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Summary

L’ossidazione fotochimica veloce in vivo delle proteine (IV-FPOP) è una tecnica di impronta proteica radicale idrossile che consente di mappare la struttura delle proteine nel loro ambiente nativo. Questo protocollo descrive l’assemblaggio e l’impostazione del sistema di flusso microfluidico IV-FPOP.

Abstract

La rapida ossidazione delle proteine (FPOP) è un metodo HRPF (Idrossil radical protein footprinting) utilizzato per studiare la struttura delle proteine, le interazioni proteina-ligando e le interazioni proteina-proteina. FPOP utilizza un laser ad eccimeri KrF a 248 nm per la fotolisi di perossido di idrogeno per generare radicali idrossili che a loro volta ossidativamente modificano catene di amminoacidi solventi accessibili. Recentemente, abbiamo ampliato l’uso di FPOP di etichettatura ossidativa in vivo in Caenorhabditis elegans (C. elegans), dal titolo IV-FPOP. I nematodi trasparenti sono stati utilizzati come sistemi modello per molte malattie umane. Studi strutturali in C. elegans di IV-FPOP sono fattibili a causa della capacità dell’animale di assorbire il perossido di idrogeno, della loro trasparenza nell’irradiazione laser a 248 nm e della natura irreversibile della modifica. L’assemblaggio di un sistema di flusso microfluidico per l’etichettatura IV-FPOP, i parametri IV-FPOP, l’estrazione di proteine e i parametri ottimizzati LC-MS/MS sono descritti nel presente documento.

Introduction

L’impronta proteica abbinata alla spettrometria di massa (MS) è stata utilizzata negli ultimi anni per studiare le interazioni proteiche e i cambiamenti conformazionali. I metodi HRPF (Hydroxyl radical protein footprinting) sondano l’accessibilità dei solventi proteici modificando le catene laterali degli amminoacidi proteici. Il metodo HRPF, l’ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP)¹, è stato utilizzato per sondare la struttura delle proteine in vitro², in cell (IC-FPOP)³e più recentemente in vivo (IV-FPOP)⁴. FPOP utilizza un laser ad eccimeri a 248 nm per generare rapidamente radicali idrossili da fotolisi di perossido di idrogeno per formare radicali idrossili¹. A loro volta, questi radicali possono etichettare 19 su 20 aminoacidi su una scala temporale di microsecondi, più velocemente di quanto le proteine possano dispiegarsi. Anche se, la reattività di ogni aminoacido con radicali idrossili si estende 1000 volte, è possibile normalizzare l’ossidazione della catena laterale calcolando un fattore di protezione (PF)⁵.

Poiché l’FPOP può modificare ossidativamente le proteine indipendentemente dalle loro dimensioni o sequenza primaria, si rivela vantaggioso per gli studi di proteine in cella e in vivo. IV-FPOP sonde struttura proteica in C. elegans in modo simile agli studi in vitro e in-cell⁴. C. elegans fanno parte della famiglia dei nematodi e sono ampiamente utilizzati come modello per studiare le malattie umane. La capacità del verme di assorbire il perossido di idrogeno mediante diffusione passiva e attiva consente lo studio della struttura proteica in diversi sistemi del corpo. Inoltre, i C. elegan sono adatti per IV-FPOP a causa della loro trasparenza alla lunghezza d’onda laser di 248 nm necessaria per FPOP⁶. L’accoppiamento di questo metodo alla spettrometria di massa consente l’identificazione di più proteine modificate utilizzando approcci tradizionali proteomici dal basso verso l’alto.

In questo protocollo, descriviamo come eseguire IV-FPOP per l’analisi della struttura proteica in C. elegans. Il protocollo sperimentale richiede l’assemblaggio e l’impostazione di un sistema di flusso microfluidico per IV-FPOP adattato da Konermann et al⁷. Dopo la IV-FPOP, i campioni vengono omogeneizzati per l’estrazione delle proteine. I campioni di proteine sono proteolizzati e i peptidi vengono analizzati dalla SM tandem del cromatografo liquido (LC), seguito dalla quantificazione.

Protocol

1. C. elegans manutenzione e cultura Coltivare e sincronizzare le colonie di vermi alla loro quarta fase di larve (L4) seguendo le procedure di laboratorio standard8. Il giorno dell’esperimento IV-FPOP, lavare i vermi L4 dai prati batterici (OP50 E. coli) con buffer M9 (0,02 M KH2PO4, 0.08 M Na2HPO4, 0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4). Ottenere 500 aliquote di 10.000 vermi per ogni campione IV-FPOP. 2. Assemblaggio del sistema a flusso microfluidico Avviare l’assieme del sistema di flusso tagliando un pezzo di pelene di etilene fluorurato (FEP) (1/16 in. diametro esterno (o.d.) x 0.020 in diametro interno (i.d.)). Utilizzando un ago di dissezione pulito, allargare l’i.d. del tubo FEP al fine di fare un piccolo cratere ad una sola estremità, 50 mm di lunghezza. Il cratere dovrebbe essere abbastanza grande da contenere due pezzi di silice fusa da 360 m.NOTA: Non allargare l’estremità opposta in quanto questa estremità verrà utilizzata solo per adattarsi alla presa capillare. Con una taglierina in ceramica, tagliare due pezzi da 15 cm di 250 m di silice fusa. Questi due pezzi diventeranno le linee infuse del sistema di flusso. Utilizzando un nastro autoadesivo, nastro i due capillari i 250 m insieme assicurando che siano paralleli l’uno all’altro e le loro estremità sono lavate al 100%.NOTA: Per garantire che le estremità della silice fusa non vengano schiacciate dopo il taglio e siano dritte e lavate al 100% l’una contro l’altra, si consiglia di esaminarle utilizzando una lente di ingrandimento o sotto un microscopio stereo. Inserisci i due capillari attaccati nel cratere fatto a mano del tubo FEP. Spingere i capillari fino al bordo del cratere fatto a mano.AVVISO: Per mantenere l’efficacia del sistema di flusso, non spingere oltre il cratere fatto a mano (Figura 1a). Mettere un piccolo punto di resina epossidica su una superficie pulita e mescolare con un ago di dissezione. Rapidamente, utilizzando lo stesso ago, posizionare una piccola goccia di resina alla fine dei capillari infusi dove si collegano con il tubo FEP e consentire alla resina di asciugarsi, appendere outlet-side- up, per alcuni minuti (Figura 1a). Mentre la resina si asciuga, legando insieme il tubo FEP e due capillari, tagliare un nuovo capillare di 250 m i.d. Il nuovo capillare diventerà il capillare del sistema di flusso. La lunghezza desiderata del capillare può essere calcolata utilizzando l’equazione seguente:Dove l è la lunghezza del capillare da tagliare in centimetri, t è il tempo di reazione desiderato in minuti, f è la portata in mL/min, e cioè è il diametro interno del capillare in centimetri.NOTA: Dopo aver tagliato la presa capillare, esaminare le estremità assicurandosi che siano dritte e non schiacciate. Una volta che la resina si è asciugata, inserire il nuovo capillare attraverso l’estremità del tubo FEP. Le estremità interne della presa capillare e i due capillari infinfusi dovrebbero essere a filo l’uno contro l’altro all’interno del tubo FEP, questo crea il mixaggio-T (Figura 1b). Legare il tubo capillare e FEP con resina epossidica fresca come descritto nei passaggi 2.6 e 2.7. Lasciare asciugare la resina durante la notte legando il sistema di flusso. Impostare il sistema di flusso microfluidico il giorno successivo (Figura 1c). 3. Sistema di flusso microfluidico per FPOP in vivo Inserire quattro agitatori magnetici all’interno di una siringa da 5 mL. Questa siringa diventa la siringa campione. Gli agitatori magnetici impediscono ai vermi di stabilirsi all’interno della siringa durante la IV-FPOP (Figura 2A). Riempire le due siringhe da 5 mL con M9. Assicurarsi che non ci siano bolle d’aria all’interno di ogni siringa in quanto possono influenzare la portata e l’efficienza di miscelazione. Collegare un adattatore Luer a ogni siringa da 5 mL assicurandosi che siano stretti le dita e fissati in posizione. Attaccare ogni siringa a una singola valvola 3-2. La siringa deve essere collegata alla porta centrale della valvola (Figura 2B). Fissare ogni siringa da 5 mL alla pompa a doppia siringa e regolare il collare di arresto meccanico per evitare sovrapressione alla siringa dal blocco pusher. Tenere presente l’aggiunta degli agitatori magnetici quando si imposta il collare di arresto. Fissare ogni estremità capillare infuso del sistema di flusso microfluidico fatto in casa alla porta superiore di ogni valvola 3-2 utilizzando un dado super flangeless, manica FEP, e super flangeless ferrule (Figura 2B). Alla porta aperta rimanente della valvola 3-2 (porta inferiore), attaccare un 10 cm 450 m i.d. capillare utilizzando un dado superfls, manica FEP, e super flands ferrule (Figura 2B). Questi capillari diventano i capillari campione di ritiro. Avviare il flusso della pompa e controllare tutte le connessioni del sistema di flusso microfluidico per perdite visive. Scorrere almeno tre volumi di siringhe utilizzando la portata sperimentale. La portata finale dipende dalla finestra di irradiazione laser, dalla frequenza laser e da un volume di frazione di esclusione zero.NOTA: Per questo protocollo, è stata calcolata una portata finale di 375,52 gradi centigradi da una finestra di irradiazione laser di 2,55 mm, 250 m in silice fusa, soglia di esclusione zero e frequenza di 50 Hz. Il percorso di flusso è contrassegnato dalle frecce sulla maniglia della valvola 3-2. Ogni siringa può essere ricaricata manualmente spostando la maniglia della valvola dalla posizione di espulsioni alla posizione di ritiro.NOTA: Le perdite alla valvola 3-2 possono essere fissate riparando nuovamente il dado super flangeless o sostituendo qualsiasi delle connessioni valvolari (dado super flangeless, manica FEP o super flangeless ferrule). Le perdite al mixing-T richiedono un riassemblaggio del sistema di flusso microfluidico (passaggi da 2.1 a 2.11). Spostare il sistema di flusso microfluidico sul banco sperimentale e fissare la presa capillare allo stadio di radiazione utilizzando un’unione in acciaio inossidabile a 360 gradi (Figura 2C,D). Utilizzando un accendino a lunga portata, bruciare il rivestimento della silice fusa nella finestra di irradiazione laser. Pulire il rivestimento bruciato con tessuto privo di laint e metanolo.NOTA: Alternare i cicli di combustione e i cicli di pulizia del metanolo per evitare di surriscaldare il capillare in quanto il calore in eccesso può sciogliersi e/o rompere il capillare. Posizionare il blocco dell’agitatore magnetico sopra la siringa da 5 mL contenente gli agitatori magnetici. Regolare la velocità e la posizione del blocco magnetico stirrer in modo che gli agitatori magnetici all’interno della siringa da 5 mL ruotino lentamente e costantemente. 4. FPOP in vivo Accendere il laser a eccimeri KrF e lasciare che il tirotrone si riscaldi.AVVISO: Il laser emette radiazioni visibili e invisibili a 248 nm di lunghezza d’onda che possono danneggiare gli occhi. Prima di accendere il laser e aprire la finestra di uscita del fascio, è necessario indossare una protezione corretta degli occhi. Misurare l’energia laser a una frequenza di 50 Hz per almeno 100 impulsi posizionando il sensore ottico nella finestra di uscita del fascio.NOTA: Per questo protocollo, è stata utilizzata una finestra di irradiazione da 2,55 mm con un’energia laser di 150 x 2,32 mJ. Ottenere approssimativamente 10.000 vermi (500 gradi centigradi) e ritirare manualmente il campione nella siringa del campione. Riempire la siringa campione con 2,5 mL di buffer M9 per un volume campione finale di 3 mL. Assicurarsi che nella siringa del campione non vengano introdotte bolle d’aria. Riempire la seconda siringa con 3 mL di 200 mM H2O2, ancora una volta assicurando non vengono introdotte bolle d’aria nella siringa. Alla fine dell’outlet capillare, posizionare un tubo conico da 15 mL avvolto in un foglio di alluminio contenente 6 mL di 40 mM n’-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-phenylnitrone (PBN), e 1% di solco dimetilico per quen excess H2O2, radicali, e inibire l’attività di ridutto di solforoso di metanina, rispettivamente. Avviare il laser degli eccimeri dalla finestra del software, attendere il primo impulso e avviare il flusso del campione dalla doppia siringa.NOTA: I campioni devono essere eseguiti in duplicati biologici in triplicati tecnici in 3 condizioni di campioni: irradiazione laser con H2O2 (campione), nessuna irradiazione laser con H2O2 e nessuna irradiazione laser senza H2O2 (controlli), per un totale di 9 campioni per set biologico. Raccogliere l’intero campione nel tubo da 15 mL, monitorando attivamente il flusso del campione per eventuali perdite visive, poiché una certa pressione posteriore della siringa del campione può talvolta accumulare. Dopo IV-FPOP, i vermi a pellet per centrifugazione a 805 x g per 2 min. Rimuovere la soluzione quench, aggiungere 250 l di buffer di lisi (8 M urea, 0.5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM phenylmethylfluylride [PMSF]). Trasferire il campione in un tubo di microcentrizzazione pulito, congelare il flash e conservarlo a -80 gradi fino alla digestione del campione. 5. Estrazione, purificazione e proteolisi proteica Scongelare campioni congelati sul ghiaccio e omogeneizzare con la sonicazione per 10 s, seguita da un’incubazione di ghiaccio di 60 s. Possono essere necessari più cicli di sonicazione, l’omogeneità può essere osservata sotto uno stereoscopio posizionando un campione di 2 ltrandissi su un vetrino al microscopio. L’omogeneizzazione dei campioni è completa quando si vedono piccoli o nessun pezzo di vermi. Centrifuga vermi omogeneizzati a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e raccogliere il supernatante in un tubo di microcentrifuga pulito. Determinare le concentrazioni di proteine del campione utilizzando un saggio di acido bicinchoninico (saggio BCA) utilizzando le istruzioni del produttore.NOTA: La concentrazione dei campioni può essere determinata utilizzando qualsiasi prova di apposizione di concentrazione di proteine biochimiche. Tenete a mente la compatibilità reagente con buffer di lisi (8 M urea, 0.5% SDS, 50 m HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Inoltre, potrebbe essere necessaria una diluizione del buffer. Ottenere 100 g di proteine da ogni campione e metterli in tubi di microcentrismo pulito. Aggiungere dithiothreitol (DTT) a una concentrazione finale di 10 mM per ridurre i legami disulfidi in tutti i campioni. Vortice, spin down, e incubare i campioni a 50s C per 45 min. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere l’iodoacetamide (IAA) a una concentrazione finale di 50 mM per alchilare i residui ridotti. Vortice, spin down, e incubare campioni per 20 min a temperatura ambiente protetto dalla luce. Subito dopo l’alchilazione, far precipitare il campione proteico aggiungendo 4 volumi di acetone pre-raffreddato al 100% e incubare a -20 gradi durante la notte. Il giorno successivo, la proteina del pellet precipita per centrifugazione a 16.000 x g per 10 min. Lavare il pellet campione con 90% di acetone, rimuovere il supernatante e lasciare asciugare il pellet per 2-3 min. Sospendere di nuovo il pellet proteico in Tris-HCl da 25 mM. Aggiungere la trypsina a un rapporto tra proteasi e proteine finale di 1:50 (w/w) e digerire i campioni a 37 gradi durante la notte. Il giorno successivo placa la reazione alla digestione della trypsin aggiungendo il 5% di acido formico.NOTA: per l’analisi LC-MS/MS (passaggi 6.1-6.5 sono necessari almeno 0,5 g di peptidi per campione). Determinare le concentrazioni di peptidi del campione utilizzando un saggio quantitativo di peptidi colorimetrici (vedere la tabella dei materiali) come descritto dal protocollo del produttore. 6. Spettrometria di massa l2-MS/MS liquida ad alte prestazioni (LC-MS/MS) Utilizzare le seguenti fasi mobili LC: acqua in 0.1% FA (A) e ACN in 0.1% FA (B). Caricare 0,5 g di peptidi su una colonna di trappole (180 m e 20 mm) contenente C18 (5 m, 100) e lavare il campione con il 99% di solvente A e l’1% B per 15 min a 15 gradi di portata lmin/min. Peptidi separati utilizzando una colonna imballata interna (0,075 mm i.d. – 20 mm) con materiale di fase inversa C18 (5 m, 125). Utilizzare il seguente metodo di separazione analitica: il gradiente è stato pompato a 300 nL/min per 120 min: 0-1 min, 3% B; 2-90 min, 10-45% B; 100/105 min, 100% B; 106-120 min, 3% B. Eseguire l’acquisizione di dati di peptidi nella ionizzazione nano-elettrospray (nESI) in modalità ioletta positiva (nESI) utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.NOTA: per questo protocollo, è stata utilizzata una coppia di strumenti LC (UPLC) ad alta risoluzione su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. È stata utilizzata l’acquisizione dipendente dai dati. L’intervallo di scansione m/z per MS1 era 3750–1500 con risoluzione 60.000 e 60 s esclusione dinamica. Gli ioni con stati di addebito pari a 1 e >6 sono stati esclusi. Un obiettivo di controllo automatico del guadagno (AGC) di 5.5e5 è stato utilizzato con un tempo massimo di iniezione di 50 ms e una soglia di intensità di 5.5e4. Gli ioni selezionati per MS2 sono stati sottoposti a una frammentazione dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) utilizzando un’energia di collisione normalizzata del 32%. Gli ioni di frammento sono stati rilevati nello spettrometro con risoluzione 15.000 e un obiettivo AGC 5.0e4. 7. Analisi dei dati Cerca i file MS in tandem con un software di analisi proteomica dal basso verso l’alto contro il database C. elegans. Impostare i parametri di ricerca dell’analisi delle proteine come segue: uno trypsin ha perso scissione, 375-1500 m/z gamma di massa peptide, tolleranza di massa frammento di 0,02, e la tolleranza di massa precursore di 10 ppm. Carbamidomethylation è impostato come una modifica statica e tutti sanno idrossile modifiche radicali catenalaterale 9,10 come dinamico. L’identificazione del peptide è stabilita con una confidenza del 95% (media) e residua al 99% di confidenza (alta). Il tasso di individuazione falsa (FDR) è impostato su un 1%. Esportare i dati in una banca dati elettronica e riepilogare l’entità dell’ossidazione per peptide o residuo utilizzando l’equazione al di sotto di11:NOTA: quando l’area EIC modificata è l’area cromatica a iografia (EIC) estratta del peptide o dei residui con una modifica ossidativa, e l’area EIC è l’area totale dello stesso peptide o residuo con e senza la modifica ossidativa.

Representative Results

Nel sistema di flusso microfluidico utilizzato per IV-FPOP, H2O2 e i vermi sono tenuti separati fino a poco prima dell’irradiazione laser. Questa separazione elimina la rottura di H2O2 mediante catalasi endogena e altri meccanismi cellulari12. L’uso di un capillare di 250 m mostra un recupero totale del campione tra il 63-89% di due repliche biologiche, mentre il capillare 150 m i.d. mostra solo il recupero del 21-31%(Figura 3A). L’uso di un i.d. capillare più grande (250 m) porta a un migliore flusso di verme durante IV-FPOP e flusso di verme singolo (Figura 3B) rispetto a un i.d. capillare più piccolo (150 m) (Figura 3C). Il capillare 150 m non consente un singolo flusso di vermi (Figura 3C) e più vermi che scorrono insieme alla finestra di irradiazione laser che diminuisce la quantità di esposizione laser per singolo verme. IV-FPOP è una tecnica di etichettatura covalente che sonda l’accessibilità del solvente in C. elegans. La figura 4A mostra un cromatogramma iogramma (EIC) estraito (EIC) rappresentativo di un peptide modificato e non modificato dall’FPOP. L’etichetta radicale idrossile cambia la chimica dei peptidi ossidativi modificati, rendendo così i peptidi modificati FPOP più polari. Nella cromatografia in fase inversa, i peptidi modificati IV-FPOP hanno tempi di ritenzione precedenti rispetto ai peptidi non modificati. La frammentazione MS/MS di peptidi isolati consente l’identificazione di residui ossidativi modificati (Figura 4B). IV-FPOP ha dimostrato di modificare un totale di 545 proteine attraverso due repliche biologiche all’interno di C. elegans (Figura 5A,B). Un vantaggio di IV-FPOP come metodo di impronta delle proteine si basa sulla capacità della tecnica di modificare le proteine in una varietà di sistemi del corpo all’interno dei vermi (Figura 5C). Questo metodo permetterebbe di sondare la struttura delle proteine e le interazioni proteiche indipendentemente dal tessuto corporeo o dall’organo all’interno del verme. Inoltre, l’analisi MS in tandem conferma l’accessibilità del solvente in vivo delle sonde IV-FPOP. È stato analizzato il modello di ossidazione della proteina da shock termico 90 (Hsp90) in complesso con la proteina della miosina UNC-45 (Figura 6). L’analisi MS/MS per Hsp90 mostra che quattro residui modificati ossidativamente (Figura 6C,D), l’estensione normalizzata della modifica FPOP (ln(PF))5 indicano che il residuo M698 di Hsp90 è meno accessibile rispetto ai residui R697, E699 ed E700 quando è associato a UNC-45 (6 FigureC). Queste differenze nell’ossidazione sono convalidate da calcoli di superficie accessibile (SASA) in materia di letteratura (PDB 4I2-13). Residui M698 ha un valore SASA di 0,03 che è considerato un residuo sepolto rispetto ai residui R697, E699 ed E700 con valori SASA più elevati (Figura 6C). 14 Del sistema come illustrato nella Figura 1. Schema del sistema di flusso microfluidico FPOP in vivo schematico. (A) Le due linee di infezione (arancione) del sistema di flusso IV-FPOP sono indicate all’interno del tubo FEP (giallo), la corretta posizione di rilegatura della resina epossidica è rappresentata dal cerchio azzurro. (B) Miscelazione completa assemblata-T formata dai tre capillari da 250 m. La posizione di rilegatura resina corretta della presa capillare al tubo FEP è rappresentata dal cerchio azzurro. (C) Il sistema completo di flusso assemblato per l’etichettatura covalente in vivo di C. elegans. Prima dell’FPOP, i vermi vengono tenuti separati da H2O2 fino a poco prima dell’etichettatura; la finestra di irradiazione laser è mostrata in azzurro e il raggio laser è rappresentato dal fulmine viola. Le cifre non sono in scala. Questa cifra è stata modificata da Espino etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 2. Sistema microfluidico durante IV-FPOP. (A) Immagine rappresentativa di C. elegans all’interno della siringa da 5 mL. Senza mescolare, i vermi si depositano sul fondo della siringa (a sinistra). Gli agitatori magnetici e il blocco dell’agitatore mantengono i vermi in sospensione durante gli esperimenti IV-FPOP (a destra). (B) Immagine rappresentativa di una siringa da 5 mL, che si infonde capillare e ritira capillare collegata alla valvola 3-2. La maniglia della valvola 3-2 viene visualizzata nella posizione di ritiro. (C) Sistema di flusso microfluidico durante IV-FPOP, il blocco magnetico dell’agitatore è posizionato sopra la siringa da 5 mL dei vermi. (D) Uscita capillare fissata allo stadio di radiazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella figura 3. Confronto tra flusso e recupero di C. elegans utilizzando due capillari. (A) Per cento recupero dei vermi dopo IV-FPOP per due repliche biologiche (BR) con 250 (grigio) e 150 (nero) -m i.d. capillari. Le barre di errore vengono calcolate a partire dalla deviazione standard tra i triplicati tecnici. C. elgans che scorre attraverso la finestra di irradiazione laser attraverso un 250 m (B) e 150 m (C) capillari. I vermi sono più strettamente compattati nel capillare più piccolo. I 150 m capillari mostrano l’agglomerazione dei vermi. Questa cifra è stata modificata da Espino etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 4. Rappresentante LC-MS/MS dopo IV-FPOP. (A) EIC di un peptide modificato FPOP (rosso) e non modificato (blu). Il peptide selezionato appartiene alla proteina actin-1. (B) SS/MS spettro di actino-1 non modificato doppiamente caricato 317-327. (C) Lo spettro MS/MS di FPOP doppiamente caricato ha modificato il peptide actina-1 317-327, in questo esempio P323 è stato modificato ossidativamente (y5x ion, rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 5. IV-FPOP ossidativamente modifica le proteine all’interno di C. elegans. (A) Diagramma di Venn di proteine ossidativemente modificate in presenza di perossido di idrogeno di 200 mM a 50 Hz in due repliche biologiche (BR), BR1 è in blu e BR2 è in giallo. (B) Diagramma venn delle proteine ossidativemente modificate identificate nei campioni irradiati, nel controllo del perossido di idrogeno e nel controllo dei vermi in BR2 attraverso triplicati tecnici. (C) Grafico a torta delle proteine ossidativemente modificate all’interno di diversi sistemi del corpo C. elegans. Questa cifra è stata modificata da Espino etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 6. Correlazione delle modifiche IV-FPOP all’accessibilità del solvente. (A) Proteina carperone myosina UNC-45 (grigio) (PDB ID 4I2-13) evidenziando due peptidi modificati identificati dall’analisi LC/MS/MS, 669-680 e 698-706 (verde, continso sinistro). L’UNC-45 è legato al frammento di peptide Hsp90 (blu). I residui modificati ossidativamente all’interno di questo frammento sono mostrati in bastoni (rosso) e UNC-45 viene visualizzato come una superficie (interno destro). (B) Tandem MS spettrali di unC-45 peptide 669-680 (superiore) e 698-706 (in basso) che mostrano i b- e y-ioni per la perdita di CO2, una modifica FPOP. (C) Il ln(PF) calcolato per i residui modificati ossidativi Hsp90, R697, M698, E699 ed E700. I valori SASA calcolati per Hsp90 sono indicati sopra ogni residuo. (D) Spettri Tandem MS per R697, M698, E699 ed E700 che mostrano una modifica FPOP da 16 dollari. Questa cifra è stata modificata da Espino etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L’attuale parametro di riferimento per lo studio delle interazioni proteina-proteina in vivo (PPI) è il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET). Nella sua forma più semplice, questa tecnica studia PPI per trasferimento di energia tra due molecole quando sono in prossimità l’una dell’altra¹⁵. A differenza delle tecniche MS, FRET non ha la risoluzione di caratterizzare i cambiamenti conformazionali e i siti di interazione a livello di ammino-acido. Tecniche basate sulla SM sono state sempre più utilizzate per lo studio del PPI¹⁶. IV-FPOP è un metodo HRPF che consente l’analisi strutturale della proteina in vivo in C. elegans. Al fine di etichettare con successo C. elegans da IV-FPOP, è importante assemblare correttamente il sistema di flusso microfluidico per ridurre la perdita di campioni. Il capillare di 250 m ha dimostrato di massimizzare il recupero del campione rispetto ai più piccoli capillari^{4 .} I capillari più grandi non sono stati testati, tuttavia il sistema di flusso microfluidico è progettato utilizzando un capillare con lo stesso i.d. di un sistema di citometria di flusso disponibile in commercio per lo smistamento di C. elegans. ¹⁷ Anche la dimensione del campione di vermi è importante, una dimensione del campione inferiore a 10.000 dollari per campione prima dell’FPOP non produce concentrazioni di proteine sufficientemente elevate per l’analisi LC-MS/MS. Dimensioni dei campioni più elevate (>10.000 worm) possono essere utilizzati anche regolando il volume iniziale (passaggio 4.5).

Il corretto assemblaggio del sistema di flusso microfluidico è importante. Le perdite nel percorso del campione provocano un flusso incoerente dei vermi o H₂O₂. Le ferrules, le maniche e le valvole 3-2 possono essere riutilizzate da più esperimenti IV-FPOP se puliti correttamente dopo ogni esperimento. Tuttavia, si consiglia di assemblare un nuovo sistema di flusso microfluidico per ogni replica biologica. Se la microfluidica è assemblata correttamente, i vermi e H₂O₂ si mescolano al mix-T con una pressione resitro minima. Come controllo qualità (QC) del sistema di flusso microfluidico, si consiglia di testare l’efficienza di miscelazione utilizzando coloranti colorati. È importante monitorare il movimento degli agitatori magnetici all’interno della siringa di verme durante LA IV-FPOP, la miscelazione impropria del campione alla siringa del verme o il mixaggio-T può causare perdite di pressione posteriore. Inoltre, le cattive condizioni di miscelazione portano a grandi perdite di campioni, scarsa esposizione laser dei vermi alla finestra laser e intasamento.

C. elegans manutenzione è importante al fine di diminuire l’ossidazione di fondo. Si consiglia di far crescere i vermi a basse temperature in condizioni di basso stress poiché le alte temperature possono influenzare l’ossidazione totale dello sfondo. Un campione di controllo set di vermi solo, senza H₂O₂ e nessuna irradiazione laser, è raccomandato per tutti gli esperimenti IV-FPOP per tenere conto dell’ossidazione di fondo a causa della manutenzione di laboratorio. Uno degli attuali limiti di questa tecnica è il numero totale di peptidi modificati ossidativamente identificati e il numero totale di residui ossidati per peptide al fine di ottenere informazioni strutturali proteiche più elevate. Anche se non raccomandato, un aumento delle modifiche ossidative potrebbe essere ottenuto utilizzando concentrazioni più elevate di perossido di idrogeno. Un aumento del perossido di idrogeno potrebbe alterare in modo significativo importanti percorsi biologici e portare allo sviluppo di ossidazioni. Se la concentrazione di perossido di idrogeno per IV-FPOP è aumentata, si raccomanda di testare la vitalità del verme e l’ossidazione di fondo poiché non sono state testate concentrazioni superiori a 200 mM.

Il protocollo LC-MS/MS descritto può essere ottimizzato e modificato per soddisfare il QC MS di altri laboratori. L’uso di tecniche di cromatografia 2D è stato precedentemente indicato per aumentare l’identificazione di peptidi e proteine ossidativamente modificati¹⁸. Tuttavia, non sono consigliate tecniche di arricchimento delle proteine che prendono di mira una specifica proteina di interesse, incluse, ma non solo, la precipitazione degli anticorpi o i saggi estraiti. Queste tecniche possono sentrare verso un conformatore proteico se il sito dell’epitopo/rilegatura della proteina è stato ossidativamente modificato da IV-FPOP. I nuovi sviluppi nell’impronta dei reagenti radicali, come l’anione radicale di solfato¹⁰ o la trifluoromeazione¹⁹ potrebbero aumentare la versatilità di IV-FPOP. Anche se l’unico reagente di etichettatura testato finora in vivo è il perossido di idrogeno, altri radicali attivati al laser potrebbero essere ottimizzati. L’uso di altri radicali dovrebbe rivelarsi compatibile con la vitalità del verme, la permeabile delle cellule e la lunghezza d’onda laser di 248 nm. A causa dell’uso di C. elegans come sistema modello per molte malattie umane, la FPOP ha il potenziale per avere un forte impatto nello studio del ruolo della struttura proteica nella patogenesi della malattia.

Materials

15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-53A	any brand is sufficient
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock	SGE Analytical Science	008760	2 minimum
60 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FM3279	This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient
Acetone, HPLC Grade	Fisher Scientific	A929-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg	Waters	186007496
ACQUITY UPLC M-Class System	Waters
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100	any brand is sufficient
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material	Phenomenex
Centrifuge	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
Dissecting Needle	Fisher Scientific	50-822-525	only a couple are needed
Dithiothreiotol (DTT)	AmericanBio	AB00490-00005
DMSO, Anhydrous	Invitrogen	D12345
Epoxy instant mix 5 minute	Loctite	1365868
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	S311-100
EX350 excimer laser (248 nm wavelength)	GAM Laser
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID	IDEX Health & Sciene	1548L
Formic Acid, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A117-50
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
HV3-2 VALVE	Hamilton	86728	2 minimum
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144S-500
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H325-100	any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Iodoacetamide (IAA)	ACROS Organics	122270050
Legato 101 syringe pump	KD Scientific	788101
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene	IDEX Health & Sciene	P-618L	2 minimum
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	M65-500
Methanol, LC/MS Grade	Fisher Scientific	A454SK-4	4 L quantity is not necessary
Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002436
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU)	ACROS Organics	116891000
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"'	IDEX Health & Sciene	F-242X
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6"	IDEX Health & Sciene	F-246
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN)	ACROS Organics	177350250
OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	7110-OP	any protease inhibitor is sufficient
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific		other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
PE50-C pyroelectric energy meter	Ophir Optronics	7Z02936
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Scientific	23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	A53225
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Scientific	90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32”	Molex	1068680064	any capillary tubing cutter is sufficient
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350	Polymicro Technologies	1068150026
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670	Polymicro Technologies	1068150625
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375	Polymicro Technologies	1068150019
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P382-500
Proteome Discover (bottom-up proteomics software)	Thermo Scientific	OPTON-30799
Rotary Magnetic Tumble Stirrer	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps	V&P Scientific, Inc.	VP 710D3-4
Scissors	Fisher Scientific	50-111-1315	any scissors are sufficient
Self-Adhesive Label Tape	Fisher Scientific	15937	one roll is sufficient
Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes	Fisher Scientific	05-402	any brand is sufficient
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	15-525-017
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate	Fisher Scientific	S373-500
Stereo Zoom Microscope	Fisher Scientific	03-000-014	a magnifying glass is sufficient
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD	IDEX Health & Sciene	P-259X
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD	IDEX Health & Sciene	P-255X
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick	V&P Scientific, Inc.	VP 722F
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8"	Thorlabs Inc.	UBP2
Urea	Fisher Scientific	U5378
VHP MicroTight Union for 360µm OD	IDEX Health & Sciene	UH-436	2 minimum
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade	Fisher Scientific	LS118-500
Water, LC/MS Grade	Fisher Scientific	W6-4