Summary
العقد الحوض ية الرئيسية تحتوي على الخلايا العصبية شبه المتعاطفة والمتعاطفة التي تبطن أعضاء الحوض. هنا نصف طريقة تشريح وتوفير التخطيطات لتحديد هذه العقدية والأعصاب المرتبطة بها. ويمكن تطبيق هذه الأساليب على التلاعب التجريبي لهذه العقد ية في الجسم الحي أو إزالة بعد الوفاة لمزيد من الدراسة.
Abstract
العقد الحوضية الرئيسية الثنائية (MPG؛ مرادف، عقد الحوض) هي المصدر الرئيسي للخلايا العصبية المتعاطفة مع ما بعد العقدة وشبه المتعاطفة التي تبطن أعضاء الحوض من القوارض. الهيكل المكافئ وظيفيا في البشر هو الضفيرة السفلية تحت المعدة. كما توفر العقد الحوضية الرئيسية الطريق الذي تصل به المحاور الحسية القطنية والعجزية إلى أعضاء الحوض. هذه العقد المعقدة والمختلطة يمكن أن تكون صعبة لتحديد وتشريح لمزيد من الدراسة التجريبية للآليات اللاإرابية العادية أو لإنشاء نماذج ما قبل السريرية من المرض, إصابة أو ألم الحشوي. هنا نصف بروتوكول للوصول إلى وتصور هذه العقدية والمسالك العصبية المرتبطة بها. نحن نقدم هذا البروتوكول مع التخطيطات لكل من الفئران الذكور والإناث، كما حجم العقدة والمعالم لتحديد تختلف بين الجنسين. يصف البروتوكول إزالة العقدة للدراسات المختبرية، ولكن يمكن دمج هذه الطريقة في بروتوكول استرداد جراحي للتدخلات التجريبية (على سبيل المثال، سحق الأعصاب، استئصال الأعصاب) أو لرسم خرائط الدوائر العصبية (على سبيل المثال، عن طريق الحقن المجهري من التتبع العصبي). كما نُظهر الهياكل الأساسية للدُمبة والأعصاب المرتبطة بها مباشرة بعد التشريح وبعد تلطيخ الهيستوكيميائية المناعية.
Introduction
الجرذ هو واحد من أفضل الأنواع المحددة المستخدمة في دراسة فسيولوجيا الأعضاء الحوضية والتشريح. في حين توجد موارد ممتازة لأوصاف هذه الأجهزة1،2، فإنها لا توفر عادة معلومات عن الهياكل العصبية ذات الصلة أو القيام بذلك في قرار غير كاف لتوجيه دراسة تجريبية. كما هو مفصل أدناه، فإن تنظيم العقد اللاإرابية التي تنظم وظيفة عضو الحوض يختلف تمامًا عن بقية الجهاز العصبي اللاإراني، مما يجعل من الصعب الاستدلال بدقة على ميزات تعصيب الحوض من المعلومات العصبية الذرية المتاحة للجُنْجال اللاإرابية الأخرى. هذا النقص في الموارد لتوجيه الباحثين دخول هذا المجال قد تباطأ البحوث على التنظيم العصبي لأعضاء الحوض. هنا نصف بروتوكولات للوصول إلى هذه المنطقة من الجهاز العصبي لمزيد من الدراسات المختبرية أو التدخل التجريبي.
العقد الحوضية الرئيسية الثنائية (MPG؛ المرادفات: العقد الحوضي؛ العقد شبه عنق الرحم [أنثى]؛ العقدة Frankenhäuser [أنثى]) هي المصدر الرئيسي للخلايا العصبية المتعاطفة مع ما بعد ganglionic وشبه المتعاطفة تبطن أعضاء الحوض من القوارض. السفلي الضفيرة تحت المعدة السفلي يضم هيكل الخلايا العصبية ما يعادلها في البشر3،4،5،6. الإسقاطات الحسية من القطني والعقد الظهرية الظهرية أيضا السفر عبر MPG للوصول إلى أعضاء الحوض. ولذلك، فهم الدوائر العصبية والبيولوجيا من MPG أمر بالغ الأهمية للدراسات قبل السريرية على عدد لا يحصى من الشروط السريرية المتعلقة بالتنمية وظيفة الكبار من أعضاء الحوض. وقد نشرت العديد من أوصاف ممتازة من القوارض MPG7،8، ولكن تجربتنا هي أن هذه الأوصاف بشكل عام لا توفر دائما ما يكفي من التوجيه لإبلاغ عمليا تشريح التجريبية أو التلاعب في هذه الهياكل عندما يتطلب استرداد الحيوان. وعلاوة على ذلك، تركز غالبية دراسات MPG على الفئران الذكور. في الفئران الإناث ، فإن MPG أصغر9 ولها معالم تشريحية متميزة ، وبالتالي تتطلب دليلًا مصممًا خصيصًا للتصور والتشريح.
تتميز المسارات المتعاطفة وشبه المتعاطفة بتشريحها ، وتحديدًا موقع الخلايا العصبية قبل الجماع ، مع مسارات متعاطفة لها خلايا عصبية قبل العقدة في الحبل الشوكي الصدري - القطني والخلايا العصبية شبه متعاطفة قبل العقدة الموجودة في جذع الدماغ (إسقاطات الأعصاب القحفية) والحبل الشوكي العجزي. في معظم المناطق الأخرى من النظام اللاإرابي, وتقع الخلايا العصبية العقدة المستهدفة في العقد ية متعاطفة متميزة أو شبه متعاطفة. ومع ذلك ، فإن MPG غير عادية في كونها مختلطة شبه متعاطفة مع العقد ، وبالتالي على نطاق العياني هي مواقع التقارب من محاور ما قبل الجماع من كل من المناطق الصدرية القطنية والعمود الفقري العجزي. لذلك أدرجنا في بروتوكولاتنا موقع ووصف هذه المسالك العصبية الأولية التي تربط كل منطقة من مناطق العمود الفقري مع MPG ، مما يسهل التحليل التجريبي أو التلاعب المنفصل بهذه المكونات العصبية. نلاحظ أيضا للقراء على وجه التحديد مقارنة هذه العقد عبر الأنواع, أن في القوارض الخلايا العصبية قبل العقدة الشوكية التي هي 'sacral وظيفيا', على سبيل المثال, نشطة ومطلوبة خلال micturition, التغوط والانتصاب القضيب, وتقع في مستويات العمود الفقري L6-S1 بدلا من حصرا في الأجزاء sacral10; وبالمثل L6 و S1 الظهرية الجذر العقدية توفير الرئيسية 'sacral' المدخلات الحسية لأعضاء الحوض. في القوارض ، ويتركز المدخلات الحسية وpreganglionic من الدوائر العصبية أكثر rostral في مستويات العمود الفقري L1 و L210.
هنا نصف بروتوكول للوصول إلى MPG والمسالك العصبية المرتبطة بها في الفئران الذكور والإناث، ودعم هذا مع التخطيطات لتوضيح معالم محددة. هذا البروتوكول يوجه الوصول الجراحي إلى هذه الهياكل في سياق تجريبي لإزالة الأنسجة للدراسات المختبرية، على سبيل المثال، عزل الخلايا العصبية MPG للتوصيف الجزيئي أو الثقافة الأولية. ويمكن أيضا أن تتكيف مع إزالة MPG بعد التروية داخل القلب مع مثبت، على الرغم من أن هذا هو تشريح أكثر صعوبة لأن الأنسجة العصبية يصبح أكثر صعوبة لتصور عندما تكون الأنسجة المجاورة خالية من الدم. يمكن دمج هذا البروتوكول أيضًا في بيئة جراحية للتدخل التجريبي لهذه المسارات العصبية (على سبيل المثال، استئصال الأعصاب، والحقن المجهري للتتبع العصبي). وتتزايد أهمية هذه الأنواع من التشريح اتّساناً للمجال المتنامي للطب الإلكتروني الحيوي، حيث يجري تطوير أهداف ومقاربات جديدة للتشكيل العصبي لمعالجة الحالات السريرية لأحشاء الحوض11. نقدم البروتوكول الكامل أولاً للفئران الذكور، ثم تكرار للبروتوكول المصمم خصيصًا للفئران الأنثوية.
Protocol
ويتعين إجراء جميع الإجراءات وفقا ً لمتطلبات الهيئة المؤسسية والتمويلية للتجارب على الحيوانات. وقد وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة ملبورن (البروتوكول رقم 1814639) على استخدام الحيوانات في هذا التشريح وبروتوكول القتل الرحيم.
ملاحظة: تم إجراء التشريح الموضح هنا على فئران سبراغ-داولي البالغة (حوالي 10 أسابيع) (مرفق الحيوانات للعلوم الطبية الحيوية، جامعة ملبورن)، وزنها 280 غرام (أنثى) و350 جم (ذكر). قبل تشريح هذه الأجزاء، تم قتل الفئران في غرفة CO2 لمدة 4-5 دقيقة. إذا كان تشريح الأنسجة من الحيوان الذي خضع للنفاذ عبر cardial مع مثبت، واتخاذ الاحتياطات اللازمة لحماية المشغل من التعرض للمثبت، أي إجراء تشريح في خزانة الدخان أو مجلس الوزراء downdraft وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. وقد تم نشر بروتوكول للتعامي عبر السيارة بالتفصيل12.
1. العقدة الحوض الرئيسية والأعصاب المجاورة: الوصول والاستئصال في الفئران الذكور
ملاحظة: يوضح الشكل 1 المعالم التشريحية لتصور MPG في الفئران الذكور.
- الوصول إلى تجويف البطن والحوض
- ضع الجرذ في وضع ية وإمكانية الوصول إلى البطن والحوض من خلال شق في نغر خط الوسط، مع الحرص على تجنب تلوث الحقل الجراحي بالفرو.
- نقل أعضاء البطن بلطف إلى جانب واحد باستخدام ملقط أو تطبيق القطن يميل. لاحظ موقع الفصوص البطنية لغدة البروستاتا والمثانة البولية.
- نقل الحويصلة المنوية إلى الجانب المنضدي.
- قطع vas deferens لتوفير وصول أفضل إلى المنطقة التي تقع فوق العقدة.
ملاحظة: من هذه النقطة من تشريح، يجب أن لا تجف الأنسجة. الحفاظ على الأنسجة رطبة مع المالحة الفسيولوجية (لتشريح الأنسجة الطازجة) أو مثبت (لالحيوان ثابت التروية). الحفاظ على الأنسجة رطبة مع المالحة لا يفيد فقط بنية الأنسجة ولكن أيضا يجعل تشريح أسهل كما الأعصاب الجافة هي أكثر هشاشة والمسيل للدموع بسهولة أكبر أثناء التعامل معها. - تحديد الفص الضلفى لغدة البروستاتا ، على السطح الرجولي الذي هو موقع العقدة ؛ هذا لن يكون مرئياً بعد.
- لتصور العقدة، واضحة بعناية بعيدا الأنسجة بالقرب من وoveroverthe العقدة. إذا لزم الأمر، استخدم المسحب للحفاظ على حقل التشريح واضحًا.
- إزالة مجموعة قريبة من الأنسجة الدهنية وفتح اللفافة الجانبية للحوض.
- تشريح MPG والأعصاب المرتبطة به
- تحديد المواقع التالية التي توفر معالم للخطوات التالية من تشريح: الفص الظهري من غدة البروستاتا (تقع العقدة على سطح هذا الفص، أكثر قليلا من caudal من التقاطع بين الحويصلات المنوية و البروستاتا) والحويصلات المنوية (حيث تتلاقى في خط الوسط يشير إلى موقع العقدة على محور الحيوان rostrocaudal).
- كما هو مطلوب من هذه النقطة، وإزالة بعناية أي الأنسجة التي تعوق الرؤية الكاملة للهياكل العصبية، وتجنب الأضرار التي لحقت كبسولة رقيقة من غدة البروستاتا أو الأوعية الرئيسية.
- تحديد العصب الحوض من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
- العثور على الوريد الحرقفي الداخلي وفرعها غرامة إسقاط نحو MPG والمثانة. يعمل هذا الفرع الوعائي بالتوازي مع العصب الحوضي، ويكون جزءًا منه أحيانًا، ثم يجتاز العقدة.
- ضع الملقط ذات الرؤوس الدقيقة تحت عصب الحوض وحرك ملقط هُنا بلطف لتحريره من الأنسجة المحيطة.
ملاحظة: قد يكون من الممكن أيضًا عزل العصب الحوضي عن الوعاء الصغير الذي يسير بالتوازي معه، ولكن بالنسبة لمعظم أنواع التجارب، فإن هذا ليس ضروريًا. تأكد من أن الهيكل هو العصب الحوضي من خلال المشاهدة تحت التكبير العالي لتحديد أن العصب يحتوي على العديد من اللفافات المجمعة بشكل فضفاض ، والتي يتم تمييزها بسهولة تحت المجهر التشريحي وهي سمة من سمات الحوض العصب ، كما لا شيء من الأعصاب الرئيسية الأخرى المرتبطة العقدة تظهر هذا fasciculation واضحة.
- تحديد العصب الكهفي من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
- بعد اتباع العصب الحوضي إلى تقاطعه مع العقدة ، اتبع العصب الكهفي أثناء انتقاله عبر البروستاتا ثم caudally نحو الأجسام الكهفية للقضيب.
- إذا سمح التكبير المجهر, لاحظ أن هناك مجموعة صغيرة من الأعصاب الحساسة الناشئة من العقدة بين الحوض والأعصاب الكهفية; هذه هي الأعصاب المستقيم التي تنتقل إلى الأمعاء السفلية.
- تحديد العصب تحت المعدة من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
- حدد مكان انضمام العصب تحت المعدة إلى العقدة عند حافتها القحفية، بعد السفر إلى جانب الحالب.
- تأكد من أن العصب تحت المعدة هو أرق بكثير من الأعصاب الحوض أو كهفي ولا يرافقه الأوعية الكبيرة.
- تحديد MPG من خلال تصور الميزات التالية.
- تصور الحواف البطنية الظهرية والقحفية للالعقدة، وتشكيل شكل مثلث.
- تأكيد موقع كل عصب رئيسي: أعصاب الحوض الناشئة من الحافة الظهرية للالعقدة، والعصب الكهفي في الزاوية الأكثر جُدْية من العقدة، والعصب السفلي من حافته القحفية، والأعصاب التبعية الخارجة من العقدة حافة البطن.
- تحديد الأعصاب التبعية من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
- بعد إزالة الأنسجة لتمكين تصور الحافة البطنية للالعقدة ، حدد مجموعة من الأعصاب التي تُعرض نحو المسالك البولية والإنجابية.
- إذا سمح التكبير المجهر، حدد مجموعة واحدة من الأعصاب التي تدخل بين فصوص البروستاتا ومجموعة واحدة rostral بين الحويصلة المنوية والمثانة.
- إزالة MPG مع الأعصاب المرتبطة بها
- ملقط الشريحة بلطف بين العقدة وغدة البروستاتا الكامنة، مع الحرص على عدم ثقب كبسولة رقيقة من البروستاتا. تعطيل أي اتصالات بين العقدة والبروستاتا.
- مسح أي اتصالات نهائية مع الأنسجة المحيطة لأطوال الأعصاب اللازمة للتجربة، ثم قطع كل عصب.
- باستخدام ملقط دقيقة، حرك العقدة بأعصابها إلى الحل المناسب للتجربة وتأكد من أن كل من الأعصاب الرئيسية سليمة.
2. العقدة الحوض الرئيسية والأعصاب المجاورة: الوصول والاستئصال في الفئران الإناث
ملاحظة: يوضح الشكل 2 المعالم التشريحية لتصور MPG في الفئران الإناث.
- الوصول إلى تجويف البطن والحوض
- ضع الجرذ في وضع ية وإمكانية الوصول إلى البطن والحوض من خلال شق في نغر خط الوسط، مع الحرص على تجنب تلوث الحقل الجراحي بالفرو.
ملاحظة: من هذه النقطة من تشريح، يجب أن لا تجف الأنسجة. الحفاظ على الأنسجة رطبة مع المالحة الفسيولوجية (لتشريح الأنسجة الطازجة) أو مثبت (لالحيوان ثابت التروية). - نقل أعضاء البطن بلطف إلى جانب واحد باستخدام ملقط أو تطبيق القطن يميل. لاحظ موقع قرن الرحم والمثانة البولية والمستقيم.
- قطع أوعية المبيض والرحم والتراجع عن قرن الرحم.
- أدخل الفضاء البايوني وإزالة بلطف بعيدا مجموعة من الأنسجة الدهنية الموجودة بالقرب من عنق الرحم.
- ضع الجرذ في وضع ية وإمكانية الوصول إلى البطن والحوض من خلال شق في نغر خط الوسط، مع الحرص على تجنب تلوث الحقل الجراحي بالفرو.
- تشريح MPG والأعصاب المرتبطة به
- تحديد الجدار الجانبي لعنق الرحم، فقط caudal إلى تقاطعه مع قرون الرحم. هذه المنطقة هي المعلم الرئيسي لتحديد موقع MPG على محور الحيوان rostrocaudal.
- كما هو مطلوب من هذه النقطة، وإزالة بعناية أي الأنسجة التي تعوق الرؤية الكاملة للهياكل العصبية، وتجنب الأضرار التي لحقت الأوعية الرئيسية.
- تحديد العصب الحوض من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
- العثور على الوريد الحرقفي الداخلي وفرعها غرامة إسقاط نحو MPG والمثانة. يعمل هذا الفرع بالتوازي مع العصب الحوضي، ويكون جزءًا منه أحيانًا، ثم يجتاز العقدة.
- تأكد من أن الهيكل هو العصب الحوضي من خلال المشاهدة تحت التكبير العالي لتحديد أن العصب يحتوي على العديد من اللفافات المجمعة بشكل فضفاض ، والتي يتم تمييزها بسهولة تحت المجهر التشريحي وهي سمة من سمات الحوض العصب ، كما لا شيء من الأعصاب الرئيسية الأخرى المرتبطة العقدة تظهر هذا fasciculation واضحة.
- تحديد العصب تحت المعدة من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
- حدد مكان انضمام العصب تحت المعدة إلى العقدة عند حافتها القحفية، بعد السفر إلى جانب الحالب.
- تأكد من أن العصب تحت المعدة هو أرق بكثير من الأعصاب الحوض أو كهفي ولا يرافقه الأوعية الكبيرة.
- تحديد العصب الكهفي من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
- بعد اتباع العصب الحوضي إلى تقاطعه مع العقدة ، اتبع العصب الكهفي أثناء سفره بشكل سريع على طول الجدار الجانبي لعنق الرحم نحو المهبل.
- إذا سمح التكبير المجهر, لاحظ أن هناك مجموعة صغيرة من الأعصاب الحساسة الناشئة من العقدة بين الحوض والأعصاب الكهفية; هذه هي الأعصاب المستقيم التي تنتقل إلى الأمعاء السفلية.
- تحديد الأعصاب التبعية من خلال تصور المعالم والميزات التالية.
ملاحظة: الأعصاب التبعي من الصعب أن نرى ولكن المشروع من الجانب الأنسي من MPG. بعد إزالة الأنسجة لتمكين تصور الحافة البطنية للالعقدة ، حدد مجموعة من الأعصاب الحساسة للغاية التي تُعرض نحو المسالك البولية والإنجابية. - تحديد MPG من خلال تصور الميزات التالية.
- تصور الحواف البطنية الظهرية والقحفية للالعقدة، والتي تشكل شكلًا مثلثًا.
- تأكيد موقع كل عصب رئيسي: أعصاب الحوض الناشئة من الحافة الظهرية للالعقدة، والعصب الكهفي في الزاوية الأكثر جُدْية من العقدة، والعصب السفلي من حافته القحفية، والأعصاب التبعية الخارجة من العقدة حافة البطن.
- إزالة MPG مع الأعصاب المرتبطة بها
- ضع الملقط ذات الرؤوس الدقيقة تحت عصب الحوض وحرك ملقط هُنا لتحرره من عنق الرحم الأساسي والأنسجة المحيطة.
ملاحظة: قد يكون من الممكن أيضًا عزل العصب الحوضي عن الوعاء الصغير الذي يسير بالتوازي معه، ولكن بالنسبة لمعظم أنواع التجارب، فإن هذا ليس ضروريًا. إذا كان يدل على تشريح، وضع خياطة تحت العصب الحوض، لتسهيل التصور. - كرر العملية للعصب الكهفي ، ثم العصب تحت المعدة ، وأخيرا الأعصاب التبعية.
- الشرائح بلطف ملقط بين العقدة وعنق الرحم الكامنة. تعطيل أي اتصالات بين العقدة وعنق الرحم.
- مسح أي اتصالات نهائية مع الأنسجة المحيطة لأطوال الأعصاب اللازمة للتجربة، ثم قطع كل عصب.
- باستخدام ملقط دقيقة، حرك العقدة بأعصابها إلى الحل المناسب للتجربة وتأكد من أن كل من الأعصاب الرئيسية سليمة.
- ضع الملقط ذات الرؤوس الدقيقة تحت عصب الحوض وحرك ملقط هُنا لتحرره من عنق الرحم الأساسي والأنسجة المحيطة.
3. تأكيد مكونات العقدة (اختياري)
- بعد إزالة العقدة ، تزج العقدة في مثبت الأنسجة التقليدية (على سبيل المثال ، 4 ٪ الفورمالين المخزنة) لمدة لا تقل عن 1 ساعة ، وغسل التثبيتمع 0.1 M العازلة الفوسفات ومعالجة الأنسجة للتبذير والفلورسة المناعية الكيمياء ، كما سبق وصفه13.
ملاحظة: العديد من الأجسام المضادة عالية الجودة التي تتعرف على وجه التحديد على هذه العلامات العصبية الثلاثة متوفرة تجاريًا. انظر جدول المواد للكواشف المستخدمة في وضع العلامات الموضحة في الشكل 3. - بدلا من ذلك، عملية العقد سليمة (wholemounts) لالكيمياء الهيستوكيميائية المناعية باستخدام طريقة مماثلة على النحو الوارد أعلاه ولكن زيادة أوقات حضانة للأجسام المضادة إلى 4 أيام (الأجسام المضادة الأولية) و 2 أيام (الأجسام المضادة الثانوية).
- لإثبات مجموعة كبيرة من المحاور الحسية، استخدم الأجسام المضادة ضد الببتيد المرتبط بالجينات الكلسيتونين (CGRP).
ملاحظة: التخفيف الموصى به للجسم المضاد المستخدم في هذه الدراسة هو 1:5,000. - لإثبات الخلايا العصبية المتعاطفة مع نورادريني، استخدم الأجسام المضادة ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH).
ملاحظة: التخفيف الموصى به للجسم المضاد المستخدم في هذه الدراسة هو 1:5,000. - لإثبات عدد كبير من الخلايا العصبية الكولينية، واستخدام الأجسام المضادة ضد أكسيد النيتريك الخلايا العصبية synthase (NOS).
ملاحظة: التخفيف الموصى به للجسم المضاد المستخدم في هذه الدراسة هو 1:500.
Representative Results
لن يزيل التشريح الناجح الجسم الكامل لـ MPG سليمًا فحسب ، بل سيحتفظ أيضًا بالجزء الأول من كل من الأعصاب الرئيسية التي لا تزال متصلة. هذه الأعصاب هي مؤشرات قيمة للاتجاه العقدة في الجسم الحي، وبالتالي توفر معلومات أساسية لأنواع كثيرة من الدراسات التشريحية (على سبيل المثال، أنماط التعبير رسم الخرائط أو التغيرات الخلوية بعد اضطراب تجريبي). على الرغم من أن الحفاظ على الأعصاب المرتبطة يمكن أن تكون أقل أهمية بالنسبة لبعض أنواع التجارب (على سبيل المثال، تفكك العقدة لثقافة الخلايا العصبية المعزولة)، وجود الأعصاب يوفر أيضا وسيلة للتعامل مع العقدة دون لمس (وربما يحتمل إتلاف) الهيئات الخلية العصبية.
سيكون للتشريح غير الناجح قُدمة غير مكتملة أو تالفة، أو حيث لم تعد الأعصاب الأولية متصلة. من الممكن أيضًا أن تتلف العقد أو الأعصاب دون علم أثناء التشريح ، إما لأن الضرر المادي دقيق جدًا بحيث لا يمكن اكتشافه تحت المجهر التشريحي أو لأن الضرر لا يصبح واضحًا إلا أثناء أنواع معينة من المقالات. على سبيل المثال، إذا أصبح نسيج العقدة جافًا أثناء التشريح، فقد يظهر النسيج طبيعيًا أثناء المناولة لاحقًا، ولكنه سيظهر مستويات عالية من الفلورسة غير المحددة على السطح.
وترد أمثلة من MPG تشريح في الشكل 3، الذي يقدم أمثلة على كامل MPG تصور كسماكة كاملة العقدة(الشكل 3A)وMPG التي تم cryosectioned لأداء الفلورسينالمناعي لإثبات الخلايا العصبية noradren ergic وcholinergic(الشكل 3B، C).
الشكل 1: المعالم التشريحية لتصور MPG في الفئران الذكور. 1، الحويصلة المنوية؛ 2, المثانة البولية; 3, الغدة التخثر; 4 و 5، والأعصاب التبعية؛ 6، البروستاتا (الفص البطني)؛ 7, العصب الكهفي; 8، vas deferens؛ 9، مجرى البول. 10, عضلة بولبافيرينوسوس; 11, ischiocavernosus العضلات; 12, الأعصاب المستقيم; 13، المختطف caudae externus؛ 14, العقدة الحوضية الرئيسية; 15, عصب الحوض; 16، المختطف caudae internus؛ 17, العصب تحت المعدة; 18، الوريد الحرقفي الداخلي؛ 19، المرن caudae brevis؛ 20، المرن caudae longus؛ 21، الحالب. 22، بووا الرئيسية؛ 23, الأورطا البطني; 24، أقل من افينا الوريد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المعالم التشريحية لتصور MPG في الفئران الإناث. 1، القولون القاصد؛ 2, المثانة البولية; 3، والجسم الرحمي. 4, العصب تحت المعدة; 5, الأعصاب التبعي; 6، العقدة الحوضية الرئيسية؛ 7, العصب الكهفي; 8، المهبل. 9، مجرى البول. 10، المستقيم؛ 11، المختطف caudae externus؛ 12, الأعصاب المستقيم; 13، المرن caudae brevis؛ 14, عصب الحوض; 15، الوريد الحرقفي الداخلي؛ 16، المختطف caudae internus؛ 17، المرن caudae longus؛ 18, الشريان الحرقفي الخارجي; 19، الحالب؛ 20، بووا الرئيسية؛ 21، قرن الرحم. 22، أورطا البطن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحمل علامة مناعية كيميائية MPG من الفئران الذكور البالغين. وقد تم تصور جميع الاستعدادات مع مجهر الفلورسينس واسعة النطاق التقليدية مجهزة كاميرا أحادية اللون، ثم الملونة رقميا. (أ)Wholemount (سمك كامل), MPG ثابت مع الأعصاب المرتبطة بها, مناعة histochemically وصفت للأعصاب الحسية التي تعبر عن الببتيد الكالسيتونين الجينات ذات الصلة (CGRP); 1، عصب الحوض (تبين اللفافات متعددة)؛ 2, العصب الكهفي; 3, العصب تحت المعدة; 4, الأعصاب التبعي; 5, الأعصاب المستقيم; 6، العقدة الحوضية الرئيسية (MPG). (B, C) أقسام التبريد (14 ميكرومتر) من MPG الثابتة، وصفت مناعية هيكيميائيا لإظهار طبيعة نورادريني-كوليني مختلطة من العقدة؛ (ب)الخلايا العصبية نورادرينسية التي أظهرتها الأجسام المضادة للهيدروكسيلاز التيروزين و (C)مجموعة كبيرة من الخلايا العصبية الكوليني من قبل الأجسام المضادة لأكسيد النيتريك الخلايا العصبية synthase. يمثل شريط المعايرة(A)1000 ميكرومتر ،(B ، C)200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يتم التوسط السيطرة العصبية لأعضاء الحوض من خلال مسارات معقدة بما في ذلك المكونات الحسية الجسدية والمتعاطفة والمتعاطفة والحشوية14،15،16،17. معظم هذه المسارات تنشأ في أو تمر عبر MPG. توفر بروتوكولات التشريح المبينة هنا مقدمة لتشريح MPG ، والأعصاب المرتبطة بها والمعالم التشريحية العيانية القريبة ؛ ويتضح هذا الأخير من قبل التخطيطات التشريحية. قد تكون الأساليب الأخرى لتشريح MPG ناجحة أيضًا ، لكننا نجد أن الطريقة الموصوفة هنا قوية ومناسبة لباحث جديد في هذا المجال من الجهاز العصبي.
الجوانب الأكثر أهمية في البروتوكول هي التحديد الصحيح لكل عصب رئيسي والإزالة الكاملة لأنسجة MPG. مع عرض دقيق والتعامل مع الأنسجة، يمكن إزالة الأنسجة MPG للدراسات التشريحية والجزيئية والكهروفيزيولوجية في المختبر18،19،20،22. يمكن أيضًا تكييف البروتوكول للتلاعب التجريبي في الجسم الحي23،24،25، مع الإشارة إلى أنه في هذه الحالة ، يجب توخي الحذر الشديد لتقليل الاتصال مع الأعصاب الأولية المرتبطة بالعقدة أو تلف الأوعية الدموية القريبة. إذا كانت التجربة تتطلب الانحلال الانتقائي عن طريق انقطاع واحد أو أكثر من الأعصاب ، فمن المستحسن لligate العصب المقطوع لمنع reinnervation والخلط بين التحليلات. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول تشريح للفأرة، حيث يوجد أيضا MPG مع وظيفة مماثلة26،27،28.
بالنسبة للدراسات التشريحية العصبية ، يتم الحصول على أفضل الحفاظ على المستضدات وبنية الأنسجة عن طريق تشريح MPG من الحيوان المؤكّد الذي تم التضاهى عبر البطاقة مع مثبت الأنسجة المناسب للتجربة29؛ ومع ذلك ، فإن تحديد العقدة والهياكل العصبية أكثر صعوبة بعد هذه العملية ، حيث يتم فقدان تلوين الأنسجة. من المستحسن أن تصبح بارعة في تحديد وتشريح العقدة من الحيوانات غير المشبعة قبل محاولة هذا التشريح بعد التروية. وبالمثل، فمن المستحسن أن تصبح أولا ً يتقن في تشريح في الذكور لأنه بالنسبة للحيوانات من العمر المكافئ وحجم الجسم، وMPG والأعصاب المرتبطة بها هي أصغر بكثير في الإناث.
للتحقق من أن الأنسجة التي تمت إزالتها هي في الواقع MPG ، ينصح الباحث أولاً بالتحقق من موقع وميزات كل عصب أساسي. العديد من dissectors تجد العصب الحوض يُعد العصب الكهفي أسهل لتحديد في الموقع; الأعصاب تحت المعدة والإكسسوارات هي أكثر حساسية وأكثر صعوبة للتمييز عن الأنسجة المحيطة بها. إذا لم تعد هذه الأعصاب متوفرة بسبب مشاكل أثناء التشريح ، أو إذا كان هناك عدم يقين بشأن هيكلها ، فمن المستحسن أن تتميز التشريحات الأولية MPG مع الأنسجة التقليدية (لتأكيد وجود أجسام الخلايا العصبية8)وثانيا مع الخلايا المناعية (لتحديد أن الخلايا العصبية الكولينية ونورادرينورجيا موجودة30،31)(الشكل 3). للتحقق من صحة التحديد الصحيح للأعصاب الرئيسية, يتم التعرف بسهولة على الأعصاب الكهفية من خلال كثافة عالية من الهيئات خلية الخلايا العصبية في الجزء الأولي على مقربة من MPG; معظم هذه الخلايا العصبية التعبير عن علامات من الكوليني, الخلايا العصبية اللاترجية32,33. والحوض, الأعصاب تحت المعدة والملحقات لديها عدد قليل جدا من الهيئات خلية الخلايا العصبية34.
هناك العديد من المزالق الشائعة في تنفيذ هذا التشريح. إذا كان المبتدئين dissectors لديها مشاكل في العثور على أي من الأعصاب الرئيسية أو MPG، يتم تشجيعهم على العودة إلى الخطوات التي تصف المعالم الرئيسية. من الشائع جدا أن تصبح تركز على إيجاد الهياكل المجهرية التي يفقد المرء المسار من السياق العياني. الأكثر شيوعا، dissectors المبتدئ إما التحرك بعيدا جدا rostral في موقع تشريح أو تبقى أيضا 'سطحية'-أي، قريبة جدا من فتح البطن، بدلا من دراسة أعمق (أي، أكثر الظهرية) الهياكل. مشكلة شائعة أثناء تشريح هو تلف الأوعية الدموية أثناء تشريح. إذا بدأ النزيف، احمل تطبيقًا ذو رؤوس قطنية بلطف على المصدر حتى يتوقف النزيف، ثم اغسل المنطقة بطبقة مُلِكية قبل إعادة التَّدَرَّد. من الممكن أن لا تكون MPG قابلة للاستخدام في التجارب إذا كانت ملوثة بالكثير من الدم أو إذا تأخر التشريح لفترة طويلة جدًا أثناء انتظار توقف النزيف. خطأ تشريح شائع آخر هو تلف كبسولة غدة البروستاتا التي تضعف بشكل كبير التصور MPG وإزالتها. هذه الكبسولة هي بنية حساسة للغاية يتم ثقبها بسهولة أثناء إزالة الدهون من الجدار الجانبي للبروستاتا ، حتى لو كان ذلك باستخدام قضيب ذو رؤوس قطنية فقط. وأخيراً، تتلف بسهولة الأعصاب الرئيسية المرتبطة MPG أثناء عملية تحديد كل واحد ثم أثناء إزالة MPG. يتم تشجيع القطاعات على تطوير روتين يتم بموجبه عزل كل عصب بدوره ، بترتيب معين ، بحيث تكون هناك فرصة أقل للارتباك خلال الخطوات النهائية لإزالة العقدة.
لم يسع هذا التشريح إلى تتبع كل مكون من مكونات الأعصاب الملحقة إلى أعضاء محددة ، أو تحديد كل من الميكروجانجليا العديدة التي تقع في نقاط مختلفة بين العقد الحوضي وأعضاء الحوض8. هذه هي صعبة جدا لتصور في الجسم الحي دون استخدام بقع محددة; ومع ذلك ، يمكن إزالتها عن طريق اتباع كل من المسالك العصبية نحو الأعضاء ، واستخدام بقع عصبية محددة بعد مخصص لتحديد موقع العقدة. هذه microganglia, على الرغم من أن تضم سوى جزء صغير من السكان العصبية بالمقارنة مع MPG, قد توفر أنواع محددة من المدخلات إلى الأجهزة التي هي الأكثر قربا. نلاحظ هنا وجود قيود في هذا المجال أنه لا هذه microganglia ولا العديد من المسالك العصبية الصغيرة الخروج من MPG للسفر إلى أعضاء الحوض بعد أسماء مقبولة على نطاق واسع. وعلاوة على ذلك، لم تجر بعد دراسة مفصلة مماثلة للميكروجانجليا على الفئران الإناث.
وخلاصة القول، بروتوكول والمخططات المقدمة هنا تزويد الباحثين مع أدوات لدراسة الهياكل الأولية توفير إمدادات الأعصاب اللاإرادي لأعضاء الحوض، فضلا عن القنوات الطرفية الرئيسية للأعصاب الحسية من جذر الظهرية lumbosacral العقد التي السفر عبر MPG إلى أعضاء الحوض.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم البحوث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل مكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة ، وتحفيز النشاط المحيطي لتخفيف الظروف (SPARC) البرنامج ، رقم الجائزة OT2OD023872. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم تمويل زمالة الدكتور برتراند في مختبر الدكتور كيست من قبل: المستشفى الجامعي في نيم، كلية الطب في مونبلييه نيم، والرابطة الفرنسية للأبحاث العلمية ،وجمعية Interdisciplinaire الفرنكوفونية في دورودين أمييك ودو بيلفيرينلوجيلوجي (SIFUD-PP) وبرنامج الشعب (ماري كوري الإجراءات) من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) بموجب اتفاق منحة REA No PCOFUND-GA-2013-609102، من خلال برنامج بريستيج الذي ينسقه الحرم الجامعي فرنسا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
- Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
- Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
- Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
- Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
- Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
- Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
- Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
- Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
- Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
- Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
- Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P. Neuromodulation of urinary tract function. New England Journal of Medicine. 380 (21), 2067-2069 (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
- Dail, W. G., Minorsky, N. Composition of the pelvic nerve. Experimental Neurology. 92 (1), 278-283 (1986).
- Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
- Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
- Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
- Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
- Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
- Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
- Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
- Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
- Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
- Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
- Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
- Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
- Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
- Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
- Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
- Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).
