主要な骨盤神経節には、骨盤器官を内面的に活性化する副交感神経および交感神経が含まれている。ここでは解剖方法を説明し、これらの神経節および関連する神経の同定のための回路図を提供する。これらの方法は、これらの神経節のインビボでの実験的操作またはさらなる研究のための除去事後分析に適用することができる。
両側の主要な骨盤神経節(MPG;同義語、骨盤神経節)は、げっ歯類の骨盤器官を内臓神経節下交感神経および副交感神経の主要な供給源である。ヒトの機能的に等価な構造は、低胃神経叢下にある。主要な骨盤神経節はまた、腰椎および仙骨官能軸索が骨盤器官に到達する経路を提供する。これらの複雑な混合神経節は、正常な自律神経機構のさらなる実験的研究のために、または病気、傷害または内臓痛の前臨床モデルを確立するために識別し、解剖することは困難であることが証明できる。ここでは、これらの神経節および関連する神経管にアクセスして視覚化するためのプロトコルについて説明します。私たちは、男性と女性の両方のラットのための回路図をこのプロトコルを提供します, ガングリオンの大きさと識別のためのランドマークは、男女間で異なります.プロトコルは、インビトロ研究のための神経節の除去を記述しますが、この方法は、実験的介入(例えば、神経クラッシュ、神経切除)または神経回路のマッピング(例えば、マイクロインジェクションによる)のための外科的回復プロトコルに統合することができます神経トレーサーの)。また、解剖直後および免疫組織化学的染色後の神経節およびそれに関連する神経の主要な構造を実証する。
ラットは骨盤臓器生理学と解剖学の研究で使用される最も特徴のある種の一つである。これらの器官1,2の記述には優れたリソースが存在するが、一般的に関連する神経構造に関する情報を提供したり、実験的研究を導くために十分な解像度で提供したりしない。さらに詳しく説明するように、骨盤臓器機能を調節する自律神経節の組織は、自律神経系の他の部分とは全く異なり、他の自律神経節で利用可能な神経解剖学的情報から骨盤内インジュレーション特徴を正確に推測することは困難である。この領域に入る研究者を導くリソースのこの不足は、骨盤臓器の神経調節に関する研究を遅らせてきた可能性があります。.ここでは、さらなるインビトロ研究または実験的介入のために神経系のこの領域にアクセスするためのプロトコルについて説明する。
両側大骨盤神経節(MPG;同義語:骨盤神経節;副頸神経節[女性];フランケンホイザーの神経節[女性])は、げっ歯類の骨盤器官を内面する神経節後交感神経および副交感神経の主要な供給源である。下腺胃神経叢は、ヒト3、4、5、6における同等の神経構造を含む。腰椎および仙骨底根神経節からの感覚的突起もMPGを介して移動して骨盤器官に到達する。したがって、MPGの神経回路と生物学を理解することは、骨盤臓器の発達および成人機能に関する無数の臨床状態に関する前臨床試験にとって重要である。げっ歯類MPGのいくつかの優れた記述が公開されている7,8が、我々の経験では、一般的にこれらの記述は、動物の回復が必要な場合にこれらの構造の実験的解剖または操作を実際に知らせるのに十分なガイダンスを提供しないということです。さらに、 MPG 研究の大半は、雄のラットに焦点を当てています。.雌ラットでは、MPGは9個小さく、解剖学的ランドマークが異なるため、可視化と解剖に明確に合わせたガイドが必要です。
交感神経および副交感神経経路は、その解剖学的、特に前神経節性ニューロンの位置、胸部腰椎脊髄および脳幹(脳神経突起)および仙骨脊髄に位置する副交感神経前神経ニューロンに先ガンギオン性ニューロンを有する交感神経経路を有する。自律神経系の他のほとんどの領域では、その標的神経節ニューロンは、異なる交感神経または副交感神経節に位置する。しかし、MPGは交感神経副交感神経節を混合することには珍しいため、巨視的なスケールでは、胸部腰椎および仙骨脊髄領域の両方の前神経節軸索からの収束の部位である。したがって、我々は、各脊髄領域とMPGを結ぶこれらの主要な神経管の位置と説明をプロトコルに含め、実験分析またはこれらの神経成分の別々の操作を促進している。我々はまた、特に種間でこれらの神経節を比較する読者のために、例えば「機能的に仙骨」である脊髄前神経節ニューロンは、例えば、ミチュリューション、排便および陰茎の勃起中に活性および必要であり、仙骨セグメント10に排他的にではなく脊髄レベルL6-S1に位置している。同様に、L6およびS1底根神経節は、骨盤器官に主要な「仙骨」感覚入力を提供する。げっ歯類では、より多くのrostral神経回路からの感覚および前神経節の入力は、脊髄レベルL1およびL210に集中する。
ここでは、MPGと雄雌ラットの関連神経管にアクセスするためのプロトコルを説明し、特定のランドマークを説明するための回路図でこれをサポートしています。このプロトコルは、インビトロ研究のために組織を除去する実験コンテキストでこれらの構造への外科的アクセスを導く、例えば、分子特性または一次培養のためのMPGニューロンを単離する。また、固定性を有する心内灌流後のMPG除去に適応することもできるが、隣接する組織が血液を欠いているときに神経組織をより視覚化することが困難になるため、これはより困難な解剖である。このプロトコルは、これらの神経経路の実験的介入(例えば、神経切除、神経トレーサーの微小注射)のための外科的設定に統合することもできる。これらのタイプの解剖は、骨盤内臓の臨床状態を治療するための神経調節のための新しい標的およびアプローチが開発されているバイオエレクトロニクス医学の成長分野にとってますます重要である。我々は、まず雄ラットに対して完全なプロトコルを提示し、次に雌ラットに特化したプロトコルの複製を提示する。
骨盤器官の神経制御は、体細胞、副交感神経、交感神経および内臓感覚成分14、15、16、17を含む複雑な経路によって媒介される。これらの経路のほとんどは、MPGに由来するか、MPGを通過します。ここで概説する解剖議はMPG解剖学、関連する神経および近くの巨視的解剖学的ランドマークへの導入を提供する。後者は解剖学的な概略によって示される。MPG解剖に対する他のアプローチも成功するかもしれませんが、ここで説明したものは堅牢で、神経系のこの領域に新しい研究者に適していることがわかります。
プロトコルの最も重要な側面は、各主要な神経の正しい同定とMPG組織の完全な除去である。組織の注意深い観察と取り扱いにより、MPG組織は、解剖学的、分子および電気生理学的インビトロ研究18、19、20、21、22のために除去することができる。このプロトコルは、in vivo実験操作23、24、25に適応させることもできますが、この場合、神経節に関連する主要神経との接触を最小限に抑えたり、近くの血管構造を損傷したりするために細心の注意を払わなければならないことを示しています。実験が1つ以上の神経の中断によって選択的な神経変性を必要とする場合、分析の再インナーブおよび交論を防ぐために切断された神経を取り上げることを推奨する。この解剖プロトコルは、マウスにも利用することができ、同等の機能26、27、28を有するMPGもある。
神経解剖学的研究では、実験に適した組織学的固定剤を経皮的に浸透させた麻酔動物からMPGを解剖することによって、抗原および組織構造の最良の保存が得られる。しかし、組織の着色が失われるため、このプロセスの後に神経節と神経構造の同定がより困難になります。灌流後にこの解剖を試みる前に、非浸透動物から神経節を同定し解剖することに熟練することが推奨される。同様に、年齢と体の大きさに相当する動物の場合、MPGとその関連神経は女性でははるかに小さいので、最初に男性の解剖に堪能になることをお勧めします。
除去された組織が実際にMPGであることを検証するために、研究者はまず各初発神経の位置と特徴をチェックすることをお勧めします。多くのディスセクターは、骨盤神経と海綿神経をその場所で識別するのが最も簡単であると考えています。低胃神経と補助神経は、より繊細で、周囲の組織と区別することがより困難です。これらの神経が解剖中の問題のために利用できなくなったり、その構造に関して不確実性がある場合、最初のMPG解剖は従来の組織学(神経細胞体8の存在を確認する)と免疫組織化学(コリン作動性ニューロンと横動神経の両方が存在することを特定する)を特徴とすることが推奨される(図3)。主要な神経の正しい同定を検証するために、海綿神経はMPGに近い最初の部分の神経細胞体の高密度によって容易に同定される。これらのニューロンのほとんどは、コリン作動性のマーカーを発現します, ニトレ作動性ニューロン32,33.骨盤、低胃および補助神経は、非常に少数の神経細胞体34を有する。
この解剖を行う上で、いくつかの一般的な落とし穴があります。初心者のディスセクターが主要な神経やMPGのいずれかを見つけるのに問題がある場合、彼らは主要なランドマークを記述するステップに戻ることを奨励されています。微小構造を見つけることに集中し、巨視的な文脈を見失うことは非常に一般的です。最も一般的には、初心者のディスセクターは、解剖部位であまりにも遠いロストラルを移動するか、またはあまりにも「表面的」なままかのいずれか-すなわち、腹部の腹側開口部に近すぎる、より深い(すなわち、より多くの後側)構造を調べるのではなく。解剖中の一般的な問題は、解剖中の血管系への損傷である。出血が始まったら、出血が止まるまで綿先端のアプリケーターをソースの上にそっと持ち、解剖を再開する前に生理食布地で自由に領域を洗い流す。あまりにも多くの血液で汚染された場合、または出血が止まるのを待っている間に解剖が遅すぎる場合、MPGは実験に使用できない可能性があります。もう一つの一般的な解剖誤差は、MPGの可視化および除去を著しく損なう前立腺のカプセルへの損傷である。このカプセルは、綿先端のアプリケーターのみを使用していても、前立腺の側面壁から脂肪を除去しながら簡単に穿刺される非常に繊細な構造です。最後に、MPGに関連する主な神経は、それぞれを同定し、その後MPGの除去中に損傷を受けやすい。崩壊は、神経節除去の最終ステップ中に混乱する機会が少ないように、各神経を特定の順序で順番に単離するルーチンを開発することが奨励される。
この解剖は、特定の器官に対する補助神経の各成分の追跡、または骨盤神経節と骨盤器官8の間の様々な点にある多くの微小神経組織のそれぞれを同定することを求めなかった。これらは、特定の汚れを使用せずに生体内で視覚化することは非常に困難です。しかし、それらは器官に向かって各神経管に従うことによって除去することができ、そして神経節の位置を決定するためにポストホックの特定の神経染色を利用する。これらの微細神経節は、MPGと比較してニューロン集団のほんの一部しか含みていなくても、それらが最も近い器官に特定のタイプの入力を提供し得る。ここでは、これらの微細神経節も、骨盤臓器に移動するためにMPGを出る小さな神経管の多くがまだ広く受け入れられているという分野の制限に注意してください。さらに、同様に微細神経間の研究は、雌ラットではまだ行われていない。
要約すると、ここで提供されるプロトコルと回路図は、骨盤臓器への自律神経供給を提供する主要な構造と、腰仙骨底根からの感覚神経の主要な末梢導管を研究するためのツールを研究者に提供するMPGを介して骨盤臓器に移動する神経節。
The authors have nothing to disclose.
本論文では、国立衛生研究所所長室が支援し、条件を緩和するための周辺活動を刺激する(SPARC)プログラム、賞番号OT2OD023872。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。イースト博士の研究室でのベルトラン博士のフェローシップは、ニーム大学病院によって資金提供されました。 モンペリエ・ニームの医学部、フランセーズ・ド・チルギー協会(AFC)、ソシエテ・インターディスクリネール・フランコフォンd REA補助金協定No PCOFUND-GA-2013-609102の下で、欧州連合第7回枠組みプログラム(FP7/2007-2013)の「ウロディナミック・エ・ド・ペルビペリネロギー(SIFUD-PP)とピープル・プログラム(マリー・キュリー・アクションズ)」は、キャンパスが調整したPRESTIGEプログラムを通じてフランス。
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |