativt store og planar, anses generelt for at være "un-druggable" af konventionelle små molekylebehandlinger (<500 MW)17. Der er således en stigende interesse for udviklingen af nye modaliteter, der effektivt interagerer med denne type overflader (f.eks. makrocykliske og peptidomimetiske forbindelser). Men mange af disse nye modaliteter er ikke medfødt i stand til at krydse cellemembranen og engagere deres mål. For at omgå disse problemer udfører mange forskergrupper forskning i nye kemiske optimerings- og cellulære leveringsstrategier. Vi forestiller os, at eIF4E:eIF4G604-646 live celle PPI assay og andre lignende PPI afledte assays vil spille en central rolle i at fremme disse strategier og validere dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af kernebudgettet fra p53lab (BMSI, A * STAR) og JCO VIP-tilskuddet (A * STAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
References
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J.
- Gebauer, F., Hentze, M. W.
- Bhat, M., et al.
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C.
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al.
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
