प्रमुख पेल्विक गैंगलिया में पैरायुक्त और सहानुभूतिन्यूरॉन्स होते हैं जो इनरवेट पेल्विक अंग होते हैं। यहां हम एक विच्छेदन विधि का वर्णन करते हैं और इन गंगलिया और उनके संबद्ध नसों की पहचान के लिए योजनाबद्ध प्रदान करते हैं। इन तरीकों को आगे के अध्ययन के लिए वीवो में इन गैंगलिया में प्रायोगिक हेराफेरी या हटाने के लिए आवेदन किया जा सकता है।
द्विपक्षीय प्रमुख पेल्विक गंगलिया (एमपीजी; पर्याय, श्रोणि गंगलिया) कृन्तकों के पेल्विक अंगों को पोस्टगैलियनसहानुभूति और पैराइम्सिपेटिक न्यूरॉन्स का प्राथमिक स्रोत हैं; मनुष्यों में कार्यात्मक रूप से समकक्ष संरचना अवर हाइपोगैस्ट्रिक प्लेक्सस है। प्रमुख पेल्विक गैंगलिया वह मार्ग भी प्रदान करता है जिसके द्वारा काठ और पवित्र संवेदी अक्षतश्पियों तक पहुंचते हैं। ये जटिल, मिश्रित गैंगलिया सामान्य स्वायत्त तंत्रों के आगे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए या रोग, चोट या आंत के दर्द के पूर्वनैदानिक मॉडल स्थापित करने के लिए पहचानना और विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है। यहां हम इन गंगलिया और उनके संबद्ध तंत्रिका क्षेत्रों तक पहुंचने और कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम इस प्रोटोकॉल को पुरुष और मादा चूहों दोनों के लिए योजनाबद्ध प्रदान करते हैं, क्योंकि पहचान के लिए गैंगलियन आकार और स्थललिंग लिंगों के बीच भिन्न होते हैं। प्रोटोकॉल इन विट्रो अध्ययन ों के लिए गैंगलियन को हटाने का वर्णन करता है, लेकिन इस विधि को प्रयोगात्मक हस्तक्षेपों (जैसे, तंत्रिका क्रश, तंत्रिका रिसेक्शन) या न्यूरोनल सर्किट (उदाहरण के लिए, माइक्रोइंजेक्शन द्वारा) मानचित्रण के लिए एक शल्य चिकित्सा वसूली प्रोटोकॉल में एकीकृत किया जा सकता है तंत्रिका ट्रेसर की) । हम गैंगलियन और उससे जुड़ी नसों की प्राथमिक संरचनाओं को तुरंत विच्छेदन के बाद और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने के बाद भी प्रदर्शित करते हैं।
चूहा श्रोणि अंग शरीर विज्ञान और शरीर रचना विज्ञान के अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सबसे अच्छी विशेषता वाली प्रजातियों में से एक है। जबकि उत्कृष्ट संसाधन इन अंगों1,2के विवरण के लिए मौजूद हैं, वे आम तौर पर संबंधित तंत्रिका संरचनाओं के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं या एक प्रयोगात्मक अध्ययन का मार्गदर्शन करने के लिए अपर्याप्त संकल्प पर ऐसा करते हैं। के रूप में आगे विस्तृत नीचे, स्वायत्त गैंगलिया के संगठन है कि श्रोणि अंग समारोह को विनियमित स्वायत्त तंत्रिका तंत्र के बाकी के लिए काफी अलग है, यह मुश्किल न्यूरोएनाटॉमी अंय स्वायत्त ganglia के लिए उपलब्ध जानकारी से श्रोणि अंतरावता सुविधाओं का अनुमान करने के लिए कर रही है । इस क्षेत्र में प्रवेश करने वाले शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन करने के लिए संसाधनों में इस कमी से श्रोणि अंगों के तंत्रिका नियमन पर शोध धीमा हो सकता है । यहां हम आगे इन विट्रो अध्ययन या प्रायोगिक हस्तक्षेप के लिए तंत्रिका तंत्र के इस क्षेत्र तक पहुंचने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं ।
द्विपक्षीय प्रमुख श्रोणि गंगलिया (एमपीजी; पर्याय: श्रोणि गंगलिया; पैरासर्वाइकल गैंगलिया [महिला]; फ्रेंकेनहॉयूजर का गैंगलियन [महिला]) पोस्टगालेओनिक सहानुभूति और परानुभूति न्यूरॉन्स के प्राथमिक स्रोत हैं जो कृंतकके श्रोणि अंगों को आंतरिक करते हैं; अवर हाइपोगैट्रिक प्लेक्सस में मनुष्यों में समतुल्य न्यूरोनल स्ट्रक्चर3,4,5,6शामिल हैं . काठ और पवित्र पृष्ठीय जड़ गंगलिया से संवेदी अनुमान भी पेल्विक अंगों तक पहुंचने के लिए एमपीजी के माध्यम से यात्रा करते हैं। इसलिए, एमपीजी के तंत्रिका सर्किटरी और जीव विज्ञान को समझना श्रोणि अंगों के विकास और वयस्क कार्य से संबंधित नैदानिक स्थितियों के असंख्य पर प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण है। कृंतक एमपीजी के कई उत्कृष्ट विवरण7,8प्रकाशित किए गए हैं, लेकिन हमारा अनुभव यह है कि सामान्य रूप से ये विवरण हमेशा जानवर की वसूली की आवश्यकता होने पर व्यावहारिक रूप से एक प्रयोगात्मक विच्छेदन या इन संरचनाओं के हेरफेर को सूचित करने के लिए पर्याप्त मार्गदर्शन प्रदान नहीं करते हैं। इसके अलावा, एमपीजी अध्ययन के बहुमत पुरुष चूहों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। मादा चूहों में, एमपीजी छोटे9 हैं और अलग शारीरिक स्थल हैं, और इसलिए दृश्य और विच्छेदन के लिए एक स्पष्ट रूप से सिलवाया गाइड की आवश्यकता होती है।
सहानुभूतिपूर्ण और परानुभूति वाले रास्ते उनके शरीर रचना विज्ञान द्वारा प्रतिष्ठित होते हैं, विशेष रूप से उनके प्रीगालियनिक न्यूरॉन्स का स्थान, थोराको-काठ की रीढ़ की हड्डी में पूर्वाग्रही न्यूरॉन्स होने वाले सहानुभूतिपूर्ण रास्ते और ब्रेनस्टेम (कपाल तंत्रिका अनुमानों) और पवित्र रीढ़ की हड्डी में स्थित पैराइम्प्रेसिक न्यूरॉन्स होते हैं। स्वायत्त प्रणाली के अधिकांश अन्य क्षेत्रों में, उनके लक्षित गैंगलियन न्यूरॉन्स अलग सहानुभूति या परानुभूति गंगलिया में स्थित हैं। हालांकि, एमपीजी सहानुभूति-परानुपेश गैंगलिया मिश्रित होने में असामान्य हैं, और इसलिए स्थूल पैमाने पर थोराको-काठ और पवित्र रीढ़ दोनों क्षेत्रों के प्रीगाग्लियोटिक एक्सोन से अभिसरण की साइटें हैं। इसलिए हमने अपने प्रोटोकॉल में इन प्राथमिक तंत्रिका क्षेत्रों के स्थान और विवरण को शामिल किया है जो प्रत्येक रीढ़ के क्षेत्र को एमपीजी से जोड़ते हैं, प्रायोगिक विश्लेषण या इन तंत्रिका घटकों के अलग हेरफेर को सुविधाजनक बनाते हैं। हम पाठकों के लिए विशेष रूप से प्रजातियों में इन गैंगलिया की तुलना करते हैं, कि कृंतक में रीढ़ की हड्डी के प्रीगालियन न्यूरॉन्स जो ‘कार्यात्मक रूप से पवित्र’ हैं, उदाहरण के लिए, सक्रिय हैं और मिक्टोरिटेशन, शौच और लिंग निर्माण के दौरान आवश्यक हैं, रीढ़ की हड्डी के स्तर L6-S1 पर स्थित हैं बजाय विशेष रूप से पवित्र खंडों में10; इसी तरह L6 और S1 पृष्ठीय जड़ गंगलिया श्रोणि अंगों के लिए प्रमुख ‘पवित्र’ संवेदी इनपुट प्रदान करते हैं। कृंतक में, अधिक रोस्ट्रल तंत्रिका सर्किट से संवेदी और preganglionic इनपुट रीढ़ की हड्डी के स्तर L1 और L210में केंद्रित है ।
यहां हम नर और मादा चूहों में एमपीजी और उनके संबद्ध तंत्रिका क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और विशिष्ट स्थलों को समझाने के लिए योजनाबद्ध के साथ इसका समर्थन करते हैं। यह प्रोटोकॉल इन विट्रो अध्ययनों के लिए ऊतक को हटाने के प्रायोगिक संदर्भ में इन संरचनाओं तक सर्जिकल पहुंच का मार्गदर्शन करता है, उदाहरण के लिए, आणविक लक्षण वर्णन या प्राथमिक संस्कृति के लिए एमपीजी न्यूरॉन्स को अलग करना। इसे फिक्सेटिव के साथ इंट्राकार्डियक परफ्यूजन के बाद एमपीजी हटाने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि यह एक अधिक कठिन विच्छेदन है क्योंकि निकटवर्ती ऊतकरक्त से रहित होने पर तंत्रिका ऊतक कल्पना करना अधिक कठिन हो जाता है। इस प्रोटोकॉल को इन तंत्रिका मार्गों (जैसे, तंत्रिका रिसेक्शन, तंत्रिका ट्रेसर के माइक्रोइंजेक्शन) के प्रायोगिक हस्तक्षेप के लिए सर्जिकल सेटिंग में भी एकीकृत किया जा सकता है। इस प्रकार के विच्छेदन बायोइलेक्ट्रॉनिक चिकित्सा के बढ़ते क्षेत्र के लिए तेजी से महत्वपूर्ण हैं, जहां श्रोणि आंत की नैदानिक स्थितियों के इलाज के लिए न्यूरोमोडुलेशन के लिए नए लक्ष्य और दृष्टिकोण विकसित किए जा रहे हैं11। हम पुरुष चूहों के लिए पहले पूरा प्रोटोकॉल पेश करते हैं, फिर विशेष रूप से मादा चूहों के अनुरूप प्रोटोकॉल की प्रतिकृति।
श्रोणि अंगों के तंत्रिका नियंत्रण को दैहिक, परानुभूति, सहानुभूतिपूर्ण और आंत संवेदी घटकों14,15,16,17सहित जटिल रास्तों द्वारा मध्यस्थता की जाती है । इनमें से अधिकांश रास्ते एमपीजी में उत्पन्न होते हैं या गुजरते हैं। यहां उल्लिखित विच्छेदन प्रोटोकॉल एमपीजी शरीर रचना विज्ञान, संबंधित संबंधित नसों और पास के स्थूल शारीरिक स्थलों का परिचय प्रदान करते हैं; उत्तरार्द्ध शारीरिक योजनाबद्ध द्वारा सचित्र हैं। MPG विच्छेदन के लिए अन्य दृष्टिकोण भी सफल हो सकते हैं, लेकिन हम यहां वर्णित एक मजबूत और तंत्रिका तंत्र के इस क्षेत्र के लिए एक नए शोधकर्ता के लिए उपयुक्त होने के लिए लगता है ।
प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण पहलू प्रत्येक प्रमुख तंत्रिका की सही पहचान और एमपीजी ऊतक को पूरी तरह से हटाना है। ऊतकों को सावधानीपूर्वक देखने और हैंडलिंग के साथ, एमपीजी ऊतकों को शारीरिक, आणविक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल इन विट्रो अध्ययन18,19,20,21, 22के लिए हटाया जा सकता है। प्रोटोकॉल को वीवो प्रायोगिक हेरफेर23,24,25में भी अनुकूलित किया जा सकता है, यह देखते हुए कि इस मामले में, गैंगलियन से जुड़ी प्राथमिक नसों के संपर्क को कम करने या पास के वास्कुलचर को नुकसान पहुंचाने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। यदि प्रयोग में एक या अधिक नसों के व्यवधान से चयनात्मक निंदा की आवश्यकता होती है, तो पुनर्निरनीकरण और विश्लेषण ों को भ्रमित करने से रोकने के लिए कटे हुए तंत्रिका को पुनः उत्पन्न करने की सिफारिश की जाती है। इस विच्छेदन प्रोटोकॉल का उपयोग माउस के लिए भी किया जा सकता है, जहां तुलनात्मक कार्य26,27,28के साथ एक एमपीजी भी है।
न्यूरोएनाटिकल अध्ययनों के लिए, एंटीजन और ऊतक संरचना का सबसे अच्छा संरक्षण एमपीजी को एक एनेस्थेटाइज्ड जानवर से विच्छेदन करके प्राप्त किया जाता है जिसे प्रयोग29के लिए उपयुक्त हिस्टोलॉजिकल फिक्सेटिव के साथ ट्रांसकार्डियली रूप से पार कर दिया गया है ; हालांकि, इस प्रक्रिया के बाद गैंगलियन और तंत्रिका संरचनाओं की पहचान अधिक कठिन होती है, क्योंकि ऊतक रंगन खो जाता है। परफ्यूजन के बाद इस विच्छेदन के प्रयास से पहले गैर-परफेक्यड जानवरों से गैंगलियन की पहचान करने और विच्छेदन करने में कुशल बनने की सिफारिश की जाती है। इसी तरह, पहले पुरुषों में विच्छेदन में कुशल बनने की सिफारिश की जाती है क्योंकि समकक्ष उम्र और शरीर के आकार के जानवरों के लिए, एमपीजी और इससे जुड़ी तंत्रिकाएं महिलाओं में बहुत छोटी होती हैं।
यह मान्य करने के लिए कि हटाया गया ऊतक वास्तव में एमपीजी है, शोधकर्ता को पहले प्रत्येक प्राथमिक तंत्रिका के स्थान और विशेषताओं की जांच करने की सलाह दी जाती है। कई अक्षेत्रों को पेल्विक तंत्रिका और गुफानुमा तंत्रिका सबसे आसान सीटू में पहचान करने के लिए लगता है; हाइपोगैस्ट्रिक और सहायक तंत्रिकाएं आसपास के ऊतकों से अलग होने के लिए अधिक नाजुक और अधिक कठिन होती हैं। यदि ये तंत्रिकाएं अब विच्छेदन के दौरान समस्याओं के कारण उपलब्ध नहीं हैं, या यदि उनकी संरचना के बारे में अनिश्चितता है, तो यह सिफारिश की जाती है कि प्रारंभिक एमपीजी विच्छेदन को पारंपरिक हिस्टोरोलॉजी (न्यूरोनल सेल निकायों8की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए) और दूसरा इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ विशेषता है (यह पहचानने के लिए कि कोलिनर्जिक और नोराड्रेनेस दोनों न्यूरॉन्स30,31)(चित्र3)मौजूद हैं। प्रमुख नसों की सही पहचान को मान्य करने के लिए, गुफानुमा नसों को एमपीजी के करीब अपने प्रारंभिक भाग में न्यूरोनल सेल निकायों के उच्च घनत्व से आसानी से पहचाना जाता है; इन न्यूरॉन्स के अधिकांश कोलिनेर्गिक, नाइटर्जिक न्यूरॉन्स32,33के मार्कर एक्सप्रेस . पेल्विक, हाइपोगैस्ट्रिक और सहायक नसों में बहुत कम न्यूरोनल सेल बॉडी34होती है।
इस विच्छेदन के प्रदर्शन में कई आम नुकसान हैं। यदि नौसिखिया अक्षेत्रों प्रमुख नसों या MPG में से किसी को खोजने की समस्या है, वे कदम है कि प्रमुख स्थलों का वर्णन करने के लिए लौटने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । माइक्रोस्ट्रक्चर को खोजने पर इतना ध्यान केंद्रित करना बहुत आम है कि कोई स्थूल संदर्भ का ट्रैक खो देता है। सबसे अधिक, नौसिखिए डिससेक्टर या तो अपनी विच्छेदन साइट में बहुत दूर रोस्ट्रल चलते हैं या बहुत ‘सतही’- यानी, गहरे (यानी, अधिक पृष्ठीय) संरचनाओं की जांच करने के बजाय पेट के वेंट्रल खोलने के बहुत करीब रहते हैं। विच्छेदन के दौरान एक आम समस्या विच्छेदन के दौरान वास्कुलचर को नुकसान पहुंचाती है। यदि रक्तस्राव शुरू होता है, तो धीरे-धीरे स्रोत पर एक कपास-इत्तला देने वाला एप्लिकेटर पकड़ें जब तक रक्तस्राव बंद हो जाता है, तो विच्छेदन को फिर से शुरू करने से पहले क्षेत्र को उदारतापूर्वक खारा के साथ फ्लश करें। यह संभव है कि एमपीजी प्रयोगों के लिए उपयोग करने योग्य नहीं होगा यदि बहुत अधिक रक्त से दूषित या यदि विच्छेदन बहुत देर ी हो जाती है, जबकि रक्तस्राव को रोकने के लिए इंतजार कर रहा है। एक और आम विच्छेदन त्रुटि प्रोस्टेट ग्रंथि के कैप्सूल को नुकसान पहुंचाती है जो एमपीजी दृश्य और हटाने को काफी ख़राब करती है। यह कैप्सूल एक बहुत ही नाजुक संरचना है जो प्रोस्टेट की पार्श्व दीवार से वसा को हटाते समय आसानी से पंचर हो जाती है, भले ही केवल कपास-इत्तला देने वाले एप्लिकेटर का उपयोग करके। अंत में एमपीजी से जुड़ी मुख्य तंत्रिकाएं हर एक की पहचान करने की प्रक्रिया के दौरान और फिर एमपीजी को हटाने के दौरान आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती हैं। अक्षेत्रों को एक नियमित विकसित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है जिससे प्रत्येक तंत्रिका को एक विशेष क्रम में अलग-थलग कर दिया जाता है, ताकि गैंगलियन हटाने के अंतिम चरणों के दौरान भ्रम की कम अवसर हो ।
इस विच्छेदन ने सहायक नसों के प्रत्येक घटक को विशिष्ट अंगों में ट्रेस करने या श्रोणि गंगलिया और श्रोणि अंगों8के बीच विभिन्न बिंदुओं पर झूठ बोलने वाले कई माइक्रोगांगलिया में से प्रत्येक की पहचान करने की कोशिश नहीं की। विशिष्ट दाग ों का उपयोग किए बिना वीवो में कल्पना करना काफी मुश्किल है; हालांकि, उन्हें अंगों की ओर प्रत्येक तंत्रिका ट्रैक्ट का पालन करके हटाया जा सकता है, और गैंगलियन स्थान निर्धारित करने के लिए विशिष्ट तंत्रिका दाग पोस्ट तदर्थ का उपयोग करके। ये माइक्रोगाग्लिया, भले ही एमपीजी की तुलना में न्यूरोनल आबादी का केवल छोटा सा अंश शामिल है, उन अंगों को विशिष्ट प्रकार के इनपुट प्रदान कर सकते हैं जिनके लिए वे सबसे बारीकी से स्थित हैं। हम यहां क्षेत्र में एक सीमा पर ध्यान दें कि न तो इन माइक्रोगाग्लिया और न ही एमपीजी से बाहर निकलने वाले कई छोटे तंत्रिका क्षेत्रों को पेल्विक अंगों की यात्रा करने के लिए अभी तक मोटे तौर पर नाम स्वीकार किए जाते हैं । इसके अलावा, मादा चूहों में माइक्रोगांगलिया का इसी तरह का विस्तृत अध्ययन अभी तक नहीं किया गया है।
संक्षेप में, प्रोटोकॉल और योजनाबद्ध यहां प्रदान की प्राथमिक श्रोणि अंगों को स्वायत्त तंत्रिका आपूर्ति प्रदान संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करते हैं, साथ ही साथ lumbosacral पृष्ठीय जड़ से संवेदी नसों के प्रमुख परिधीय नाली गंगलिया जो एमपीजी के माध्यम से श्रोणि अंगों के लिए यात्रा करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए अनुसंधान को निदेशक, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, परिधीय गतिविधि को राहत देने के लिए परिधीय गतिविधि (SPARC) कार्यक्रम, पुरस्कार संख्या OT2OD023872 । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है । डॉ केस्ट की प्रयोगशाला में डॉ बर्ट्रेंड की फैलोशिप का वित्तपोषण किया गया था: एनीम्स के विश्वविद्यालय अस्पताल, मोंटपेलियर-नेम्स के मेडिसिन संकाय, एसोसिएशन फ्रैंकाइज डी चिरुर्गी (एएफसी), द सोसिएट इंटरडिस्किलिनियर फ्रैंकोफोन डी’UroDynamique एट de Pelvipérinéologie (SIFUD-पीपी) और पीपुल्स प्रोग्राम (मैरी क्यूरी एक्शन) यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) के REA अनुदान समझौते के तहत कोई PCOFUND-GA-2013-609102, परिसर द्वारा समन्वित प्रेस्टीज कार्यक्रम के माध्यम से फ़्रांस.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |