Summary
Proteinlerin in vivo hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IV-FPOP) kendi doğal ortamında protein yapısının haritalanması için izin veren bir hidroksil radikal protein ayak izi tekniğidir. Bu protokol, IV-FPOP mikroakışkan akış sisteminin montajını ve kurulumünü açıklar.
Abstract
Proteinlerin hızlı oksidasyonu (FPOP), protein yapısı, protein-ligand etkileşimleri ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılan hidroksil radikal protein ayak izi (HRPF) yöntemidir. FPOP, hidrojen peroksit fotolizi için 248 nm'de krf excimer lazer kullanır ve hidroksil radikalleri oluşturur ve bu lazerler oksidatif olarak çözücü olarak erişilebilen amino asit yan zincirleri değiştirir. Son zamanlarda, Biz Caenorhabditis elegans in vivo oksidatif etiketleme FPOP kullanımını genişletti(C. elegans),IV-FPOP başlıklı. Şeffaf nematodlar birçok insan hastalığı için model sistemler olarak kullanılmıştır. IV-FPOP tarafından C. elegans yapısal çalışmalar hidrojen peroksit alımı için hayvan Yeteneğini nedeniyle uygulanabilir, lazer ışınlama şeffaflık 248 nm, ve modifikasyon geri dönüşü olmayan doğası. IV-FPOP etiketleme, IV-FPOP parametreleri, protein ekstraksiyonu ve LC-MS/MS optimize edilmiş parametreler için mikroakışkan akış sisteminin montajı burada açıklanmıştır.
Introduction
Protein ayak izi kütle spektrometresi (MS) ile birleştiğinde son yıllarda protein etkileşimleri ve konformasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır. Hidroksil radikal protein ayak izi (HRPF) yöntemleri protein amino asit yan zincirleri değiştirerek protein çözücü erişilebilirliğini araştırmak. HRPF yöntemi, proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu (FPOP)1, in vitro protein yapısını araştırmak için kullanılmıştır2, hücre içi (IC-FPOP)3, ve en son in vivo (IV-FPOP)4. FPOP hızla hidroksil radikalleri oluşturmak için hidrojen peroksit fotolizi ile hidroksil radikalleri oluşturmak için bir 248 nm dalga boyu excimer lazer kullanır1. Buna karşılık, bu radikaller 20 amino asitten 19'unu mikrosaniye ölçeğinde etiketleyebilirler, proteinlerin ortaya çıkabileceğinden daha hızlı. Her amino asitin hidroksil radikallerle olan reaktivitesi 1000 kat uzamasına rağmen, bir koruma faktörü (PF)5hesaplanarak yan zincir oksidasyonunu normalleştirmek mümkündür.
FPOP proteinleri büyüklüklerine veya primer sekanslarına bakılmaksızın oksidatif olarak değiştirebildiği için, hücre içi ve in vivo protein çalışmaları için avantajlı olduğunu kanıtlamaktadır. IV-FPOP, C. elegans'taki protein yapısını in vitro ve hücre içi çalışmalara benzer şekilde inceler4. C. elegans nematod ailesinin bir parçasıdır ve yaygın insan hastalıkları çalışma için bir model olarak kullanılır. Solucanın hem pasif hem de aktif difüzyon ile hidrojen peroksit alabilme yeteneği farklı vücut sistemlerinde protein yapısının incelenmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, C. elegans FPOP6için gerekli 248 nm lazer dalga boyu kendi şeffaflık nedeniyle IV-FPOP için uygundur. Bu yöntemin kütle spektrometresi ile birleşmesi, geleneksel aşağıdan yukarıya proteomik yaklaşımlar kullanarak birden fazla modifiye proteinin belirlenmesine olanak sağlar.
Bu protokolde, C. elegansprotein yapısının analizi için IV-FPOP nasıl gerçekleştirilin ilerler. Deneysel protokol, Konermann ve ark7'denuyarlanan IV-FPOP için mikroakışkan akış sisteminin kurulmasını ve kurulmasını gerektirir. IV-FPOP'tan sonra proteinler protein ekstraksiyonu için homojenize edilir. Protein örnekleri proteozize edilir ve peptidler sıvı kromatograf (LC) tandem MS ile analiz edilir ve ardından nicelleştirme yapılır.
Protocol
1. C. elegans bakım ve kültür
- Büyümek ve standart laboratuvar prosedürleri 8 aşağıdaki dördüncü larva (L4) aşamasına solucan kolonileri senkronize.
- IV-FPOP deney günü, Bakteriyel çimenlerden L4 solucanları yıkayın (OP50 E. coli)M9 tampon (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2HPO4, 0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- IV-FPOP numunesi başına ~10.000 solucanın 500 μL aliquot'u edinin.
2. Mikroakışkan akış sistemi montajı
- 2 cm'lik florlu etilen propilen (FEP) boru (1/16 in. dış çap (o.d.) x 0,020 iç çapı (i.d.)) keserek akış sistemi montajını başlatın.
- Temiz bir kesme iğnesi kullanarak, FEP borularının iliğini genişleterek sadece bir ucunda küçük bir krater, ~50 mm uzunluğunda olun. Krater, erimiş iki adet 360 μm o.d. parçasını sığdıracak kadar büyük olmalıdır.
NOT: Bu uç sadece çıkış kılcal sığdırmak için kullanılacak gibi ters ucu genişletmeyin. - Bir seramik kesici ile, 250 μm i.d. erimiş silika iki 15 cm adet kesti. Bu iki parça akış sisteminin infüzyon hatları olacak.
- Kendinden yapışkanlı bant kullanarak, iki 250 μm i.d. kılcal damarları birbirine paralel ve uçları%100 kızartılır sağlamak için bantlayın.
NOT: Erimiş silika uçlarının kesimden sonra ezilememesi ve düz ve %100 birbirine kızarmaması için büyüteç le veya stereo mikroskop altında incelenmesi tavsiye edilir. - İki bantlı kılcal damarı FEP borunun el yapımı kraterine takın. Kılcal damarları el yapımı kraterin kenarına doğru itin.
DİkKAT: Akış sisteminin etkinliğini korumak için, el yapımı kraterin ötesine itmeyin (Şekil 1a). - Temiz bir yüzeye epoksi reçine küçük bir nokta yerleştirin ve bir kesme iğnesi ile karıştırın.
- Hızlı bir şekilde, aynı iğneyi kullanarak, FEP tüpü ile bağlanan ve rekarin kurumasını sağlamak, çıkış tarafı kadar asılı, birkaç dakika için infüzyon kılcal damarların sonuna rezorin küçük bir damla yerleştirin(Şekil 1a).
- Rezorin kururken, FEP tüpü ve iki kılcal damarı birbirine bağlayarak, yeni bir 250 μm i.d. kılcal damar ı kesin. Yeni kılcal akış sisteminin çıkış kılcal olacak. Kılcal damarın istenilen uzunluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir:
L santimetre olarak kesilecek kılcal damar uzunluğu, t dakika içinde istenilen reaksiyon süresi, f mL /min akış hızı, i.d. santimetre olarak kapiller iç çapıdır.
NOT: Çıkış kılcal damarını kestikten sonra uçları düz ve ezmemesini sağlayarak inceleyin. - Rezorin kuruduktan sonra, fep boru çıkış ucundan yeni kılcal yerleştirin. Çıkış kılcal ve iki infusing kılcal damarların iç uçları FEP tüpü içinde birbirlerine karşı floş olmalıdır, bu karıştırma-T oluşturur (Şekil 1b).
- 2.6 ve 2.7 adımlarında açıklandığı gibi çıkış kılcal damarını ve FEP tüplerini taze epoksi reçine ile bağlayın.
- Reişin bir gecede kurumasını bekleyin ve akış sistemini birbirine bağlayın. Ertesi gün mikroakışkan akış sistemini kurmak(Şekil 1c).
3. In vivo FPOP için mikroakışkan akış sistemi
- Bir 5 mL şırınganın içine dört manyetik karıştırıcı yerleştirin. Bu şırınga örnek şırınga olur. Manyetik karıştırıcılar IV-FPOP sırasında şırınga nın içine yerleşen solucanları önler (Şekil 2A).
- İki 5 mL şırıngayı M9 ile doldurun. Onlar akış hızı ve karıştırma verimliliği etkileyebilir gibi her şırınga içinde hiçbir hava kabarcıkları olduğundan emin olun.
- Luer adaptörünü her 5 mL şırıngaya bağlayın ve parmaklarını sıkıca sıkıtutun ve yerinde sabitlenin.
- Her şırıngayı tek bir 3-2 valfine takın. Şırınga vananın orta noktasına takılmalıdır(Şekil 2B).
- Her 5 mL şırıngayı çift şırınga pompasına sabitleyin ve itici bloğundan şırınganın aşırı basıncını önlemek için mekanik stop yakasını ayarlayın. Stop yakasını ayarlarken manyetik karıştırıcıların eklenmesini unutmayın.
- Ev yapımı mikroakışkan akış sisteminin her bir infusing kapiller ucunu süper flangeless somunu, FEP kılıfı ve süper flangeless ferrule kullanarak her 3-2 valfin üst portuna takın (Şekil 2B).
- 3-2 valfin (alt bağlantı noktası) kalan açılan bağlantı noktasına, süper flangeless somunu, FEP kılıfı ve süper flangeless ferrule kullanarak 10 cm 450 μm i.d. kılcal damar ı takın (Şekil 2B). Bu kılcal damarlar geri çekilen örnek kılcal damarlar haline gelir.
- Pompa akışını başlatın ve mikroakışkan akış sisteminin tüm bağlantılarını görsel sızıntılar için kontrol edin. Deneysel akış hızını kullanarak en az üç şırınga hacmi akışı. Son akış hızı lazer ışınlama penceresine, lazer frekansına ve sıfır dışlama fraksiyonhacmine bağlıdır.
NOT: Bu protokol için 2,55 mm, 250 μm i.d. erimiş silika, sıfır dışlama fraksiyonu ve 50 Hz frekanslı lazer ışınlama penceresinden 375,52 μL/dk nihai akış hızı hesaplanmıştır.- Akış yolu 3-2 valf sapındaki oklarla işaretlenir. Her şırınga, valf kolunun sınır dışı konumundan geri çekilme pozisyonuna taşınması yla manuel olarak doldurulabilir.
NOT: 3-2 valftaki sızıntılar süper flangeless somunu yeniden vidalayarak veya vana bağlantılarından herhangi birinin (süper flangeless somunu, FEP kılıfı veya süper flangeless ferrule) değiştirilmesiyle düzeltilebilir. Karıştırma-T'deki sızıntılar mikroakışkan akış sisteminin yeniden bir araya alınmasını gerektirir (2.1-2.11. adımlar).
- Akış yolu 3-2 valf sapındaki oklarla işaretlenir. Her şırınga, valf kolunun sınır dışı konumundan geri çekilme pozisyonuna taşınması yla manuel olarak doldurulabilir.
- Mikroakışkan akış sistemini deneysel tezgaha taşıyın ve 360 μm paslanmaz çelik birliğini kullanarak çıkış kılcal damarını yayılan aşamaya sabitle(Şekil 2C,D).
- Uzun menzilli bir çakmak kullanarak, lazer ışınlama penceresinde erimiş silika nın kaplamasını yakın. Yanmış kaplamayı tüy bırakmayan doku ve metanol kullanarak temizleyin.
NOT: Aşırı ısı eriyebileceği ve/veya kılcal damarı kırabileceğinden kapillerin aşırı ısınmasını önlemek için yanma döngüleri ve metanol temizleme döngüleri arasında geçiş yapabilirsiniz. - Manyetik karıştırıcı bloğunu manyetik karıştırıcıları içeren 5 mL şırınganın üzerine yerleştirin. Manyetik karıştırıcı bloğunun hızını ve konumunu, 5 mL şırınganın içindeki manyetik karıştırıcıların yavaş ve sürekli dönmesini sağlayacak şekilde ayarlayın.
4. In vivo FPOP
- KrF excimer lazerini açın ve thyratron'un ısınmasını bekleyin.
DİkKAT: Lazer, gözlere zarar verebilecek 248 nm dalga boyunda görünür ve görünmez radyasyon yayar. Lazeri açıp ışın çıkış penceresini açmadan önce uygun göz koruması takılmalıdır. - Lazer enerjisini en az 100 darbe için 50 Hz frekansta, optik sensörü ışın çıkış penceresine yerleştirerek ölçün.
NOT: Bu protokol için 150 ± 2,32 mJ lazer enerjisi ile 2.55 mm ışınlama penceresi kullanılmıştır. - Yaklaşık 10.000 solucan (500 μL) edinin ve numuneyi numune şırıngasına el ile çekin.
- 3 mL'lik son numune hacmi için numune şırıngasını 2,5 mL M9 tamponuyla doldurun. Numune şırıngasına hava kabarcıkları girmediğinden emin olun.
- İkinci şırıngayı 3 mL 200 mM H2O2ile doldurun , yine şırıngaya hava kabarcıkları girmemesini sağlar.
- Çıkış kılcal damarının sonunda, 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) içeren alüminyum folyoya sarılmış 15 mL konik tüp ve h2 O2,hidroksil radikalleri ve methionin süloksit redüktaz aktivitesini söndürmek için %1 dimetil sülfoksit yerleştirin.
- Excimer lazerini yazılım penceresinden başlatın, ilk darbeyi bekleyin ve çift şırıngadan örnek akışını başlatın.
NOT: Numuneler 3 örnek altında teknik trikifler halinde biyolojik tekrarlar halinde çalıştırılmalıdır: H2O2 (örnek) ile lazer ışınlama, H2O2 ile lazer ışınlama ve hiçbir lazer ışınlama h2O2 (kontroller), biyolojik set başına 9 örnek toplam. - Numune şırıngasından gelen bazı geri basınç bazen birikebileceğinden, numunenin tamamını 15 mL tüpte toplayın ve herhangi bir görsel sızıntı için numune akışını aktif olarak izleyin.
- IV-FPOP'tan sonra, 2 dk için 805 x g santrifüjlü pelet solucanları söndürme solüsyonu çözeltisini çıkarın, 250 μL lysis tamponu ekleyin (8 M üre, %0.5 SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenilmetilülfonil florür [PMSF]) ekleyin. Numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, flaş dondurun ve numune sindirimi kadar -80 °C'de saklayın.
5. Protein ekstraksiyonu, saflaştırma ve proteozis
- Buzüzerinde dondurulmuş örnekleri eritmek ve 10 s için sonication tarafından homojenize, 60 s buz kuluçka takip. Birden fazla sonication tur gerekli olabilir, homojen bir stereomikroskop altında bir mikroskop slayt üzerinde 2 μL örnek aliquot yerleştirerek görülebilir. Küçük ve hiç solucan parçası görülmediğinde örnek homojenizasyon tamamlanır.
- 4 °C'de 5 dakika 400 x g'de homojenize solucanları santrifüj edin ve süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
- Üreticinin talimatlarını kullanarak bicinchoninic asit testini (BCA tsay) kullanarak örnek protein konsantrasyonlarını belirleyin.
NOT: Numune konsantrasyonu herhangi bir biyokimyasal protein konsantrasyonu sonucu seçilebilir. Lysis tamponu ile reaktif uyumluluğunu unutmayın (8 M üre, %0.5 SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Ayrıca, bir tampon seyreltme gerekli olabilir. - Her numuneden 100 μg protein alın ve temiz mikrosantrifüj tüplere yerleştirin.
- Tüm numunelerde disülfür bağlarını azaltmak için 10 mM'lik son konsantrasyona dithiothreitol (DTT) ekleyin. Girdap, aşağı spin ve 45 dakika boyunca 50 °C'de inkübasyon örnekleri.
- Numuneleri 10 dk oda sıcaklığına kadar soğutun.
- Azaltılmış kalıntıları alkillemek için 50 mM'lik son konsantrasyona iodoacetamide (IAA) ekleyin. Vorteks, aşağı spin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübasyon örnekleri.
- Alkililasyondan hemen sonra, protein örneğini 4 cilt önceden soğutulmuş aseton ekleyerek çökün ve gece boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün, pelet protein10 dakika için 16.000 x g santrifüj tarafından çökelti.
- Protein peletini 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL) olarak yeniden askıya alın. 1:50 (w/w) protein oranına son bir proteazda tripsin ekleyin ve numuneleri bir gecede 37 °C'de sindirin.
- Ertesi gün% 5 formik asit ekleyerek tripsin sindirim reaksiyonu söndürmek.
NOT: LC-MS/MS analizi için numune başına en az 0,5 μg peptid gereklidir (6.1-6.5 adım). Üreticiprotokolünde açıklandığı gibi nicel kolorimetrik peptit testini (Malzemeler Tablosunabakın) kullanarak örnek peptid konsantrasyonlarını belirleyin.
6. Yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS)
- Aşağıdaki LC mobil fazlarını kullanın: %0,1 FA (A) ve %0,1 FA (B) ile ACN'de su.
- C18 (5 μm, 100 Å) içeren bir tuzak kolonuna 0,5 g peptid yükleyin ve 15 μL/dk akış hızında 15 dakika için %99 çözücü A ve %1 B ile yıkama numunesi alın.
- C18 ters faz malzemesine (5 μm, 125 Å) sahip şirket içi paketlenmiş kolonu (0,075 mm i.d. × 20 mm) kullanan ayrı peptidler.
- Aşağıdaki analitik ayırma yöntemini kullanın: degrade 120 dk için 300 nL/dk pompalandı: 0−1 dk, %3 B; 2−90 dk, %10−45 B; 100−105 dk, %100 B; 106−120 dk, %3 B.
- Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanarak pozitif iyon modunda nano-elektrosprey iyonizasyonunda (nESS) peptidlerin veri edinimi gerçekleştirin.
NOT: Bu protokol için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi için ultra performanslı lc (UPLC) alet çift kullanılmıştır. Veri bağımlı toplama kullanılmıştır. MS1 için m/z tararma aralığı 60.000 çözünürlükte 3750-1500 ve 60 s dinamik dışlama idi. +1 ve >6 şarj durumlarına sahip iyonlar hariç tutuldu. Maksimum enjeksiyon süresi 50 ms ve yoğunluk eşiği 5.5e4 olan otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi kullanıldı. MS2 için seçilen iyonlar % 32 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi kullanılarak yüksek enerjili çarpışma dissosiyaasyonuna (HCD) parçalanmaya maruz kaldı. Spektrometrede 15.000 çözünürlüğe ve 5.0e4 AGC hedefine sahip parça iyonları tespit edildi.
7. Veri analizi
- C. elegans veritabanına karşı aşağıdan yukarıya proteomik analiz yazılımı ile tandem MS dosyalarını arayın.
- Protein analizi arama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: bir tripsin cevapsız dekolte, 375-1500 m/z peptit kütle aralığı, 0,02 parça kütle toleransı ve 10 ppm öncül kütle toleransı. Karbamidomethylation statik bir modifikasyon olarak ayarlanır ve tüm hidroksil radikal yan zincir modifikasyonları biliyorum9,10 dinamik olarak. Peptit tanımlama% 95 güven (orta) ve kalıntı% 99 güven (yüksek) olarak kurulmuştur. Yanlış bulma oranı (FDR) %1 olarak ayarlanır.
- Verileri elektronik bir veritabanına aktarın ve11'inaltındaki denklemi kullanarak peptid veya kalıntı başına oksidasyonun kapsamını özetleyin:
NOT: EIC alanının modifiye edildiği yerde, oksidatif modifikasyon ile peptid veya kalıntının çıkarılan iyon kromatografik alanı (EIC) ve EIC alanı oksidatif modifikasyon ile aynı peptid veya kalıntının toplam alanıdır.
Representative Results
IV-FPOP için kullanılan mikroakışkan akış sisteminde, H2O2 ve solucanlar lazer ışınlamadan hemen öncesine kadar ayrı tutulur. Bu ayrım endojen katalaz ve diğer hücresel mekanizmalar12tarafından H2O2 dökümünü ortadan kaldırır. 250 μm i.d. kapiller in kullanımı iki biyolojik kopyada %63-89 arasında toplam numune geri kazanımı gösterirken, 150 μm i.d. kapiller sadece %21-31 iyileşme gösterir(Şekil 3A). Daha büyük bir i.d. kılcal (250 μm) kullanımı, IV-FPOP ve tek solucan akışı sırasında daha iyi solucan akışına(Şekil 3B)daha küçük bir i.d. kılcal damar (150 μm)(Şekil 3C)ile karşılaştırıldığında yol açar. 150 μm i.d. kılcal damar tek bir solucan akışına izin vermez(Şekil 3C)ve birden fazla solucanın tek bir solucan başına lazer maruziyet miktarını azaltan lazer ışınlama penceresinde birlikte aktığı görülür.
IV-FPOP, C. elegans'tasolvent erişilebilirliğini araştıran kovalent bir etiketleme tekniğidir. Şekil 4A, fpop modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş bir peptitin temsili çıkarılan iyon kromatogramlarını (EIC) gösterir. Hidroksil radikal etiket oksidatif modifiye peptidlerin kimyasını değiştirir, böylece FPOP modifiye peptidler daha polar hale. Ters faz kromatografisinde IV-FPOP modifiye peptidler, değiştirilmemiş peptidlere göre daha erken retansiyon sürelerine sahiptir. İzole peptidlerin MS/MS parçalanması oksidatif olarak modifiye edilmiş kalıntıların tanımlanmasını sağlar(Şekil 4B).
IV-FPOP, C. elegans içinde iki biyolojik kopyada toplam 545 proteinin oksidatif olarak modifiye edilmiş olduğunu göstermiştir(Şekil 5A,B). Protein ayak izi yöntemi olarak IV-FPOP'un bir avantajı, tekniğin solucanlar içindeki çeşitli vücut sistemlerinde proteinleri değiştirme yeteneğine dayanır(Şekil 5C). Bu yöntem, solucan ın içindeki vücut dokusu veya organıne bakılmaksızın protein yapısını ve protein etkileşimini araştırmaya olanak sağlar. Ayrıca, tandem MS analizi iv-FPOP probları solvent erişilebilirlik in vivo doğrular. Miyozin şaperon proteini UNC-45 ile kompleks olan ısı şok proteini 90 'ın (Hsp90) oksidasyon paterni analiz edilmiştir(Şekil 6). Hsp90 için MS/MS analizi dört oksidatif modifiye kalıntı(Şekil 6C,D),FPOP modifikasyonunun normalleştirilmiş kapsamını (ln(PF))5 gösterir Hsp90'ın kalıntısı M698'in UNC-45'e(Şekil 6C)bağlı yken R697, E699 ve E700 artıklarından daha az çözücü olarak erişilebilir olduğunu göstermektedir. Oksidasyondaki bu farklılıklar literatür solvent erişilebilir yüzey alanı (SASA) hesaplamaları (PDB 4I2Z13)ile doğrulanır. Kalıntı M698, r697, E699 ve E700 kalıntıları ile karşılaştırıldığında gömülü bir kalıntı olarak kabul edilir 0.03 sasa değerine sahiptir(Şekil 6C). 14.000
Şekil 1. In vivo FPOP mikroakışkan akış sistemi şeması. (A) IV-FPOP akış sisteminin iki infüzyon çizgisi (turuncu) FEP borusu içinde gösterilir (sarı), epoksi reçinenin doğru bağlanma pozisyonu açık mavi daire ile gösterilir. (B) Üç 250 μm i.d. kılcal damardan oluşan komple birleştirilmiş karıştırma-T. Priz kılcal damarının FEP borusundaki doğru rezorin bağlama pozisyonu açık mavi daire ile temsil edilir. (C) C. elegansin vivo kovalent etiketleme için komple monte akış sistemi . FPOP'tan önce solucanlar H2O2'den etiketlemeden hemen öncesine kadar ayrı tutulur; lazer ışınlama penceresi açık mavi gösterilir ve lazer ışını mor yıldırım ile temsil edilir. Rakamlar ölçeklendirilmeyecek. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. IV-FPOP sırasında mikroakışkan sistem. (A) 5 mL şırınga içinde C. elegans temsili resim. Karıştırmadan, solucanlar şırınganın altına yerleşirler (solda). Manyetik karıştırıcılar ve karıştırıcı bloğu IV-FPOP deneyleri sırasında solucanları süspansiyonda tutar (sağda). (B) 5 mL şırınganın, kılcal damar alamının ve 3-2 valile bağlı kılcal damarların çekilmesinin temsili resmi. 3-2 valf kolu geri çekme pozisyonunda gösterilir. (C) IV-FPOP sırasında mikroakışkan akış sistemi, manyetik karıştırıcı bloğu solucanların 5 mL şırınga üzerinde konumdur. (D) Çıkış kılcal damarı yayılan evreye sabitlenmiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. C. elegans akışı ve kurtarma iki i.d. kılcal damarlar kullanılarak karşılaştırılması. (A) 250 (gri) ve 150 (siyah) μm i.d. kılcal damarlı iki biyolojik çoğaltma (BR) için IV-FPOP sonrası solucanların yüzde geri kazanımı. Hata çubukları, teknik triplicates arasında standart sapma hesaplanır. C. elganlar lazer ışınlama penceresinden 250 μm(B) ve 150 μm(C)yani kılcal damarlardan akar. Solucanlar daha sıkı küçük kılcal sıkıştırılmış. 150 μm i.d. kılcal damar solucanların kümelenme gösterir. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. IV-FPOP sonrası Temsilci LC-MS/MS sonuçları. (A) Bir FPOP modifiye peptid (kırmızı) ve değiştirilmemiş (mavi) EIC. Seçilen peptid aktin-1 proteinine aittir. (B) MS/MS spektrumu iki katı olarak yüklenmemiş aktin-1 peptid 317-327. (C) MS/MS spektrumu iki katı olarak yüklü FPOP modifiye aktin-1 peptid 317-327, bu örnekte P323 oksidatif olarak modifiye edildi (y5+ iyon, kırmızı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. IV-FPOP oksidatif C. elegans içindeki proteinleri değiştirir. (A) Oksidatif modifiye proteinlerin Venn diyagramı oksidatif modifiye proteinlerin iki biyolojik çoğaltma (BR) arasında 50 Hz 200 mM hidrojen peroksit varlığında, BR1 mavi ve BR2 sarı. (B) Işınlanmış numunelerde tanımlanan oksidatif modifiye proteinlerin Venn diyagramı, teknik trilikatlar arasında BR2'de hidrojen peroksit kontrolü ve yalnızca solucan kontrolü. (C) Farklı C. elegans vücut sistemleri içinde oksidatif modifiye proteinlerin Pasta grafik. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Çözücü erişilebilirliği için IV-FPOP modifikasyonları korelasyon. (A)Myosin şaperon proteini UNC-45 (gri) (PDB ID 4I2Z13) LC/MS/MS analizi, 669−680 ve 698−706 (yeşil, sol inset) tarafından tanımlanan iki modifiye peptidi vurgular. UNC-45 Hsp90 peptit parçası (mavi) bağlıdır. Bu parçanın içindeki oksidatif modifiye kalıntılar çubuklarla (kırmızı) ve UNC-45 bir yüzey (sağ inset) olarak işlenir. (B) UNC-45 peptid 669−680 (üst) ve 698−706 (alt) co2kaybı için b ve y-iyonları gösteren Tandem MS spektrumları , bir FPOP modifikasyonu. (C) Hsp90 oksidatif modifiye kalıntılar, R697, M698, E699 ve E700 için hesaplanan ln(PF). Hsp90 için hesaplanan SASA değerleri her kalıntının üzerinde gösterilir. (D) R697, M698, E699 ve E700 için +16 FPOP modifikasyonu gösteren Tandem MS spektrumları. Bu rakam Espino ve ark.4'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
In vivo protein-protein etkileşimlerinin (ÜFE) araştırılmasında geçerli kriter floresan rezonans enerji transferidir (FRET). Bu teknik, en basit haliyle, iki molekül arasındaki enerji transferi ile ÜFE'yi, birbirine yakın olduklarındainceler 15. MS tekniklerinin aksine, FRET amino-asit düzeyinde konformasyonel değişiklikleri ve etkileşim bölgelerini karakterize etme çözünürlüğüne sahip değildir. MS tabanlı teknikler ppi16çalışması için giderek kullanılmaktadır. IV-FPOP, C. elegans in vivo protein yapısal analizisağlayan bir HRPF yöntemidir. C. eleganları IV-FPOP ile başarılı bir şekilde etiketlemek için numune kaybını azaltmak için mikroakışkan akış sisteminin düzgün bir şekilde monte edilmesi önemlidir. 250 μm i.d. kılcal damar, daha küçük i.d. kılcal damarlara kıyasla numune geri kazanımını en üst düzeye çıkarmıştır4. Daha büyük i.d. kılcal damarlar test edilmemiştir, ancak mikroakışkan akış sistemi C. eleganssıralama için ticari olarak kullanılabilir akış sitometri sistemi olarak aynı i.d. ile bir kılcal kullanılarak tasarlanmıştır. 17 Solucan numunesi boyutu da önemlidir, FPOP'dan önce numune başına ~10.000'den az bir numune boyutu LC-MS/MS analizi için yeterince yüksek protein konsantrasyonları sağlamaz. Daha yüksek numune boyutları (>10.000 solucanlar) da ilk başlangıç hacmi (adım 4.5) ayarlayarak kullanılabilir.
Mikroakışkan akış sisteminin doğru montajı önemlidir. Örnek yoldaki sızıntılar solucanların tutarsız akışına veya H2O2'yeneden olur. Ferrules, kollu ve 3-2 vanalar, her deneyden sonra düzgün bir şekilde temizlenirse birden fazla IV-FPOP deneyinden yeniden kullanılabilir. Ancak, her biyolojik çoğaltma için yeni bir mikroakışkan akış sistemi monte öneririz. Mikroakışkanlar düzgün bir şekilde monte edilirse, solucanlar ve H2O2 karıştırma-T'de en az geri basınçla karışır. Mikroakışkan akış sisteminin kalite kontrolü (QC) olarak, renkli boyalar kullanarak karıştırma verimliliğini test etmenizi öneririz. IV-FPOP sırasında solucan şırıngasının içindeki manyetik karıştırıcıların hareketini izlemek önemlidir, solucan şırıngasında yanlış numune karıştırılması veya karıştırma-T'nin geri basınç la ilgili sızıntılara neden olması önemlidir. Buna ek olarak, kötü karıştırma koşulları büyük numune kayıplarına, lazer penceresinde solucanların kötü lazer maruziyetine ve tıkanmaya yol açar.
C. elegans bakımı arka plan oksidasyonunu azaltmak için önemlidir. Yüksek sıcaklıklar toplam arka plan oksidasyonunu etkileyebileceğinden, solucanların düşük stresli sıcaklıklarda düşük sıcaklıklarda büyümesini öneririz. Sadece bir kontrol solucanı örneği seti, h2O2 ve lazer ışınlaması yok, tüm IV-FPOP deneyleri için laboratuvar bakımı nedeniyle arka plan oksidasyonu için hesap önerilir. Bu tekniğin mevcut sınırlamalarından biri, daha yüksek protein yapısal bilgi elde etmek için tanımlanan oksidatif modifiye peptidlerin toplam sayısı ve peptid başına oksitlenmiş toplam kalıntı sayısıdır. Tavsiye edilmese de, oksidatif modifikasyonlarda bir artış hidrojen peroksit yüksek konsantrasyonlarda kullanılarak elde edilebilir. Hidrojen peroksit bir artış önemli biyolojik yolları önemli ölçüde değiştirmek yanı sıra oksidasyona bağlı unfolding yol açabilir. IV-FPOP için hidrojen peroksit konsantrasyonu artarsa, 200 mM'nin üzerinde konsantrasyonlar test edilmedikçe solucancanlılığı ve arka plan oksidasyonunun test edilmesi önerilir.
Açıklanan LC-MS/MS protokolü diğer laboratuvarların MS QC'sini karşılayacak şekilde optimize edilebilir ve değiştirilebilir. 2D-kromatografi tekniklerinin kullanımı daha önce oksidatif modifiye peptidler ve proteinlerin belirlenmesini artırmak için gösterilmiştir18. Bununla birlikte, belirli bir proteini hedefleyen protein zenginleştirme teknikleri antikor yağışları veya aşağı çekme tahlilleri dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere tavsiye edilmez. Proteinin epitop/bağlayıcı bölgesi IV-FPOP tarafından oksidatif olarak değiştirilmişse, bu teknikler bir protein konkordatocuya karşı önyargılı olabilir. Sülfat radikal anion10 veya trifluoromethylation19 gibi radikal reaktiflerin ayak izindeki yeni gelişmeler IV-FPOP'un çok yönlülüğünü artırabilir. Şimdiye kadar in vivo test edilen tek etiketleme reaktifi hidrojen peroksit olmasına rağmen, diğer lazer ile aktive radikaller optimize edilebilir. Diğer radikallerin kullanımı solucan canlılığı ile uyumlu olduğu kanıtlanmalıdır, hücre geçirgen, ve 248 nm lazer dalga boyu. Birçok insan hastalıkları için bir model sistem olarak C. elegans kullanımı sayesinde, IV-FPOP hastalık patogenezinde protein yapısının rolünü n çalışmada güçlü bir etkiye sahip potansiyeline sahiptir.
Disclosures
Bu yayın JAE Doktora tezinin kısmen yerine getirilmesi ile yazılmıştır. Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma Maryland Üniversitesi, Baltimore ve LMJ'ye verilen NIH 1R01 GM 127595 başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, dr. Daniel Deredge'e el yazmasının düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S.
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
