主要的骨盆侧腹含有寄生和同情神经元,内含骨盆器官。在这里,我们描述了一个解剖方法,并提供图解图,以识别这些坏疽及其相关的神经。这些方法可应用于体内这些坏疽的实验操作或去除后检,供进一步研究。
双边主要骨盆侧腺(MPG;同义词、骨盆侧腹)是后刚体寄状和寄生神经元内侧啮齿动物骨盆器官的主要来源;人类的功能等效结构是低胃类的。主要的骨盆坏疽也提供了腰椎和腹腔感觉斧子到达骨盆器官的路线。这些复杂的混合性坏疽病可以证明是难以识别和解剖,以进一步实验研究正常的自主机制或建立疾病,损伤或内脏疼痛的临床前模型。在这里,我们描述了一个协议,以访问和可视化这些坏疽及其相关的神经道。我们为男性和女性大鼠提供原理图,因为性别之间的轮联大小和识别地标不同。该协议描述了为体外研究去除结群,但这种方法可以集成到手术恢复协议中,用于实验干预(例如神经挤压、神经切除)或绘制神经元回路图(例如,通过微注射神经跟踪器)。我们还演示了解剖后及其相关神经的主要结构,以及免疫组织化学染色之后。
大鼠是骨盆器官生理学和解剖学研究中具有最佳特征的物种之一。虽然这些器官的描述存在极好的资源1,2,它们通常不提供有关神经结构的信息,或者以不足的分辨率来指导实验研究。如下文所述,调节骨盆器官功能的自主性神经群的组织与自主神经系统的其他部分有很大不同,因此很难从可用于其他自主性神经性神经学信息中准确推断骨盆内侧特征。这种资源不足,以指导研究人员进入这一领域,可能减缓了对骨盆器官神经调节的研究。在这里,我们描述了进入神经系统的这个区域以进行进一步的体外研究或实验干预的协议。
双边主要骨盆性结体(MPG;同义词:骨盆性坏疽;宫颈性结腔[女性]);弗兰肯赫瑟的侧结[女性])是后刚体寄感和寄生神经元内化啮齿动物骨盆器官的主要来源;劣质低胃丛包括人类3、4、5、6的等效神经元结构。来自腰椎和腹腔背根神经的感官投影也通过MPG到达骨盆器官。因此,了解MPG的神经回路和生物学对于临床前研究与骨盆器官发育和成人功能有关的无数临床条件至关重要。啮齿动物MPG的一些极好的描述已经发表7,8,但我们的经验是,一般来说,这些描述并不总是提供足够的指导,以实际通知实验解剖或操纵这些结构时,需要恢复动物。此外,大多数MPG研究侧重于雄性大鼠。在雌性大鼠中,MPG 较小9,具有明显的解剖地标,因此需要一个明显定制的可视化和解剖指南。
交感和寄生通路由他们的解剖学区分,特别是其前刚神经元的位置,与同情通路有前刚体神经元在胸椎脊髓和寄生前刚体神经元位于脑干(颅神经投影)和囊性脊髓。在自治系统的大多数其他区域,它们的目标神经神经元位于明显的寄感或寄生性神经。然而,MPG在混合同情性寄生性脊柱方面并不常见,因此在宏观尺度上,是胸椎和腹腔脊柱区域前刚连体斧子的收敛点。因此,我们在协议中包括了这些连接每个脊柱区域与MPG的主要神经道的位置和描述,促进实验分析或对这些神经成分的单独操作。我们还特别为读者指出,在啮齿动物中,脊柱前脊柱神经元是功能性囊性,例如,在排骨、排便和勃起期间是活跃的和必需的,位于脊柱水平 L6 – S1 ,而不是完全在食层部分10 ;同样,L6和S1背根性神经质为骨盆器官提供主要的”囊性”感官输入。在啮齿动物中,来自更玫瑰色神经回路的感官和预旋输入集中在脊柱水平L1和L210。
在这里,我们描述了一个协议,以访问MPG及其相关的神经道在男性和女性大鼠,并支持它与原理图,以说明特定的地标。该协议指导手术访问这些结构在实验背景下去除组织进行体外研究,例如,分离MPG神经元的分子表征或初级培养。它也可以适应MPG去除后,心脏内灌注与固定,虽然这是一个更难的解剖,因为神经组织变得更加难以可视化时,相邻的组织没有血液。该协议也可以集成到手术环境中,用于这些神经通路的实验干预(例如神经切除、神经示踪剂的微注射)。这些类型的解剖对于生物电子医学的不断发展领域越来越重要,在那里,神经调节治疗骨盆内脏临床条件的新靶点和方法正在开发中。我们首先为雄性大鼠提出完整的协议,然后复制专门为雌性大鼠定制的协议。
骨盆器官的神经控制由复杂的通路进行调节,包括躯体、寄生、寄感和内脏感觉成分14、15、16、17。这些途径大多源自或通过 MPG。此处概述的解剖协议介绍了 MPG 解剖学、相关神经和附近的宏观解剖地标;后者用解剖原理图加以说明。其他MPG解剖方法也可能成功,但我们发现这里描述的方法非常健壮,适合神经系统这一领域的研究人员。
