La oxidación fotoquímica rápida in vivo de proteínas (IV-FPOP) es una técnica de huella de proteína sinterión radical hidroxilo que permite mapear la estructura proteica en su entorno nativo. Este protocolo describe el montaje y la configuración del sistema de flujo microfluídico IV-FPOP.
La oxidación rápida de proteínas (FPOP) es un método de huella de proteína sradical hidroxilo (HRPF) utilizado para estudiar la estructura de proteínas, las interacciones proteína-ligand e interacciones proteína-proteína. FPOP utiliza un láser excimer KrF a 248 nm para la fotólisis de peróxido de hidrógeno para generar radicales hidroxilo que a su vez oxidativamente modifican las cadenas laterales de aminoácidos solventes accesibles. Recientemente, ampliamos el uso de FPOP de etiquetado oxidativo in vivo en Caenorhabditis elegans (C. elegans), titulado IV-FPOP. Los nematodos transparentes se han utilizado como sistemas modelo para muchas enfermedades humanas. Los estudios estructurales realizados en C. elegans por IV-FPOP son factibles debido a la capacidad del animal para la toma de peróxido de hidrógeno, su transparencia a la irradiación láser a 248 nm y la naturaleza irreversible de la modificación. El montaje de un sistema de flujo microfluídico para etiquetado IV-FPOP, parámetros IV-FPOP, extracción de proteínas y parámetros optimizados LC-MS/MS se describen aquí.
La huella proteica acoplada a la espectrometría de masas (EM) se ha utilizado en los últimos años para estudiar las interacciones proteicas y los cambios de conformación. Los métodos de huella de proteína sorplícea radical (HRPF) sondean la accesibilidad de los disolventes de proteínas mediante la modificación de las cadenas laterales de aminoácidos de proteínas. El método HRPF, la rápida oxidación fotoquímica de proteínas (FPOP)1, se ha utilizado para sondear la estructura proteica in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3, y más recientemente in vivo (IV-FPOP)4. FPOP utiliza un láser excimer de longitud de onda de 248 nm con el fin de generar rápidamente radicales hidroxilo por fotólisis de peróxido de hidrógeno para formar radicales hidroxilo1. A su vez, estos radicales pueden etiquetar 19 de 20 aminoácidos en una escala de tiempo de microsegundos, más rápido de lo que las proteínas pueden desplegarse. Aunque, la reactividad de cada aminoácido con radicales hidroxilo se extiende 1000 veces, es posible normalizar la oxidación de la cadena lateral calculando un factor de protección (PF)5.
Dado que el FPOP puede modificar oxidativamente las proteínas independientemente de su tamaño o secuencia primaria, resulta ser ventajoso para los estudios de proteínas en las células e in vivo. IV-FPOP sondas la estructura proteica en C. elegans de forma similar a los estudios in vitro y en células4. C. elegans son parte de la familia de los nematodos y son ampliamente utilizados como modelo para estudiar enfermedades humanas. La capacidad del gusano para la adquisición de peróxido de hidrógeno por difusión pasiva y activa permite el estudio de la estructura proteica en diferentes sistemas corporales. Además, los C. elegans son adecuados para IV-FPOP debido a su transparencia en la longitud de onda láser de 248 nm necesaria para FPOP6. El acoplamiento de este método a la espectrometría de masas permite la identificación de múltiples proteínas modificadas utilizando enfoques proteómicos tradicionales de abajo hacia arriba.
En este protocolo, describimos cómo realizar IV-FPOP para el análisis de la estructura proteica en C. elegans. El protocolo experimental requiere el montaje y la configuración del sistema de flujo microfluídico para IV-FPOP adaptado de Konermann et al7. Después de IV-FPOP, las muestras se homogeneizan para la extracción de proteínas. Las muestras de proteínas son proteolizadas y los péptidos son analizados por ms tándem de cromatógrafo líquido (LC), seguido de cuantificación.
El punto de referencia actual para el estudio de las interacciones proteína-proteína in vivo (PPI) es la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En su forma más simple, esta técnica estudia EL IBP por transferencia de energía entre dos moléculas cuando están muy cerca unas15. A diferencia de las técnicas de EM, FRET no tiene la resolución de caracterizar los cambios de conformación y los sitios de interacción a nivel de aminoácidos. Las técnicas basadas en la EP se han utilizado cada vez más para el estudio del IBP16. IV-FPOP es un método HRPF que permite el análisis estructural de proteínas in vivo en C. elegans. Con el fin de etiquetar con éxito C. elegans por IV-FPOP, es importante montar correctamente el sistema de flujo microfluídico para reducir la pérdida de muestra. El capilar de 250 m i.d. ha demostrado maximizar la recuperación4de la muestra en comparación con los capilares 4 más pequeños. Los capilares i.d. más grandes no han sido probados, sin embargo el sistema de flujo microfluídico está diseñado utilizando un capilar con el mismo i.d. que un sistema de citometría de flujo disponible comercialmente para la clasificación de C. elegans. 17 El tamaño de la muestra de gusano también es importante, un tamaño de muestra inferior a 10.000 euros por muestra anterior a FPOP no produce concentraciones de proteínas lo suficientemente altas como para el análisis de LC-MS/MS. También se pueden utilizar tamaños de muestras más altos (>10.000 gusanos) ajustando el volumen inicial (paso 4.5).
El montaje adecuado del sistema de flujo microfluídico es importante. Las fugas en la vía de la muestra dan lugar a un flujo inconsistente de los gusanos o H2O2. Las férulas, manguitos y 3-2 válvulas se pueden reutilizar de múltiples experimentos IV-FPOP si se limpian correctamente después de cada experimento. Sin embargo, recomendamos ensamblar un nuevo sistema de flujo microfluídico para cada réplica biológica. Si los microfluídicos se montan correctamente, los gusanos y H2O2 se mezclarán en la mezcla-T con una contrapresión mínima. Como control de calidad (QC) del sistema de flujo microfluídico, recomendamos probar la eficiencia de mezcla utilizando colorantes de color. Es importante controlar el movimiento de los agitadores magnéticos dentro de la jeringa de gusano durante el IV-FPOP, la mezcla incorrecta de muestras en la jeringa de gusano o la mezcla-T puede resultar en la contrapresión que causa fugas. Además, las malas condiciones de mezcla conducen a grandes pérdidas de muestra, mala exposición láser de gusanos en la ventana láser y obstrucción.
El mantenimiento de C. elegans es importante para disminuir la oxidación del fondo. Recomendamos cultivar los gusanos a bajas temperaturas en condiciones de baja tensión, ya que las altas temperaturas pueden afectar a la oxidación total del fondo. Se recomienda un conjunto de muestras de control de gusanos solamente, sin H2O2 y sin irradiación láser, para todos los experimentos IV-FPOP para tener en cuenta la oxidación de fondo debido al mantenimiento de laboratorio. Una de las limitaciones actuales de esta técnica es el número total de péptidos modificados oxidativamente identificados y el número total de residuos oxidados por péptido con el fin de obtener mayor información estructural proteica. Aunque no se recomienda, un aumento en las modificaciones oxidativas podría lograrse mediante el uso de concentraciones más altas de peróxido de hidrógeno. Un aumento en el peróxido de hidrógeno podría alterar significativamente las vías biológicas importantes, así como conducir a un desarrollo inducido por la oxidación. Si se aumenta la concentración de peróxido de hidrógeno para IV-FPOP, se recomienda probar la viabilidad del gusano y la oxidación de fondo, ya que no se han probado concentraciones superiores a 200 mM.
El protocolo LC-MS/MS descrito se puede optimizar y modificar para cumplir con el control de calidad MS de otros laboratorios. El uso de técnicas de cromatografía 2D se ha demostrado previamente para aumentar la identificación de péptidos y proteínas modificados oxidativamente18. No obstante, no se recomiendan técnicas de enriquecimiento de proteínas que se dirigen a una proteína específica de interés, incluyendo pero no limitado a la precipitación de anticuerpos o ensayos de extracción. Estas técnicas pueden sesgar hacia un conformador de proteínas si el sitio de epítopo/unión de la proteína ha sido modificado oxidativamente por IV-FPOP. Los nuevos desarrollos en la huella de reactivos radicales, como el anión radical de sulfato10 o la trifluorometilación19 podrían aumentar la versatilidad de IV-FPOP. Aunque el único reactivo de etiquetado probado in vivo hasta ahora es el peróxido de hidrógeno, otros radicales activados por láser podrían optimizarse. El uso de otros radicales debe ser compatible con la viabilidad del gusano, permeable a la célula y la longitud de onda láser de 248 nm. Debido al uso de C. elegans como un sistema modelo para muchas enfermedades humanas, IV-FPOP tiene el potencial de tener un fuerte impacto en el estudio del papel de la estructura proteica en la patogénesis de la enfermedad.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Start-up de la Universidad de Maryland, Baltimore y el NIH 1R01 GM 127595 otorgado a LMJ. Los autores agradecen al Dr. Daniel Deredge su ayuda en la edición del manuscrito.
15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |