De store bækken ganglier indeholder parasympatiske og sympatiske neuroner, der innervate bækkenorganer. Her beskriver vi en dissektion metode og give skemaer til identifikation af disse ganglier og deres tilhørende nerver. Disse metoder kan anvendes på eksperimentel manipulation af disse ganglier in vivo eller fjernelse post mortem til yderligere undersøgelse.
Den bilaterale store bækken ganglier (MPG; synonym, bækken ganglier) er den primære kilde til postganglionic sympatiske og parasympatiske neuroner innervating bækkenorganer gnavere; den funktionelt tilsvarende struktur hos mennesker er ringere hypogastrisk plexus. De store bækken ganglier også give den rute, som lumbal og sakrale sensoriske axoner nå bækken organer. Disse komplekse, blandede ganglier kan vise sig udfordrende at identificere og dissekere for yderligere eksperimentel undersøgelse af normale autonome mekanismer eller til at etablere prækliniske modeller af sygdom, skade eller visceral smerte. Her beskriver vi en protokol for at få adgang til og visualisere disse ganglier og deres tilknyttede nerveskrifter. Vi leverer denne protokol med skemaer for både mandlige og kvindelige rotter, som ganglion størrelse og vartegn for identifikation varierer mellem kønnene. Protokollen beskriver fjernelse af ganglion for in vitro-undersøgelser, men denne metode kan integreres i en kirurgisk genoprettelsesprotokol for eksperimentelle indgreb (f.eks. nerveknusning, nerveresektion) eller til kortlægning af neuronalkredsløb (f.eks. ved mikroinjektion af neurale sporstoffer). Vi demonstrerer også ganglionens primære strukturer og de tilknyttede nerver umiddelbart efter dissektion og efter immunhistokemisk farvning.
Rotten er en af de bedst karakteriserede arter, der anvendes i studiet af bækken orgel fysiologi og anatomi. Mens fremragende ressourcer findes for beskrivelser af disse organer1,2, de generelt ikke giver oplysninger om de relaterede neurale strukturer eller gøre det ved utilstrækkelig opløsning til at guide en eksperimentel undersøgelse. Som beskrevet nedenfor, organiseringen af den autonome ganglier, der regulerer bækken organfunktion er helt anderledes end resten af det autonome nervesystem, hvilket gør det vanskeligt præcist at udlede bækken innervation funktioner fra neuroanatomiske oplysninger til rådighed for andre autonome ganglier. Denne mangel i ressourcer til at guide forskere ind i dette område kan have bremset forskning i neurale regulering af bækkenorganer. Her beskriver vi protokoller for at få adgang til denne region af nervesystemet for yderligere in vitro undersøgelser eller eksperimentel intervention.
Den bilaterale større bækkenganglitage (MPG; synonymer: bækkenganglier, parahalseret ganglier [kvinde]; Frankenhäuser’s ganglion [kvindelige]) er den primære kilde til postganglionic sympatiske og parasympatiske neuroner innervating bækkenorganer gnavere; den ringere hypogastriske plexus omfatter den tilsvarende neuronale struktur hos mennesker3,4,5,6. Sensoriske fremskrivninger fra lænde- og sakrale dorsale rodganglier rejser også via MPG for at nå bækkenorganerne. Derfor, forståelse af neurale kredsløb og biologi mpg er afgørende for prækliniske undersøgelser på et utal af kliniske tilstande i forbindelse med udvikling og voksne funktion af bækkenorganer. Flere fremragende beskrivelser af gnaver MPG er blevet offentliggjort7,8, men vores erfaring er, at generelt disse beskrivelser ikke altid giver tilstrækkelig vejledning til praktisk informere en eksperimentel dissektion eller manipulation af disse strukturer, når inddrivelse af dyret er påkrævet. Desuden er de fleste mpg undersøgelser fokus på mandlige rotter. Hos kvindelige rotter er MPG mindre9 og har forskellige anatomiske vartegn, og kræver derfor en udpræget skræddersyet guide til visualisering og dissektion.
Sympatiske og parasympatiske veje er kendetegnet ved deres anatomi, specielt placeringen af deres præganglioniske neuroner, med sympatiske veje, der har præganglioniske neuroner i thoraco-lænde rygmarv og den parasympatiske præganglioniske neuroner placeret i hjernestammen (kranienerver fremskrivninger) og sakrale rygmarv. I de fleste andre regioner i det autonome system, deres mål ganglion neuroner er placeret i forskellige sympatiske eller parasympatiske ganglier. Men MPG er usædvanligt i at være blandet sympatisk-parasympatisk ganglier, og derfor på en makroskopisk skala er steder af konvergens fra præganglioniske axoner af både thoraco-lumbal og sakrale spinal regioner. Vi har derfor inkluderet i vores protokoller placeringen og beskrivelsen af disse primære nerveskrifter, der forbinder hver spinal region med MPG, lette eksperimentel analyse eller separat manipulation af disse neurale komponenter. Vi bemærker også for læsere specifikt at sammenligne disse ganglier på tværs af arter, at i gnavere spinal præganglionic neuroner, der er ‘funktionelt sakrale’, fx er aktive og kræves under micturition, afføring og penis erektion, er placeret på spinal niveauer L6-S1 snarere end udelukkende i sakrale segmenter10; ligeledes L6 og S1 dorsale rod gangli er give de store ‘sakrale’ sensoriske input til bækkenorganer. Hos gnavere, sensoriske og præganglioniske input fra mere rostral neurale kredsløb er koncentreret i spinal niveau L1 og L210.
Her beskriver vi en protokol for at få adgang til MPG og deres tilknyttede nerveskrifter hos mandlige og kvindelige rotter, og støtte dette med skemaer til at illustrere specifikke vartegn. Denne protokol guider kirurgisk adgang til disse strukturer i en eksperimentel sammenhæng med at fjerne vævet til in vitro-studier, f.eks. Det kan også tilpasses til MPG fjernelse efter intracardiac perfusion med fiksativ, selv om dette er en vanskeligere dissektion, fordi det neurale væv bliver vanskeligere at visualisere, når de tilstødende væv er blottet for blod. Denne protokol kan også integreres i en kirurgisk indstilling for eksperimentel indgriben af disse nerveveje (f.eks nerve resektion, mikroinjektion af neurale sporstoffer). Disse typer af dissektioner får stadig større betydning for det voksende område af bioelektronisk medicin, hvor nye mål og tilgange til neuromodulation til behandling af kliniske tilstande af bækken indvolde er under udvikling11. Vi præsenterer den komplette protokol først for hanrotter, derefter en kopi af protokollen skræddersyet specielt til kvindelige rotter.
Neural kontrol af bækkenorganer er medieret af komplekse veje, herunder somatiske, parasympatiske, sympatiske og visceral sensoriske komponenter14,15,16,17. De fleste af disse veje stammer fra eller passerer gennem MPG. Dissektionsprotokollerne, der er skitseret her, giver en introduktion til MPG-anatomi, de tilknyttede tilknyttede nerver og nærliggende makroskopiske anatomiske landemærker; sidstnævnte illustreres ved anatomiske skemaer. Andre tilgange til MPG dissektion kan også være en succes, men vi finder den ene beskrevet her for at være robust og egnet til en forsker ny på dette område af nervesystemet.
De mest kritiske aspekter af protokollen er korrekt identifikation af hver større nerve og fuldstændig fjernelse af MPG væv. Ved omhyggelig visning og håndtering af væv kan MPG-væv fjernes for anatomiske, molekylære og elektrofysiologiske in vitro-studier18,19,20,21,22. Protokollen kan også tilpasses til in vivo eksperimentel manipulation23,24,25, bemærke, at i dette tilfælde, skal der udvises stor omhu for at minimere kontakt med de primære nerver forbundet med ganglion eller til skader i nærheden vaskulatur. Hvis forsøget kræver selektiv denervation ved afbrydelse af en eller flere nerver, anbefales det at ligeat den afhuggede nerve for at forhindre reinnervation og konfundering af analyser. Denne dissektion protokol kunne også anvendes til musen, hvor der også er en MPG med sammenlignelige funktion26,27,28.
For neuroanatomiske undersøgelser opnås den bedste konservering af antigener og vævsstruktur ved at dissekere MPG fra et bestøvet dyr, der er blevet perfunderet transcardialt med histologisk fiksativ, der er passende for forsøget29; men identifikation af ganglion og nerve strukturer er vanskeligere efter denne proces, som væv farve er tabt. Det anbefales at blive dygtige til at identificere og dissekere ganglion en fra ikke-perfunderede dyr, før du forsøger denne dissektion efter perfusion. Ligeledes anbefales det først at blive dygtige i dissektion hos mænd, fordi for dyr af tilsvarende alder og kropsstørrelse, MPG og dens tilknyttede nerver er meget mindre hos kvinder.
For at validere, at vævet fjernet er faktisk MPG, forskeren rådes først til at kontrollere placeringen og funktionerne i hver primær nerve. Mange dissectors finde bækkennerven og hule nerve den nemmeste at identificere in situ; hypogastriske og tilbehør nerver er mere delikat og vanskeligere at skelne fra det omgivende væv. Hvis disse nerver ikke længere er tilgængelige på grund af problemer under dissektion, eller hvis der er usikkerhed om deres struktur, anbefales det, at de første MPG dissektioner er karakteriseret med konventionel histologi (for at bekræfte tilstedeværelsen af neuronal celle organer8) og for det andet med immunhistokemi (at identificere, at både kolinerge og noradrenerge neuroner er til stede30,31) (Figur 3). For at validere korrekt identifikation af de store nerver, er de hule nerver let identificeret ved deres høje tæthed af neuronale celleorganer i deres oprindelige del tæt på MPG; de fleste af disse neuroner udtrykke markører for kolinerge, nitrerge neuroner32,33. Bækken, hypogastriske og tilbehør nerver har meget få neuronal celle organer34.
Der er flere almindelige faldgruber i udførelsen af denne dissektion. Hvis nybegyndere dissectors har problemer med at finde nogen af de store nerver eller MPG, opfordres de til at vende tilbage til de trin, der beskriver de vigtigste vartegn. Det er meget almindeligt at blive så fokuseret på at finde mikrostrukturerne, at man mister overblikket over den makroskopiske kontekst. Oftest, novice dissectors enten bevæge sig for langt rostral i deres dissektion site eller forblive for ‘overfladisk’-dvs for tæt på ventrale åbning af maven, snarere end at undersøge dybere (dvs. mere dorsale) strukturer. Et fælles problem under dissektion er skader på vaskulaturen under dissektion. Hvis blødningen starter, skal du forsigtigt holde en bomuldsspidsapplikator over kilden, indtil blødningen stopper, og derefter skylle området rigeligt med saltvand, før dissektion genoptages. Det er muligt MPG vil ikke være anvendelige til forsøg, hvis forurenet med for meget blod, eller hvis dissektion er forsinket for længe, mens du venter på blødning til at stoppe. En anden fælles dissektion fejl er skader på kapslen af prostata, som i væsentlig grad svækker MPG visualisering og fjernelse. Denne kapsel er en meget delikat struktur, der er let punkteret, mens du fjerner fedt fra den laterale væg af prostata, selv om du kun bruger en bomuld-tippet applikator. Endelig er de vigtigste nerver forbundet med MPG let beskadiget under processen med at identificere hver enkelt og derefter under fjernelse af MPG. De forskellige sektorer opfordres til at udvikle en rutine, hvor hver nerve isoleres på skift, i en bestemt rækkefølge, således at der er mindre mulighed for forvirring i de sidste trin af ganglion fjernelse.
Denne dissektion søgte ikke at spore hver af komponenterne i tilbehøret nerver til specifikke organer, eller at identificere hver af de mange mikroganglier, der ligger på forskellige punkter mellem bækken ganglier og bækkenorganer8. Disse er ganske vanskeligt at visualisere in vivo uden at bruge specifikke pletter; men, de kan fjernes ved at følge hver af de nerveskrifter mod organer, og udnytte specifikke neurale pletter post hoc at bestemme ganglion placering. Disse mikroganglier, selv om de kun omfatter en lille brøkdel af den neuronale population i forhold til MPG, kan give specifikke typer af input til de organer, som de er tættest placeret. Vi bemærker her en begrænsning på området, at hverken disse mikrogangli eller mange af de små nerveskrifter forlader MPG at rejse til bækkenorganer endnu har bredt accepteret navne. Desuden er der endnu ikke udført en tilsvarende detaljeret undersøgelse af mikroganglii en tilsvarende detaljeret undersøgelse af mikrogangliiet hos hunrotter.
Sammenfattende giver protokollen og skemaer her forskerne værktøjer til at studere de primære strukturer, der giver den autonome nerve forsyning til bækkenorganer, samt de store perifere rør af sensoriske nerver fra lumbosacral dorsale rod ganglier, der rejser via MPG til bækkenorganer.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af kontoret for direktøren, National Institutes of Health, stimulerende perifer aktivitet til at lindre betingelser (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Indholdet er udelukkende ophavsmændenes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra De Nationale Sundhedsinstitutter. Dr. Bertrands stipendium i Dr. Keasts laboratorium blev finansieret af: Universitetshospitalet i Nîmes, det medicinske fakultet i Montpellier-Nîmes, The Association Française de Chirurgie (AFC), Société Interdisciplinaire Francophone d »UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) og People-programmet (Marie Curie-aktionerne) under Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under REA-tilskudsaftalen Ingen PCOFUND-GA-2013-609102 gennem PRESTIGE-programmet koordineret af Campus Frankrig.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |