Summary
Основные тазовых ганглиев содержат парасимпатические и симпатической нейронов, что innervate органов малого таза. Здесь мы описываем метод вскрытия и предоставляем схемы для идентификации этих ганглиев и связанных с ними нервов. Эти методы могут быть применены к экспериментальной манипуляции этих ганглиев in vivo или удаления посмертнодля для дальнейшего изучения.
Abstract
Двусторонние крупные тазовыгие ганглии (MPG; синоним, тазовые ганглии) являются основным источником постганглионических симпатических и парасимпатических нейронов, иннервирующих органов таза грызунов; функционально эквивалентной структурой у человека является низкое гипогастрическое сплетение. Основные тазовы ганглии также обеспечивают маршрут, по которому поясничные и сакральные сенсорные аксоны достигают органов малого таза. Эти сложные, смешанные ганглии могут оказаться сложными для выявления и вскрытия для дальнейшего экспериментального изучения нормальных вегетативных механизмов или для установления доклинических моделей болезни, травмы или висцеральной боли. Здесь мы описываем протокол для доступа и визуализации этих ганглиев и связанных с ними нервных путей. Мы предоставляем этот протокол со схемами для мужчин и женщин крыс, так как размер ганглия и ориентиры для идентификации различаются между полами. Протокол описывает удаление ганглия для исследования in vitro, но этот метод может быть интегрирован в хирургический протокол восстановления для экспериментальных вмешательств (например, раздавка нерва, резекция нерва) или для картирования нейрональных цепей (например, путем микроинъекции нервных трассировок). Мы также демонстрируем первичные структуры ганглия и связанных с ним нервов сразу же после вскрытия и после иммуногистохимического окрашивания.
Introduction
Крыса является одним из наиболее характерных видов, используемых в изучении физиологии органов малого таза и анатомии. Хотя отличные ресурсы существуют для описания этих органов1,2, они, как правило, не предоставляют информацию о связанных нейронных структур или сделать это в недостаточном разрешении для руководства экспериментального исследования. Как подробно описано ниже, организация вегетативных ганглиев, которые регулируют функцию органов малого таза, сильно отличается от остальной части вегетативной нервной системы, что затрудняет точное вывод функций иннервации таза из нейроанатомической информации, доступной для других вегетативных ганглиев. Этот дефицит ресурсов для руководства исследователей, входящих в эту область, возможно, замедлилисследования по нейронной регуляции органов малого таза. Здесь мы описываем протоколы для доступа к этой области нервной системы для дальнейшего исследования in vitro или экспериментального вмешательства.
Двусторонние крупные тазовыгие ганглии (MPG; синонимы: тазовыгие ганглии; парацервикальные ганглии (женщины); Ганглион Франкенхюзера (женщина) является основным источником постганглионических симпатических и парасимпатических нейронов, иннервирующих органов таза грызунов; нижнее гипогастрическое сплетение включает в себя эквивалентную нейрональную структуру у людей3,4,5,6. Сенсорные проекции от поясничных и сакральных корнях ганглиев также путешествуют через MPG для достижения органов малого таза. Таким образом, понимание нейронной схемы и биологии MPG имеет решающее значение для доклинических исследований на множество клинических условий, связанных с развитием и взрослой функции органов малого таза. Несколько отличных описаний грызунов MPG были опубликованы7,8, но наш опыт заключается в том, что в целом эти описания не всегда обеспечивают достаточное руководство, чтобы практически информировать экспериментального вскрытия или манипуляции этих структур, когда восстановление животного не требуется. Кроме того, большинство исследований MPG сосредоточены на крысах-самцах. У самок крыс, MPG меньше9 и имеют различные анатомические ориентиры, и, следовательно, требуют отчетливо с учетом руководства по визуализации и вскрытия.
Симпатические и парасимпатические пути отличаются своей анатомией, в частности расположение их preganglionic нейронов, с симпатической пути, имеющие preganglionic нейронов в торако-поясничного спинного мозга и парасимпатической preganglionic нейронов, расположенных в стволе мозга (черепно-мозговой нерв ныхпоколеня) и сакральный спинной мозг. В большинстве других регионов вегетативной системы, их целевые ганглия нейроны расположены в различных симпатических или парасимпатических ганглиев. Тем не менее, MPG являются необычными в том, смешанные симпатической-парасимпатической ганглиев, и поэтому в макроскопическом масштабе являются местами сближения из преганглионных аксонов как торако-поясничных и сакральных спинномозговых регионов. Поэтому мы включили в наши протоколы расположение и описание этих первичных нервных путей, которые соединяют каждый спинной области с MPG, облегчая экспериментальный анализ или отдельные манипуляции этих нейронных компонентов. Мы также отмечаем для читателей, специально сравнивая эти ганглии между видами, что у грызунов спинного preganglionic нейронов, которые являются "функционально сакральный", например, являются активными и требуется во время micturition, дефекации и полового члена эрекции, расположены на спинномозговых уровнях L6-S1, а не исключительно в сакральных сегментах10; также L6 и S1 дорзовый корень ганглии обеспечивают основные "сакральный" сенсорный вход в органы малого таза. У грызунов сенсорный и преганглионный вход из более ростральных нейронных цепей концентрируется в спинномозговых уровнях L1 и L210.
Здесь мы описываем протокол для доступа к MPG и связанных с ними нервных путей у мужчин и женщин крыс, и поддерживать это с помощью схем, чтобы проиллюстрировать конкретные ориентиры. Этот протокол направляет хирургический доступ к этим структурам в экспериментальном контексте удаления ткани для исследования in vitro, например, изоляции нейронов MPG для молекулярной характеристики или первичной культуры. Он также может быть адаптирован к удалению MPG после интракардиального перфузии с фиксацией, хотя это более трудное вскрытие, потому что нервная ткань становится все труднее визуализировать, когда соседние ткани лишены крови. Этот протокол также может быть интегрирован в хирургическую обстановку для экспериментального вмешательства этих нервных путей (например, резекция нерва, микроинъекция нервных трассаторов). Эти типы вскрытий становятся все более важными для растущей области биоэлектронной медицины, где новые цели и подходы для нейромодуляции для лечения клинических условий органов малого таза внутренностей разрабатываются11. Мы представляем полный протокол сначала для крыс мужского пола, а затем повторение протокола специально для самок крыс.
Protocol
Все процедуры должны проводиться в соответствии с требованиями институционального и финансируемого органа для экспериментов на животных. Использование животных для этого вскрытия и протокол для эвтаназии были одобрены Комитетом по этике животных в Университете Мельбурна (Протокол номер 1814639).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытия, иллюстрированные здесь, были выполнены на взрослых (10 недель) крысах-мужчинах и женщинах Спраг-Доули (Biomedical Sciences Animal Facility, Мельбурнский университет), весом 280 г (женщины) и 350 г (мужчины). До этих вскрытий крыс усыпили в камере CO2 в течение 4,5 мин. Сразу после смерти MPG была вскрыта. Если вскрытие ткани от животного, которое подверглось транскардиальной перфузии с фиксацией, принять меры предосторожности, чтобы защитить оператора от воздействия на фиксатор, т.е. выполнять вскрытие в дым шкаф или шкаф downdraft и носить подходящие средства индивидуальной защиты. Протокол для перфузии транскардии был опубликован в деталях12.
1. Крупный тазовый ганглий и смежные нервы: доступ и резекция у самца крысы
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны анатомические ориентиры для визуализации MPG у самца крысы.
- Доступ к брюшной полости и тазу
- Поместите крысу в положение на спине и доступ к животу и тазу через вентиляционный разрез средней линии, заботясь, чтобы избежать загрязнения хирургического поля с мехом.
- Аккуратно переместите органы брюшной полости в одну сторону с помощью щипочек или хлопчатобумажных аппликаторов. Обратите внимание на расположение вентральных долей предстательной железы и мочевого пузыря.
- Переместите семенной везикулы на контралатеральную сторону.
- Вырежьте ваз deferens, чтобы обеспечить лучший доступ к области над ганглия.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента вскрытия, ткань не должна высыхать; держать ткань влажной с физиологическим физиологическим физиологическим раствором (для рассечения свежей ткани) или фиксатором (для перфузионного фиксированного животного). Сохранение ткани влажной с сольник не только выгоды структуры тканей, но и делает вскрытие легче, как сухие нервы являются более хрупкими и слезоточивый легче во время обработки. - Определить дорсолатеральную долю предстательной железы, на предстой поверхности которой находится ганглия; это еще не будет видно.
- Чтобы визуализировать ганглия, тщательно очистить ткани вблизи и над ганглия. При необходимости используйте втягивание, чтобы сохранить четкое поле вскрытия.
- Удалите близлежащий агрегат жировой ткани и откройте боковую фасцию таза.
- Рассечение MPG и связанных с ней нервов
- Определите следующие места, которые обеспечивают ориентиры для следующих шагов вскрытия: дорсолатеральная доля предстательной железы (ганглия расположена на поверхности этой доли, немного более caudal, чем соединение между семенной везикулой и простаты) и семенных пузырьков (где они сходятся в средней линии указывает на ганглия расположение на рострокодомальной оси животного).
- По мере необходимости с этого момента тщательно удаляйте любую ткань, которая препятствует полному обзору нервных структур, избегая повреждения тонкой капсулы предстательной железы или крупных сосудов.
- Определите тазовый нерв, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
- Найти внутренние подвздошной вены и его тонкой ветви проектирования в сторону MPG и мочевого пузыря. Эта сосудистая ветвь проходит параллельно и иногда встроена в тазовый нерв, а затем пересекает ганглия.
- Аккуратно поместите мелко опрокинутые угловые щипцы под тазовым нервом и сдвиньте щипцы вместе, чтобы освободить его от окружающих тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это также может быть возможным, чтобы изолировать тазового нерва от малого сосуда работает параллельно ему, но для большинства типов экспериментов это не является существенным. Подтвердите, что структура тазового нерва, просматривая под высоким увеличением, чтобы определить, что нерв содержит несколько слабо агрегированных фасциклов, которые легко отличить под рассекающим микроскопом и характерны для таза нерв, как ни один из других основных нервов, связанных с ганглия показать эту явную фасцикуляции.
- Определите кавернозный нерв, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
- После следования тазового нерва к его стыку с ганглия, следуйте кавернозного нерва, как он путешествует по простате, а затем caudally к кавернозных тел полового члена.
- Если микроскоп увеличение позволяет, обратите внимание, что есть небольшая группа деликатных нервов, возникающих из ганглия между тазовых и кавернозных нервов; это ректальные нервы, которые путешествуют в нижнюю часть кишечника.
- Определите гипогастральный нерв, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
- Определите, где гипогастрический нерв соединяетги ганглия на его черепном краю, после путешествия рядом с мочеточником.
- Подтвердите, что гипогастрический нерв намного тоньше, чем тазовые или кавернозные нервы и не сопровождается большими сосудами.
- Определите MPG, визуализируя следующие функции.
- Визуализируйте вентральные, подошвы и черепные края ганглия, образуя треугольную форму.
- Подтвердите расположение каждого главного нерва: тазовые нервы, возникающие из псовой кромки ганглия, кавернозный нерв в самом каудальном углу ганглия, гипогастральный нерв от черепного края, и вспомогательные нервы, возникающие из ганглия вентральный край.
- Определите аксессуар нервы, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
- После очистки ткани, чтобы визуализация брюшной край ганглия, определить кластер нервов, которые проектируют в направлении мочевыводящих путей и репродуктивного путей.
- Если микроскоп увеличение позволяет, определить одну каудальную группу нервов, которые входят между доли простаты и одной ростральной группы между семенной везикулы и мочевого пузыря.
- Удаление MPG с связанными с ней нервами
- Аккуратно сдвиньте щипцизм между ганглия и основной предстательной железы, стараясь не проколоть тонкую капсулу простаты. Разрушить любые связи между ганглия и простаты.
- Очистить любые окончательные связи с окружающими тканями для длины нервов, необходимых для эксперимента, а затем сократить каждый нерв.
- Используя мелкие щипцы, переместите ганглий с его нервами к соответствующему решению для эксперимента и подтвердите, что каждый из основных нервов не поврежден.
2. Крупный тазовый ганглий и смежные нервы: доступ и резекция у самки крысы
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 показаны анатомические ориентиры для визуализации MPG у самки крысы.
- Доступ к брюшной полости и тазу
- Поместите крысу в положение на спине и доступ к животу и тазу через вентиляционный разрез средней линии, заботясь, чтобы избежать загрязнения хирургического поля с мехом.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента вскрытия, ткань не должна высыхать; держать ткань влажной с физиологическим физиологическим физиологическим раствором (для рассечения свежей ткани) или фиксатором (для перфузионного фиксированного животного). - Аккуратно переместите органы брюшной полости в одну сторону с помощью щипочек или хлопчатобумажных аппликаторов. Обратите внимание на расположение рога матки, мочевого пузыря и прямой кишки.
- Вырезать сосуды яичников и матки и втянуть рога матки.
- Введите перитонеального пространства и аккуратно очистить от совокупности жировой ткани, расположенной вблизи шейки матки.
- Поместите крысу в положение на спине и доступ к животу и тазу через вентиляционный разрез средней линии, заботясь, чтобы избежать загрязнения хирургического поля с мехом.
- Рассечение MPG и связанных с ней нервов
- Определить боковую стенку шейки матки, просто caudal к его соединению с рогами матки; этот регион является основной вехой для определения местоположения MPG на ротрокодальной оси животного.
- По мере необходимости с этого момента тщательно удаляйте любые ткани, которые препятствуют полному обзору нервных структур, избегая повреждения крупных сосудов.
- Определите тазовый нерв, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
- Найти внутренние подвздошной вены и его тонкой ветви проектирования в сторону MPG и мочевого пузыря. Эта ветвь проходит параллельно и иногда встроена в тазовый нерв, а затем пересекает ганглия.
- Подтвердите, что структура тазового нерва, просматривая под высоким увеличением, чтобы определить, что нерв содержит несколько слабо агрегированных фасциклов, которые легко отличить под рассекающим микроскопом и характерны для таза нерв, как ни один из других основных нервов, связанных с ганглия показать эту явную фасцикуляции.
- Определите гипогастральный нерв, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
- Определите, где гипогастрический нерв соединяетги ганглия на его черепном краю, после путешествия рядом с мочеточником.
- Подтвердите, что гипогастрический нерв намного тоньше, чем тазовые или кавернозные нервы и не сопровождается большими сосудами.
- Определите кавернозный нерв, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
- После следования тазового нерва к его стыку с ганглия, следуйте кавернозного нерва, как он путешествует caudally вдоль боковой стенки шейки матки к влагалищу.
- Если микроскоп увеличение позволяет, обратите внимание, что есть небольшая группа деликатных нервов, возникающих из ганглия между тазовых и кавернозных нервов; это ректальные нервы, которые путешествуют в нижнюю часть кишечника.
- Определите аксессуар нервы, визуализируя следующие ориентиры и особенности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аксессуар нервы трудно увидеть, но проект из медиального аспекта MPG. После очистки ткани, чтобы визуализация брюшной край ганглия, определить кластер очень деликатный нервов, которые проектируют к мочевыводящих и репродуктивных путей. - Определите MPG, визуализируя следующие функции.
- Визуализируйте вентральные, подошвы и черепные края ганглия, которые образуют треугольную форму.
- Подтвердите расположение каждого главного нерва: тазовые нервы, возникающие из псовой кромки ганглия, кавернозный нерв в самом каудальном углу ганглия, гипогастральный нерв от черепного края, и вспомогательные нервы, возникающие из ганглия вентральный край.
- Удаление MPG с связанными с ней нервами
- Аккуратно поместите мелко опрокинутые угловые щипцы под тазовым нервом и сдвиньте щипцы вместе, чтобы освободить его от основной шейки матки и окружающих тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это также может быть возможным, чтобы изолировать тазового нерва от малого сосуда работает параллельно ему, но для большинства типов экспериментов это не является существенным. При демонстрации вскрытия, поместите шов под тазовый нерв, чтобы облегчить его визуализацию. - Повторите процесс для кавернозного нерва, затем гипогастрический нерв, и, наконец, аксессуар нервов.
- Аккуратно сдвиньте щипцвов между ганглияи и основной шейки матки. Разрушить любые связи между ганглия и шейкой матки.
- Очистить любые окончательные связи с окружающими тканями для длины нервов, необходимых для эксперимента, а затем сократить каждый нерв.
- Используя мелкие щипцы, переместите ганглий с его нервами к соответствующему решению для эксперимента и подтвердите, что каждый из основных нервов не поврежден.
- Аккуратно поместите мелко опрокинутые угловые щипцы под тазовым нервом и сдвиньте щипцы вместе, чтобы освободить его от основной шейки матки и окружающих тканей.
3. Подтверждение компонентов ганглия (необязательно)
- После удаления ганглия, погрузите ганглия в обычный гистологический фиксатор (например, 4% буферизированного формалина) минимум на 1 ч, промойте фиксатор омовичем с помощью буфера 0,1 М фосфата и обработайте ткань криосекции и флуоресценции иммуногистохимии, как ранее описано13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие высококачественные антитела, которые конкретно распознают эти три нейронных маркера, доступны на коммерческой основе. Смотрите таблицу материалов для реагентов, используемых для маркировки, показанной на рисунке 3. - Кроме того, процесс ганглии нетронутыми (wholemounts) для иммуногистохимии с помощью аналогичного метода, как выше, но увеличение времени инкубации для антител до 4 дней (первичное антитело) и 2 дней (вторичное антитело).
- Чтобы продемонстрировать основную популяцию сенсорных аксонов, используйте антитела против пептида, связанного с генами кальцитонина (CGRP).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое разбавление антител, используемых в данном исследовании, составляет 1:5,000. - Чтобы продемонстрировать норраденергические симпатические нейроны, используйте антитела против гидроксилазы тирозина (TH).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое разбавление антител, используемых в данном исследовании, составляет 1:5,000. - Чтобы продемонстрировать основную популяцию холинергических нейронов, используйте антитела против синтаза оксида азота нейронов (NOS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое разбавление антител, используемых в данном исследовании 1:500.
Representative Results
Успешное вскрытие не только удалить полное тело MPG нетронутыми, но и сохранить первый сегмент каждого из основных нервов по-прежнему прилагается. Эти нервы являются ценными показателями ганглионной ориентации in vivo и, следовательно, предоставляют важную информацию для многих типов анатомических исследований (например, картографические модели выражений или клеточные изменения после экспериментального возмущения). Хотя сохранение связанных нервов может иметь меньшее значение для некоторых типов экспериментов (например, ганглион диссоциация для культуры изолированных нейронов), наличие нервов также обеспечивает способ обработки ганглия, не касаясь (и потенциально повреждения) нейронных клеточных органов.
Неудачное вскрытие будет иметь неполный или поврежденный ганглия, или там, где первичные нервы больше не прилагаются. Также возможно, что ганглии или нервы неосознанно повреждены во время вскрытия, либо потому, что физический ущерб слишком тонкий, чтобы обнаружить под рассекающим сядр микроскопом или потому, что повреждение становится очевидным только во время определенных типов анализов. Например, если ткань ганглия становится сухой во время вскрытия, ткань может казаться нормальной во время последующей обработки, но покажет высокий уровень неспецифической флуоресценции на поверхности.
Примеры вскрытых MPG показаны на рисунке 3, который предоставляет примеры всего MPG визуализированы в целом толщина полный ганглия(Рисунок 3A) и MPG, который был криосекционирован для выполнения иммунофлюоресценции, чтобы продемонстрировать норадренергические и холинергические нейроны (Рисунок 3B, C).
Рисунок 1: Анатомические ориентиры для визуализации MPG у самца крысы. 1, семенной везикул; 2, мочевой пузырь; 3, коагуляющая железа; 4 и 5, аксессуар нервы; 6, простата (вентрал-добе); 7, кавернозный нерв; 8, vas deferens; 9, мочеиспускательный уретра; 10, лампокаверносивная мышца; 11, искиокавернозная мышца; 12, ректальные нервы; 13, похититель caudae externus; 14, крупный тазовый ганглий; 15, тазовый нерв; 16, похититель caudae internus; 17, гипогастрический нерв; 18, внутренняя подвздошная вена; 19, сгибатель caudae brevis; 20, сгибатель caudae longus; 21, мочеточник; 22, psoas мажор; 23, брюшная аорта; 24, нижняя пола вены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Анатомические ориентиры для визуализации MPG у самки крысы. 1, дистальная толстая кишка; 2, мочевой пузырь; 3, утробное тело; 4, гипогастрический нерв; 5, вспомогательные нервы; 6, крупный тазовый ганглия; 7, кавернозный нерв; 8, влагалище; 9, мочеиспускательный уретра; 10, прямая кишка; 11, похититель caudae externus; 12, ректальные нервы; 13, сгибатель caudae brevis; 14, тазовый нерв; 15, внутренняя подвздошная вена; 16, похититель caudae internus; 17, сгибатель caudae longus; 18, внешняя подвздошная артерия; 19, мочеточник; 20, psoas мажор; 21, рог матки; 22, брюшная аорта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Иммуногистохимически помечены MPG от взрослых крыс мужского пола. Все препараты были визуализированы с помощью обычного широкоугольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного монохромной камерой, а затем цифровой окраской. (A) Wholemount (полная толщина), фиксированная MPG с связанными нервами, immunohistochemically обозначенные для сензорных нервов которые выражают пептид гена calcitonin гена (CGRP); 1, тазовый нерв (показывая множественные фасциклы); 2, кавернозный нерв; 3, гипогастрический нерв; 4, вспомогательные нервы; 5, ректальные нервы; 6, крупный тазовый ганглия (MPG). (B, C) Криосекции (14 мкм) фиксированной MPG, иммуногистохимически помечены для демонстрации смешанного норадренергического холинергического характера ганглия; (B) нораренергических нейронов продемонстрировали антитела для тирозин гидроксилаза и (C) основной популяции холинергических нейронов антитела для нейрональных оксида азота синтаза. Панель калибровки представляет (A) 1000 мкм, (B,C) 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Нейронный контроль органов малого таза опосредовано сложными путями, включая соматические, парасимпатические, симпатические и висцеральные сенсорные компоненты14,15,16,17. Большинство из этих путей происходят в или проходят через MPG. Протоколы вскрытия, изложенные здесь, дают представление об анатомии MPG, связанных с ними нервах и близлежащих макроскопических анатомических ориентирах; последние иллюстрируются анатомическими схемами. Другие подходы к вскрытию MPG также могут быть успешными, но мы находим описанный здесь, чтобы быть надежным и подходящим для исследователя, нового для этой области нервной системы.
Наиболее важными аспектами протокола являются правильное определение каждого основного нерва и полное удаление ткани MPG. При тщательном просмотре и обработке тканей, ткани MPG могут быть удалены для анатомических, молекулярных и электрофизиологических исследований в пробирке18,19,20,21,22. Протокол также может быть адаптирован для in vivo экспериментальных манипуляций23,24,25, отметив, что в этом случае, большая осторожность должна быть принята, чтобы свести к минимуму контакт с первичными нервами, связанными с ганглия или повредить близлежащие сосуды. Если эксперимент требует селективного денервации путем прерывания одного или нескольких нервов, рекомендуется сватому нерву, чтобы предотвратить ренернервацию и путаницу анализов. Этот протокол вскрытия также может быть использован для мыши, где есть также MPG с сопоставимой функцией26,27,28.
Для нейроанатомических исследований, лучшее сохранение антигенов и структуры тканей получает путем вскрытия MPG от обезеченного животного, которое было пронизано транскардионно с гистологическим фиксатором, подходящим для эксперимента29; однако, идентификация ганглия и нервных структур более трудно после этого процесса, как окраска ткани теряется. Рекомендуется, чтобы стать опытным в выявлении и вскрытии ганглия от неперфированных животных, прежде чем пытаться это вскрытие после перфузии. Кроме того, рекомендуется сначала стать опытным в вскрытии у мужчин, потому что для животных эквивалентного возраста и размера тела, MPG и связанных с ним нервов гораздо меньше у женщин.
Чтобы подтвердить, что ткань удалена действительно MPG, исследователь сначала рекомендуется проверить местоположение и особенности каждого первичного нерва. Много dissectors находят тазовый нерв и кавернозный нерв самый легкий для того чтобы определить in situ; гипогастрические и аксессуарные нервы более тонкие и более трудно отличить от окружающих тканей. Если эти нервы больше не доступны из-за проблем во время вскрытия, или если есть неопределенность в отношении их структуры, рекомендуется, чтобы первоначальные вскрытия MPG характеризуются обычной гистологии (для подтверждения наличия нейрональных клеточных органов8) и, во-вторых, с иммуногистохимией (чтобы определить, что как холинергические и норадренергические нейроны присутствуют30,31) (Рисунок 3). Для проверки правильной идентификации основных нервов, кавернозные нервы легко определить их высокой плотности нейрональных клеточных органов в их начальной части близко к MPG; большинство из этих нейронов выражают маркеры холинергических, нитрергических нейронов32,33. Тазовые, гипогастральные и аксессуары нервы имеют очень мало нейрональных клеточных органов34.
Есть несколько распространенных подводных камней в выполнении этого вскрытия. Если начинающие диссекторы имеют проблемы с поиском каких-либо основных нервов или MPG, они рекомендуется вернуться к шагам, которые описывают ключевые ориентиры. Очень часто бывает настолько сосредоточенным на поиске микроструктур, что теряется макроскопический контекст. Чаще всего, начинающие диссекторы либо двигаться слишком далеко ростральный в их рассечение сайта или остаются слишком "поверхностный"-т.е., слишком близко к брюшной отверстия живота, а не изучение более глубоких (т.е. более дорсальные) структуры. Распространенной проблемой во время вскрытия является повреждение сосуды во время вскрытия. Если кровотечение начинается, осторожно держать хлопчатобумажный аппликатор над источником, пока кровотечение останавливается, а затем промыть области либерально с солевой перед повторной вскрытия. Вполне возможно, MPG не будет пригодным для экспериментов, если загрязнены слишком много крови или если вскрытие задерживается слишком долго в ожидании кровотечения, чтобы остановить. Другой распространенной ошибкой вскрытия является повреждение капсулы предстательной железы, что значительно ухудшает визуализацию и удаление MPG. Эта капсула является очень деликатной структурой, которая легко проколота при удалении жира из боковой стенки простаты, даже если при использовании только хлопка наконечником аппликатора. Наконец, основные нервы, связанные с MPG легко повреждаются в процессе идентификации каждого из них, а затем во время удаления MPG. Dissectors are encouraged to develop a routine whereby each nerve is isolated in turn, in a particular order, so that there is less opportunity for confusion during the final steps of ganglion removal.
Это вскрытие не стремилось проследить каждый из компонентов аксессуар нервов к конкретным органам, или определить каждый из многих микроганглий, которые лежат в различных точках между тазовых ганглиях и органов малого таза8. Это довольно трудно визуализировать in vivo без использования конкретных пятен; однако, они могут быть удалены, следуя за каждым из нервных путей к органам, и с использованием конкретных нервных пятен после hoc для определения местоположения ганглия. Эти микроганглии, хотя и составляют лишь небольшую часть нейронной популяции по сравнению с MPG, могут обеспечить конкретные типы входных данных в органы, к которым они находятся наиболее близко. Мы отмечаем здесь ограничение в этой области, что ни эти микроганглии, ни многие из небольших нервных путей выхода MPG для поездки в тазовые органы еще широко приняты имена. Кроме того, столь же подробное исследование микроганглии еще не было проведено у самок крыс.
Таким образом, протокол и схемы, представленные здесь, предоставляют исследователям инструменты для изучения первичных структур, обеспечивающих вегетативную подачу нерва в органы малого таза, а также основные периферийные каналы сенсорных нервов из люмбозакрального корня ганглиев, которые путешествуют через MPG к тазовым органам.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Управлением Директора, Национальными институтами здравоохранения, стимулирующей периферийную активность для облегчения условий (SPARC) Программа, Награда номер OT2OD023872. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Стипендия д-ра Бертрана в лаборатории доктора Косте финансировалась: Университетская больница Немеса, факультет медицины Монпелье-Немес, Ассоциация Франсез де Chirurgie (АФК), Сосьете Interdisciplinaire франкоязычных d 'UroDynamique et de Pelvip'rin'ologie (SIFUD-PP) и Программа "Люди" (Marie Curie Actions) Седьмой рамочной программы Европейского союза (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения REA No PCOFUND-GA-2013-609102 в рамках программы PRESTIGE, координируемые Campus Франция.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
- Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
- Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
- Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
- Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
- Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
- Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
- Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
- Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
- Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
- Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
- Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P. Neuromodulation of urinary tract function. New England Journal of Medicine. 380 (21), 2067-2069 (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
- Dail, W. G., Minorsky, N. Composition of the pelvic nerve. Experimental Neurology. 92 (1), 278-283 (1986).
- Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
- Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
- Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
- Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
- Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
- Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
- Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
- Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
- Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
- Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
- Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
- Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
- Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
- Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
- Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
- Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).