该协议最关键的方面是正确识别每个主要神经和完全切除MPG组织。通过仔细观察和处理组织,MPG组织可以去除解剖学,分子和电生理学体外研究18,19,20,21,22。该协议也可以适应体内实验操作23,24,25,指出在这种情况下,必须非常小心,以尽量减少接触与结群相关的主要神经或损害附近的血管。如果实验需要选择性脱硝,通过中断一个或多个神经,建议对被切断的神经进行隔离,以防止重新受压和分析。这个解剖协议也可用于鼠标,其中也有一个MPG具有类似的功能26,27,28。
在神经解剖学研究中,通过解剖麻醉动物的MPG,通过与实验相适应的组织固定性进行对照,对抗原和组织结构进行最佳保存;然而,在这个过程中,由于组织着色丢失,识别结群和神经结构更加困难。建议在灌注后尝试这种解剖之前,要熟练地识别和解剖未渗透动物的结核。同样,建议首先精通雄性解剖,因为对于年龄和体型相当的动物,MPG及其相关神经在雌性中要小得多。
为了验证所切除的组织是否确实是MPG,研究人员首先建议检查每个主神经的位置和特征。许多分离发现骨盆神经和洞穴神经最容易就地识别;低胃神经和附属神经更细腻,更难与周围组织区分。如果这些神经由于解剖过程中的问题而不再可用,或者其结构存在不确定性,建议使用常规组织学(确认神经元细胞体8的存在)和免疫组织化学(确定胆碱能和神经核酸神经元均存在30、31)(图3)。为了验证对主要神经的正确识别,洞穴神经很容易被其初始部分的神经元细胞体的高密度识别到MPG附近;这些神经元大多表示胆碱能、神经球神经元的标记32、33。骨盆、下胃和辅助神经很少有神经元细胞体34。
执行此解剖时有几个常见的陷阱。如果新手部门在找到任何主要神经或MPG时遇到问题,则鼓励他们回到描述关键地标的步骤。人们通常如此专注于寻找微观结构,以至于人们失去了对宏观背景的跟踪。最常见的情况是,新手在解剖部位移动得太远,或者保持过于”表面”,即离腹部腹腔开口太近,而不是检查更深的(即更背)的结构。解剖过程中的一个常见问题是解剖过程中血管损伤。如果出血开始,轻轻地将棉尖施用器放在源上,直到出血停止,然后用盐水自由冲洗区域,然后再重新开始解剖。如果被过多的血液污染,或者解剖延迟太久,等待出血停止,MPG 可能无法用于实验。另一个常见的解剖误差是前列腺胶囊受损,这严重损害了MPG的可视化和去除。这种胶囊是一个非常微妙的结构,很容易刺穿,同时从前列腺的侧壁去除脂肪,即使只使用棉尖施用器。最后,在识别每个神经,然后在去除MPG的过程中,与MPG相关的主要神经很容易受损。鼓励各部门制定一种程序,即依次按特定顺序隔离每个神经,以便在清除黑帮的最后步骤中减少混淆的机会。
这种解剖没有试图追查每个从紧神经的成分到特定的器官,或识别每个位于骨盆刚利亚和骨盆器官之间的不同点。如果不使用特定的污渍,这些在体内很难可视化;然而,它们可以通过跟随每个神经道向器官,并利用特定的神经污渍后,确定结群位置去除。与MPG相比,这些微冈利亚虽然只占神经元群的一小部分,但可能为它们最密切的器官提供特定类型的输入。我们注意到该领域的一个局限性,即这些微甘利亚和许多小神经道都未离开MPG前往骨盆器官,但名称还被广泛接受。此外,尚未对雌性大鼠进行同样详细的微甘利亚研究。
综上所述,此处提供的协议和原理图为研究人员提供了工具,用于研究为骨盆器官提供自主神经供应的主要结构,以及来自腰腔背根的感官神经的主要外围通道通过MPG旅行到骨盆器官的坏疽。
The authors have nothing to disclose.
本出版物报告的研究得到了国家卫生研究所所长办公室的支持,刺激外围活动缓解疾病方案,奖励编号OT2OD023872。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。贝特朗博士在Keast博士实验室的奖学金由:内梅斯大学医院资助, 蒙彼利埃-内梅斯医学院、法国法语协会、法语国家协会 根据REA赠款协议,根据REA赠款协议,根据REA赠款协议,欧盟第七框架方案(FP7/2007-2013)的乌里迪纳莫和佩尔维佩里尼科和人民方案(玛丽居里行动)通过由校园协调的PRESTIGE方案No PCOFUND-GA-2013-609102法国。
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |