Основные тазовых ганглиев содержат парасимпатические и симпатической нейронов, что innervate органов малого таза. Здесь мы описываем метод вскрытия и предоставляем схемы для идентификации этих ганглиев и связанных с ними нервов. Эти методы могут быть применены к экспериментальной манипуляции этих ганглиев in vivo или удаления посмертнодля для дальнейшего изучения.
Двусторонние крупные тазовыгие ганглии (MPG; синоним, тазовые ганглии) являются основным источником постганглионических симпатических и парасимпатических нейронов, иннервирующих органов таза грызунов; функционально эквивалентной структурой у человека является низкое гипогастрическое сплетение. Основные тазовы ганглии также обеспечивают маршрут, по которому поясничные и сакральные сенсорные аксоны достигают органов малого таза. Эти сложные, смешанные ганглии могут оказаться сложными для выявления и вскрытия для дальнейшего экспериментального изучения нормальных вегетативных механизмов или для установления доклинических моделей болезни, травмы или висцеральной боли. Здесь мы описываем протокол для доступа и визуализации этих ганглиев и связанных с ними нервных путей. Мы предоставляем этот протокол со схемами для мужчин и женщин крыс, так как размер ганглия и ориентиры для идентификации различаются между полами. Протокол описывает удаление ганглия для исследования in vitro, но этот метод может быть интегрирован в хирургический протокол восстановления для экспериментальных вмешательств (например, раздавка нерва, резекция нерва) или для картирования нейрональных цепей (например, путем микроинъекции нервных трассировок). Мы также демонстрируем первичные структуры ганглия и связанных с ним нервов сразу же после вскрытия и после иммуногистохимического окрашивания.
Крыса является одним из наиболее характерных видов, используемых в изучении физиологии органов малого таза и анатомии. Хотя отличные ресурсы существуют для описания этих органов1,2, они, как правило, не предоставляют информацию о связанных нейронных структур или сделать это в недостаточном разрешении для руководства экспериментального исследования. Как подробно описано ниже, организация вегетативных ганглиев, которые регулируют функцию органов малого таза, сильно отличается от остальной части вегетативной нервной системы, что затрудняет точное вывод функций иннервации таза из нейроанатомической информации, доступной для других вегетативных ганглиев. Этот дефицит ресурсов для руководства исследователей, входящих в эту область, возможно, замедлилисследования по нейронной регуляции органов малого таза. Здесь мы описываем протоколы для доступа к этой области нервной системы для дальнейшего исследования in vitro или экспериментального вмешательства.
Двусторонние крупные тазовыгие ганглии (MPG; синонимы: тазовыгие ганглии; парацервикальные ганглии (женщины); Ганглион Франкенхюзера (женщина) является основным источником постганглионических симпатических и парасимпатических нейронов, иннервирующих органов таза грызунов; нижнее гипогастрическое сплетение включает в себя эквивалентную нейрональную структуру у людей3,4,5,6. Сенсорные проекции от поясничных и сакральных корнях ганглиев также путешествуют через MPG для достижения органов малого таза. Таким образом, понимание нейронной схемы и биологии MPG имеет решающее значение для доклинических исследований на множество клинических условий, связанных с развитием и взрослой функции органов малого таза. Несколько отличных описаний грызунов MPG были опубликованы7,8, но наш опыт заключается в том, что в целом эти описания не всегда обеспечивают достаточное руководство, чтобы практически информировать экспериментального вскрытия или манипуляции этих структур, когда восстановление животного не требуется. Кроме того, большинство исследований MPG сосредоточены на крысах-самцах. У самок крыс, MPG меньше9 и имеют различные анатомические ориентиры, и, следовательно, требуют отчетливо с учетом руководства по визуализации и вскрытия.
Симпатические и парасимпатические пути отличаются своей анатомией, в частности расположение их preganglionic нейронов, с симпатической пути, имеющие preganglionic нейронов в торако-поясничного спинного мозга и парасимпатической preganglionic нейронов, расположенных в стволе мозга (черепно-мозговой нерв ныхпоколеня) и сакральный спинной мозг. В большинстве других регионов вегетативной системы, их целевые ганглия нейроны расположены в различных симпатических или парасимпатических ганглиев. Тем не менее, MPG являются необычными в том, смешанные симпатической-парасимпатической ганглиев, и поэтому в макроскопическом масштабе являются местами сближения из преганглионных аксонов как торако-поясничных и сакральных спинномозговых регионов. Поэтому мы включили в наши протоколы расположение и описание этих первичных нервных путей, которые соединяют каждый спинной области с MPG, облегчая экспериментальный анализ или отдельные манипуляции этих нейронных компонентов. Мы также отмечаем для читателей, специально сравнивая эти ганглии между видами, что у грызунов спинного preganglionic нейронов, которые являются “функционально сакральный”, например, являются активными и требуется во время micturition, дефекации и полового члена эрекции, расположены на спинномозговых уровнях L6-S1, а не исключительно в сакральных сегментах10; также L6 и S1 дорзовый корень ганглии обеспечивают основные “сакральный” сенсорный вход в органы малого таза. У грызунов сенсорный и преганглионный вход из более ростральных нейронных цепей концентрируется в спинномозговых уровнях L1 и L210.
Здесь мы описываем протокол для доступа к MPG и связанных с ними нервных путей у мужчин и женщин крыс, и поддерживать это с помощью схем, чтобы проиллюстрировать конкретные ориентиры. Этот протокол направляет хирургический доступ к этим структурам в экспериментальном контексте удаления ткани для исследования in vitro, например, изоляции нейронов MPG для молекулярной характеристики или первичной культуры. Он также может быть адаптирован к удалению MPG после интракардиального перфузии с фиксацией, хотя это более трудное вскрытие, потому что нервная ткань становится все труднее визуализировать, когда соседние ткани лишены крови. Этот протокол также может быть интегрирован в хирургическую обстановку для экспериментального вмешательства этих нервных путей (например, резекция нерва, микроинъекция нервных трассаторов). Эти типы вскрытий становятся все более важными для растущей области биоэлектронной медицины, где новые цели и подходы для нейромодуляции для лечения клинических условий органов малого таза внутренностей разрабатываются11. Мы представляем полный протокол сначала для крыс мужского пола, а затем повторение протокола специально для самок крыс.
Нейронный контроль органов малого таза опосредовано сложными путями, включая соматические, парасимпатические, симпатические и висцеральные сенсорные компоненты14,15,16,17. Большинство из этих путей происходят в или проходят через MPG. Протоколы вскрытия, изложенные здесь, дают представление об анатомии MPG, связанных с ними нервах и близлежащих макроскопических анатомических ориентирах; последние иллюстрируются анатомическими схемами. Другие подходы к вскрытию MPG также могут быть успешными, но мы находим описанный здесь, чтобы быть надежным и подходящим для исследователя, нового для этой области нервной системы.
Наиболее важными аспектами протокола являются правильное определение каждого основного нерва и полное удаление ткани MPG. При тщательном просмотре и обработке тканей, ткани MPG могут быть удалены для анатомических, молекулярных и электрофизиологических исследований в пробирке18,19,20,21,22. Протокол также может быть адаптирован для in vivo экспериментальных манипуляций23,24,25, отметив, что в этом случае, большая осторожность должна быть принята, чтобы свести к минимуму контакт с первичными нервами, связанными с ганглия или повредить близлежащие сосуды. Если эксперимент требует селективного денервации путем прерывания одного или нескольких нервов, рекомендуется сватому нерву, чтобы предотвратить ренернервацию и путаницу анализов. Этот протокол вскрытия также может быть использован для мыши, где есть также MPG с сопоставимой функцией26,27,28.
Для нейроанатомических исследований, лучшее сохранение антигенов и структуры тканей получает путем вскрытия MPG от обезеченного животного, которое было пронизано транскардионно с гистологическим фиксатором, подходящим для эксперимента29; однако, идентификация ганглия и нервных структур более трудно после этого процесса, как окраска ткани теряется. Рекомендуется, чтобы стать опытным в выявлении и вскрытии ганглия от неперфированных животных, прежде чем пытаться это вскрытие после перфузии. Кроме того, рекомендуется сначала стать опытным в вскрытии у мужчин, потому что для животных эквивалентного возраста и размера тела, MPG и связанных с ним нервов гораздо меньше у женщин.
Чтобы подтвердить, что ткань удалена действительно MPG, исследователь сначала рекомендуется проверить местоположение и особенности каждого первичного нерва. Много dissectors находят тазовый нерв и кавернозный нерв самый легкий для того чтобы определить in situ; гипогастрические и аксессуарные нервы более тонкие и более трудно отличить от окружающих тканей. Если эти нервы больше не доступны из-за проблем во время вскрытия, или если есть неопределенность в отношении их структуры, рекомендуется, чтобы первоначальные вскрытия MPG характеризуются обычной гистологии (для подтверждения наличия нейрональных клеточных органов8) и, во-вторых, с иммуногистохимией (чтобы определить, что как холинергические и норадренергические нейроны присутствуют30,31) (Рисунок 3). Для проверки правильной идентификации основных нервов, кавернозные нервы легко определить их высокой плотности нейрональных клеточных органов в их начальной части близко к MPG; большинство из этих нейронов выражают маркеры холинергических, нитрергических нейронов32,33. Тазовые, гипогастральные и аксессуары нервы имеют очень мало нейрональных клеточных органов34.
Есть несколько распространенных подводных камней в выполнении этого вскрытия. Если начинающие диссекторы имеют проблемы с поиском каких-либо основных нервов или MPG, они рекомендуется вернуться к шагам, которые описывают ключевые ориентиры. Очень часто бывает настолько сосредоточенным на поиске микроструктур, что теряется макроскопический контекст. Чаще всего, начинающие диссекторы либо двигаться слишком далеко ростральный в их рассечение сайта или остаются слишком “поверхностный”-т.е., слишком близко к брюшной отверстия живота, а не изучение более глубоких (т.е. более дорсальные) структуры. Распространенной проблемой во время вскрытия является повреждение сосуды во время вскрытия. Если кровотечение начинается, осторожно держать хлопчатобумажный аппликатор над источником, пока кровотечение останавливается, а затем промыть области либерально с солевой перед повторной вскрытия. Вполне возможно, MPG не будет пригодным для экспериментов, если загрязнены слишком много крови или если вскрытие задерживается слишком долго в ожидании кровотечения, чтобы остановить. Другой распространенной ошибкой вскрытия является повреждение капсулы предстательной железы, что значительно ухудшает визуализацию и удаление MPG. Эта капсула является очень деликатной структурой, которая легко проколота при удалении жира из боковой стенки простаты, даже если при использовании только хлопка наконечником аппликатора. Наконец, основные нервы, связанные с MPG легко повреждаются в процессе идентификации каждого из них, а затем во время удаления MPG. Dissectors are encouraged to develop a routine whereby each nerve is isolated in turn, in a particular order, so that there is less opportunity for confusion during the final steps of ganglion removal.
Это вскрытие не стремилось проследить каждый из компонентов аксессуар нервов к конкретным органам, или определить каждый из многих микроганглий, которые лежат в различных точках между тазовых ганглиях и органов малого таза8. Это довольно трудно визуализировать in vivo без использования конкретных пятен; однако, они могут быть удалены, следуя за каждым из нервных путей к органам, и с использованием конкретных нервных пятен после hoc для определения местоположения ганглия. Эти микроганглии, хотя и составляют лишь небольшую часть нейронной популяции по сравнению с MPG, могут обеспечить конкретные типы входных данных в органы, к которым они находятся наиболее близко. Мы отмечаем здесь ограничение в этой области, что ни эти микроганглии, ни многие из небольших нервных путей выхода MPG для поездки в тазовые органы еще широко приняты имена. Кроме того, столь же подробное исследование микроганглии еще не было проведено у самок крыс.
Таким образом, протокол и схемы, представленные здесь, предоставляют исследователям инструменты для изучения первичных структур, обеспечивающих вегетативную подачу нерва в органы малого таза, а также основные периферийные каналы сенсорных нервов из люмбозакрального корня ганглиев, которые путешествуют через MPG к тазовым органам.
The authors have nothing to disclose.
Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Управлением Директора, Национальными институтами здравоохранения, стимулирующей периферийную активность для облегчения условий (SPARC) Программа, Награда номер OT2OD023872. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Стипендия д-ра Бертрана в лаборатории доктора Косте финансировалась: Университетская больница Немеса, факультет медицины Монпелье-Немес, Ассоциация Франсез де Chirurgie (АФК), Сосьете Interdisciplinaire франкоязычных d ‘UroDynamique et de Pelvip’rin’ologie (SIFUD-PP) и Программа “Люди” (Marie Curie Actions) Седьмой рамочной программы Европейского союза (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения REA No PCOFUND-GA-2013-609102 в рамках программы PRESTIGE, координируемые Campus Франция.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |