Les principaux ganglions pelviens contiennent des neurones parasympathiques et sympathiques qui innervent les organes pelviens. Ici, nous décrivons une méthode de dissection et fournissons des schémas pour l’identification de ces ganglions et de leurs nerfs associés. Ces méthodes peuvent être appliquées à la manipulation expérimentale de ces ganglions in vivo ou de l’ablation post-mortem pour une étude plus approfondie.
Les principaux ganglions pelviens bilatéraux (MPG; synonyme, ganglion pelvien) sont la principale source de neurones sympathiques et parasympathiques postganglioniques innervant les organes pelviens des rongeurs; la structure fonctionnellement équivalente chez l’homme est le plexus hypogatricien inférieur. Les principaux ganglions pelviens fournissent également la route par laquelle les axones sensoriels lombaires et sacrés atteignent les organes pelviens. Ces ganglions complexes et mixtes peuvent s’avérer difficiles à identifier et à disséquer pour une étude expérimentale plus poussée des mécanismes autonomes normaux ou pour établir des modèles précliniques de maladie, de blessure ou de douleur viscérale. Ici, nous décrivons un protocole pour accéder et visualiser ces ganglions et leurs voies nerveuses associées. Nous fournissons ce protocole avec des schémas pour les rats mâles et femelles, car la taille de ganglion et les points de repère pour l’identification diffèrent entre les sexes. Le protocole décrit l’ablation du ganglion pour des études in vitro, mais cette méthode peut être intégrée dans un protocole de récupération chirurgicale pour les interventions expérimentales (p. ex. écrasement de nerf, résection nerveuse) ou pour cartographier les circuits neuronaux (p. ex., par microinjection des traceurs neuronaux). Nous démontrons également les structures primaires du ganglion et de ses nerfs associés immédiatement après la dissection et suivant la coloration immunohistochimique.
Le rat est l’une des espèces les mieux caractérisées utilisées dans l’étude de la physiologie et de l’anatomie des organes pelviens. Bien qu’il existe d’excellentes ressources pour les descriptions de ces organes1,2, ils ne fournissent généralement pas d’informations sur les structures neuronales connexes ou le font à une résolution insuffisante pour guider une étude expérimentale. Comme détaillé plus loin ci-dessous, l’organisation des ganglions autonomes qui régulent la fonction pelvienne d’organe est tout à fait différente du reste du système nerveux autonome, ce qui rend difficile d’inférer avec précision les dispositifs d’innervation pelvienne de l’information neuroanatomique disponible pour d’autres ganglions autonomes. Cette carence en ressources pour guider les chercheurs entrant dans ce domaine peut avoir ralenti la recherche sur la régulation neuronale des organes pelviens. Ici, nous décrivons des protocoles pour accéder à cette région du système nerveux pour d’autres études in vitro ou une intervention expérimentale.
Les grands ganglions pelviens bilatéraux (MPG; synonymes: ganglions pelviens; ganglions paracévacgiques [femelles]; Le ganglion [féminin] de Frankenhuser est la principale source de neurones sympathiques et parasympathiques postganglioniques innervant les organes pelviens des rongeurs ; le plexus hypogatricien inférieur comprend la structure neuronale équivalente chez l’homme3,4,5,6. Les projections sensorielles des ganglions lombaires et sacrés de racine dorsale voyagent également par l’intermédiaire du MPG pour atteindre les organes pelviens. Par conséquent, la compréhension des circuits neuronaux et de la biologie du MPG est essentielle pour des études précliniques sur une myriade de conditions cliniques relatives au développement et à la fonction adulte des organes pelviens. Plusieurs excellentes descriptions de rongeur MPG ont été publiés7,8,mais notre expérience est que, en général, ces descriptions ne fournissent pas toujours des conseils suffisants pour pratiquement informer une dissection expérimentale ou la manipulation de ces structures lors de la récupération de l’animal est nécessaire. En outre, la majorité des études MPG se concentrent sur les rats mâles. Chez les rats femelles, le MPG est plus petit9 et ont des repères anatomiques distincts, et nécessitent donc un guide distinctement adapté à la visualisation et la dissection.
Les voies sympathiques et parasympathiques se distinguent par leur anatomie, en particulier l’emplacement de leurs neurones preganglionic, avec des voies sympathiques ayant des neurones preganglionic dans la moelle épinière thoraco-lumbar et les neurones préganglioniques parasympathiques situés dans le tronc cérébral (projections de nerf crânien) et la moelle épinière sacrée. Dans la plupart des autres régions du système autonome, leurs neurones ganglionaux cibles sont situés dans des ganglions sympathiques ou parasympathiques distincts. Cependant, le MPG est peu commun en étant mixte sympathique-parasympathetic ganglions, et donc à une échelle macroscopique sont des sites de convergence des axones préganglioniques des régions thoraciques-lombaires et la colonne vertébrale sacrée. Nous avons donc inclus dans nos protocoles l’emplacement et la description de ces voies nerveuses primaires qui relient chaque région spinale au MPG, facilitant l’analyse expérimentale ou la manipulation séparée de ces composants neuronaux. Nous notons également pour les lecteurs comparant spécifiquement ces ganglions entre les espèces, que chez les rongeurs les neurones préganglioniques de la colonne vertébrale qui sont «fonctionnellement sacral», par exemple, sont actifs et nécessaires pendant la micturition, la défécation et l’érection pénienne, sont situés aux niveaux de la colonne vertébrale L6-S1 plutôt que exclusivement dans les segments sacrés10; de même L6 et S1 dorsal root ganglia fournir l’entrée sensorielle «sacrale» majeure aux organes pelviens. Chez les rongeurs, l’apport sensoriel et préganglionique des circuits neuronaux plus rostrals est concentré dans les niveaux rachidiens L1 et L210.
Ici, nous décrivons un protocole pour accéder au MPG et leurs voies nerveuses associées chez les rats mâles et femelles, et nous l’appuyons avec des schémas pour illustrer des repères spécifiques. Ce protocole guide l’accès chirurgical à ces structures dans un contexte expérimental d’enlèvement du tissu pour des études in vitro, par exemple, l’isolement des neurones MPG pour la caractérisation moléculaire ou la culture primaire. Il peut également être adapté à l’ablation de MPG après perfusion intracardique avec fixatif, bien que ce soit une dissection plus difficile parce que le tissu neural devient plus difficile à visualiser lorsque les tissus adjacents sont dépourvus de sang. Ce protocole peut également être intégré dans un cadre chirurgical pour l’intervention expérimentale de ces voies nerveuses (p. ex., résection nerveuse, microinjection de traceurs neuronaux). Ces types de dissections sont de plus en plus importants pour le domaine croissant de la médecine bioélectronique, où de nouvelles cibles et approches pour la neuromodulation pour traiter les conditions cliniques des viscères pelviens sont en cours dedéveloppement 11. Nous présentons le protocole complet d’abord pour les rats mâles, puis une réplique du protocole adapté spécifiquement pour les rats femelles.
Le contrôle neuronal des organes pelviens est médié par des voies complexes, y compris les composants sensoriels somatiques, parasympathiques, sympathiques et viscérals14,15,16,17. La plupart de ces voies proviennent ou passent par le MPG. Les protocoles de dissection décrits ici fournissent une introduction à l’anatomie de MPG, aux nerfs associés connexes et aux repères anatomiques macroscopiques à proximité ; ces derniers sont illustrés par des schémas anatomiques. D’autres approches de la dissection MPG peuvent également être couronnées de succès, mais nous trouvons celui décrit ici pour être robuste et approprié pour un chercheur nouveau dans ce domaine du système nerveux.
Les aspects les plus critiques du protocole sont l’identification correcte de chaque nerf majeur et l’ablation complète du tissu MPG. Avec une visualisation et une manipulation minutieuses des tissus, les tissus MPG peuvent être enlevés pour des études in vitro anatomiques, moléculaires et électrophysiologiques18,19,20,21,22. Le protocole peut également être adapté pour la manipulation expérimentale in vivo23,24,25, notant que dans ce cas, un grand soin doit être pris pour minimiser le contact avec les nerfs primaires associés au ganglion ou pour endommager la vascularisation à proximité. Si l’expérience nécessite une dénervation sélective par interruption d’un ou plusieurs nerfs, il est recommandé de ligate le nerf coupé pour empêcher la réinnervation et la confusion des analyses. Ce protocole de dissection pourrait également être utilisé pour la souris, où il ya aussi un MPG avec la fonction comparable26,27,28.
Pour les études neuroanatomiques, la meilleure conservation des antigènes et de la structure tissulaire est obtenue en disséquant le MPG d’un animal anesthésié qui a été perfusé transcardially avec le fixatif histologique approprié à l’expérience29; cependant, l’identification du ganglion et des structures nerveuses sont plus difficiles après ce processus, car la coloration de tissu est perdue. Il est recommandé de devenir compétent dans l’identification et la dissection du ganglion d’animaux non perfusés avant de tenter cette dissection après la perfusion. De même, il est recommandé de devenir d’abord compétent dans la dissection chez les mâles parce que pour les animaux d’âge et de taille du corps équivalents, le MPG et ses nerfs associés sont beaucoup plus petits chez les femelles.
Pour valider que le tissu enlevé est en effet le MPG, le chercheur est d’abord conseillé de vérifier l’emplacement et les caractéristiques de chaque nerf primaire. Beaucoup de dissecteurs trouvent le nerf pelvien et le nerf caverneux le plus facile à identifier in situ ; les nerfs hypogatriques et accessoires sont plus délicats et plus difficiles à distinguer du tissu environnant. Si ces nerfs ne sont plus disponibles en raison de problèmes pendant la dissection, ou s’il y a une incertitude concernant leur structure, il est recommandé que les dissections initiales de MPG soient caractérisées avec l’histologie conventionnelle (pour confirmer la présence des corps de cellules neuronales8) et deuxièmement avec l’immunohistochimie (pour identifier que les neurones cholinergiques et noradériques sont présents30,31) (figure 3). Pour valider l’identification correcte des nerfs principaux, les nerfs caverneux sont facilement identifiés par leur forte densité de corps de cellules neuronales dans leur partie initiale près du MPG ; la plupart de ces neurones expriment des marqueurs de neurones cholinergiques et nitrégiques32,33. Les nerfs pelviens, hypogatricien et accessoire ont très peu de corps cellulaires neuronaux34.
Il y a plusieurs pièges communs dans l’exécution de cette dissection. Si les dissecteurs novices ont du mal à trouver l’un des nerfs majeurs ou le MPG, ils sont encouragés à revenir aux étapes qui décrivent les points de repère clés. Il est très fréquent de se concentrer sur la recherche des microstructures que l’on perd la trace du contexte macroscopique. Le plus souvent, les dissecteurs novices se déplacent trop rostral dans leur site de dissection ou restent trop «superficiels», c’est-à-dire trop près de l’ouverture ventrale de l’abdomen, plutôt que d’examiner des structures plus profondes (c.-à-d., plus dorsales). Un problème commun pendant la dissection est dommages à la vascularisation pendant la dissection. Si le saignement commence, maintenez doucement un applicateur à pointe de coton sur la source jusqu’à ce que le saignement cesse, puis rincer la zone généreusement avec saline avant de recommer la dissection. Il est possible que le MPG ne sera pas utilisable pour les expériences si contaminé avec trop de sang ou si la dissection est retardée trop longtemps en attendant que les saignements s’arrêtent. Une autre erreur commune de dissection est des dommages à la capsule de la prostate qui altère considérablement la visualisation et l’enlèvement de MPG. Cette capsule est une structure très délicate qui est facilement perforée tout en enlevant la graisse de la paroi latérale de la prostate, même si vous n’utilisez qu’un applicateur à pointe de coton. Enfin, les nerfs principaux associés au MPG sont facilement endommagés pendant le processus d’identification de chacun d’eux, puis lors de l’enlèvement du MPG. Les disséquents sont encouragés à développer une routine par laquelle chaque nerf est isolé à son tour, dans un ordre particulier, de sorte qu’il y ait moins de possibilités de confusion pendant les dernières étapes de l’enlèvement des ganglions.
Cette dissection n’a pas cherché à retracer chacun des composants des nerfs accessoires à des organes spécifiques, ou à identifier chacune des nombreuses microganglia qui se trouvent à divers points entre les ganglions pelviens et les organes pelviens8. Ceux-ci sont assez difficiles à visualiser in vivo sans utiliser des taches spécifiques; cependant, ils peuvent être enlevés en suivant chacun des tracts nerveux vers les organes, et en utilisant des taches neurales spécifiques post hoc pour déterminer l’emplacement du ganglion. Ces microganglias, même si ne comprennent qu’une petite fraction de la population neuronale par rapport au MPG, peuvent fournir des types spécifiques d’entrée aux organes auxquels ils sont les plus étroitement situés. Nous notons ici une limitation dans le domaine que ni ces microganglia ni beaucoup de petites voies nerveuses sortant du MPG pour se rendre aux organes pelviens encore ont largement accepté des noms. En outre, une étude tout aussi détaillée de la microganglia n’a pas encore été menée chez les rats femelles.
En résumé, le protocole et les schémas fournis ici fournissent aux chercheurs des outils pour étudier les structures primaires fournissant l’approvisionnement en nerf autonome aux organes pelviens, ainsi que les principaux conduits périphériques des nerfs sensoriels de la racine dorsale lumbosacral ganglions qui voyagent via le MPG aux organes pelviens.
The authors have nothing to disclose.
Les recherches rapportées dans cette publication ont été appuyées par le Bureau du directeur, National Institutes of Health, Stimulating Peripheral Activity to Relieve Conditions (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. La bourse du Dr Bertrand au laboratoire du Dr Keast a été financée par : Le CHU de Nîmes, la faculté de médecine de Montpellier-Nîmes, L’Association Française de Chirurgie (AFC), la Société Interdisciplinaire francophone d’UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) et le Programme Populaire (Actions Marie Curie) du Septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP7/2007-2013) dans le cadre de l’accord de subvention du REA No PCOFUND-GA-2013-609102, par le biais du programme PRESTIGE coordonné par le Campus France.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |