Summary
In vivo a oxidação fotoquímica rápida de proteínas (IV-FPOP) é uma técnica de pegada de proteína radical hidroxil que permite o mapeamento da estrutura proteica em seu ambiente nativo. Este protocolo descreve a montagem e a configuração do sistema de fluxo microfluido IV-FPOP.
Abstract
A oxidação rápida de proteínas (FPOP) é um método de pegada de proteína radical hidroxil (HRPF) usado para estudar estrutura proteica, interações proteína-ligantes e interações proteína-proteína. FPOP utiliza um laser de excimer KrF a 248 nm para fotolise de peróxido de hidrogênio para gerar radicais hidroxilos que, por sua vez, modificam oxidativamente cadeias laterais de aminoácidos acessíveis a solventes. Recentemente, expandimos o uso de FPOP de rotulagem oxidativa in vivo em Caenorhabditis elegans (C. elegans),intitulado IV-FPOP. Os nematóides transparentes têm sido usados como sistemas modelo para muitas doenças humanas. Estudos estruturais em C. elegans por IV-FPOP são viáveis devido à capacidade do animal de captar peróxido de hidrogênio, sua transparência à irradiação a laser a 248 nm e a natureza irreversível da modificação. A montagem de um sistema de fluxo microfluido para rotulagem IV-FPOP, parâmetros IV-FPOP, extração de proteínas e parâmetros otimizados lc-MS/MS são descritos aqui.
Introduction
A pegada proteica acoplada à espectrometria de massa (MS) tem sido usada nos últimos anos para estudar interações proteicas e mudanças conformacionais. Os métodos de pegada de proteína radical hidroxilo (HRPF) sondam a acessibilidade de solventes de proteínas modificando cadeias laterais de aminoácidos protéicos. O método HRPF, oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP)1, tem sido usado para sondar a estrutura proteica in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3, e mais recentemente in vivo (IV-FPOP)4. FPOP utiliza um laser excimer de comprimento de onda de 248 nm para gerar rapidamente radicais hidroxilos por fotolisa de peróxido de hidrogênio para formar radicais hidroxilos1. Por sua vez, esses radicais podem rotular 19 de 20 aminoácidos em uma escala de tempo de microssegundo, mais rápido do que as proteínas podem se desdobrar. Embora, a reatividade de cada aminoácido com radicais hidroxila estenda 1000 vezes, é possível normalizar a oxidação da cadeia lateral através do cálculo de um fator de proteção (PF)5.
Uma vez que o FPOP pode modificar oxidativamente proteínas independentemente de seu tamanho ou seqüência primária, ele se mostra vantajoso para estudos de proteínas in-cell e in vivo. IV-FPOP sonda estrutura proteica em C. elegans de forma semelhante aos estudos in vitro e in-cell4. C. elegans fazem parte da família nematoide e são amplamente utilizados como modelo para estudar doenças humanas. A capacidade do verme de captar peróxido de hidrogênio por difusão passiva e ativa permite o estudo da estrutura proteica em diferentes sistemas corporais. Além disso, c. elegans são adequados para IV-FPOP devido à sua transparência no comprimento de onda laser de 248 nm necessário para FPOP6. O acoplamento deste método à espectrometria de massa permite a identificação de múltiplas proteínas modificadas usando abordagens tradicionais de proteômica de baixo para cima.
Neste protocolo, descrevemos como realizar iv-FPOP para a análise da estrutura proteica em C. elegans. O protocolo experimental requer a montagem e a configuração do sistema de fluxo microfluido para IV-FPOP adaptado de Konermann et al7. Após IV-FPOP, as amostras são homogeneizadas para extração de proteínas. As amostras de proteínas são proteolisadas e os peptídeos são analisados por cromatógrafo líquido (LC) tandem MS, seguidos de quantificação.
Protocol
1. C. elegans manutenção e cultura
- Cultivar e sincronizar colônias de vermes em seu quarto estágio de larvas (L4) seguindo procedimentos laboratoriais padrão8.
- No dia do experimento IV-FPOP, lave os vermes L4 de gramados bacterianos (OP50 E. coli) com tampão M9 (0,02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Obtenha alíquotas de 500 μL de ~10.000 worms por amostra IV-FPOP.
2. Montagem do sistema de fluxo microfluido
- Inicie o conjunto do sistema de fluxo cortando um pedaço de 2 cm de tubulação de propileno de etileno fluorado (FEP) (1/16 in. diâmetro externo (o.d.) x 0,020 de diâmetro interno (i.d.)).
- Usando uma agulha de dissecação limpa, amplie a id do tubo FEP, a fim de fazer uma pequena cratera em uma extremidade apenas, ~50 mm de comprimento. A cratera deve ser grande o suficiente para caber dois pedaços de 360 μm o.d. de sílica fundida.
NOTA: Não amplie a extremidade oposta, pois esta extremidade só será usada para caber na saída capilar. - Com um cortador de cerâmica, corte duas peças de 15 cm de sílica fundida de 250 μm. Estas duas peças se tornarão as linhas de infusão do sistema de fluxo.
- Usando fita adesiva autoadesiva, grave os dois capilares de 250 μm i.d. juntos, garantindo que eles estejam paralelos um ao outro e suas extremidades estejam 100% lavadas.
NOTA: Para garantir que as extremidades de sílica fundidas não sejam esmagadas após o corte, e sejam retas e 100% lavadas umas contra as outras, recomenda-se examiná-las usando uma lupa ou um microscópio estéreo. - Insira os dois capilares colados na cratera artesanal do tubo FEP. Empurre os capilares até a borda da cratera artesanal.
ATENÇÃO: Para manter a eficácia do sistema de fluxo, não ultrapasse a cratera artesanal(Figura 1a). - Coloque um pequeno pontide de resina epóxi sobre uma superfície limpa e misture com uma agulha dissecante.
- Rapidamente, usando a mesma agulha, coloque uma pequena gota de resina no final dos capilares infundidas onde eles se conectam com o tubo FEP e permitem que a resina seque, pendurando o lado da tomada para cima, por alguns minutos(Figura 1a).
- Enquanto a resina seca, amarrando o tubo FEP e dois capilares juntos, corte um novo capilar de 250 μm i.d. O novo capilar se tornará a saída capilar do sistema de fluxo. O comprimento desejado do capilar pode ser calculado usando a equação abaixo:
Onde l é comprimento do capilar a ser cortado em centímetros, t é o tempo de reação desejado em minutos, f é a taxa de fluxo em mL/min, e i.d. é o diâmetro interno do capilar em centímetros.
NOTA: Depois de cortar a tomada capilar, examine as extremidades garantindo que elas estejam retas e não esmagadas. - Uma vez que a resina tenha secado, insira o novo capilar através da extremidade da saída de tubulação FEP. As extremidades internas da tomada capilar e os dois capilares infundidos devem ser alinhados uns contra os outros dentro da tubulação FEP, isso cria a mistura-T (Figura 1b).
- Ligue a tubulação capilar e fep com resina epóxi fresca, conforme descrito nas etapas 2.6 e 2.7.
- Deixe a resina secar durante a noite, unindo o sistema de fluxo. Configure o sistema de fluxo microfluido no dia seguinte (Figura 1c).
3. Sistema de fluxo microfluido para in vivo FPOP
- Insira quatro agitadores magnéticos dentro de uma seringa de 5 mL. Esta seringa se torna a seringa da amostra. Os agitadores magnéticos impedem que os vermes se instalem dentro da seringa durante iv-fpop (Figura 2A).
- Encha as duas seringas de 5 mL com M9. Certifique-se de que não há bolhas de ar dentro de cada seringa, pois elas podem afetar a taxa de fluxo e a eficiência de mistura.
- Conecte um adaptador Luer a cada seringa de 5 mL, garantindo que estejam apertados e presos no lugar.
- Coloque cada seringa a uma única válvula 3-2. A seringa deve ser fixada na porta média da válvula(Figura 2B).
- Fixar cada seringa de 5 mL à bomba de seringa dupla e ajuste a coleira de parada mecânica para evitar pressão excessiva à seringa do bloco do empurrador. Tenha em mente a adição dos agitadores magnéticos ao definir o colar de parada.
- Conecte cada extremidade capilar infundida do sistema de fluxo microfluido caseiro à porta superior de cada válvula 3-2 usando uma porca super flangeless, manga FEP e ferrule super flangeless(Figura 2B).
- Para a porta aberta restante da válvula 3-2 (porta inferior), conecte um capilar de 10 cm 450 μm usando uma porca super flangeless, manga FEP e ferrule super flangeless(Figura 2B). Esses capilares tornam-se os capilares de retirada da amostra.
- Inicie o fluxo da bomba e verifique todas as conexões do sistema de fluxo microfluido para obter vazamentos visuais. Flua pelo menos três volumes de seringa usando a vazão experimental. A taxa de fluxo final depende da janela de irradiação a laser, frequência de laser e um volume de fração de exclusão zero.
NOTA: Para este protocolo, uma taxa de fluxo final de 375,52 μL/min foi calculada a partir de uma janela de irradiação a laser de 2,55 mm, 250 μm i.d. sílica fundida, fração de exclusão zero e frequência de 50 Hz.- O caminho de fluxo é marcado pelas setas na alça da válvula 3-2. Cada seringa pode ser reabastecida manualmente movendo a alça da válvula da posição de expulsão para a posição de retirada.
NOTA: Os vazamentos na válvula 3-2 podem ser corrigidos reparando a porca super flangeless ou substituindo qualquer uma das conexões da válvula (porca super flangeless, manga FEP ou ferrule super flangeless). Os vazamentos na mistura-T requerem uma remontagem do sistema de fluxo microfluido (etapas 2.1 a 2.11).
- O caminho de fluxo é marcado pelas setas na alça da válvula 3-2. Cada seringa pode ser reabastecida manualmente movendo a alça da válvula da posição de expulsão para a posição de retirada.
- Mova o sistema de fluxo microfluido para o banco experimental e fixe a saída capilar para o estágio de irradiação usando uma união de aço inoxidável de 360 μm(Figura 2C,D).
- Usando um isqueiro de longo alcance, queime o revestimento da sílica fundida na janela de irradiação a laser. Limpe o revestimento queimado usando tecido sem fiapos e metanol.
NOTA: Alternar entre ciclos de queima e ciclos de limpeza de metanol para evitar o superaquecimento do capilar, pois o excesso de calor pode derreter e/ou quebrar o capilar. - Posicione o bloco do agitador magnético acima da seringa de 5 mL contendo os agitadores magnéticos. Ajuste a velocidade e a posição do bloco do agitador magnético de modo que os agitadores magnéticos dentro da seringa de 5 mL estejam girando lentamente e constantemente.
4. In vivo FPOP
- Ligue o laser de excimer KrF e deixe o thyratron aquecer.
ATENÇÃO: O laser emite radiação visível e invisível a 248 nm de comprimento de onda que pode danificar os olhos. A proteção ocular adequada deve ser usada antes de ligar o laser e abrir a janela de saída do feixe. - Meça a energia do laser em uma frequência de 50 Hz por pelo menos 100 pulsos colocando o sensor óptico na janela de saída do feixe.
NOTA: Para este protocolo, foi utilizada uma janela de irradiação de 2,55 mm com uma energia laser de 150 ± 2,32 mJ. - Obtenha aproximadamente 10.000 vermes (500 μL) e retire manualmente a amostra para a seringa da amostra.
- Encha a seringa de amostra com 2,5 mL de tampão M9 para um volume final de amostra de 3 mL. Certifique-se de que não são introduzidas bolhas de ar na seringa da amostra.
- Encha a segunda seringa com 3 mL de 200 mM H2O2, garantindo novamente que não sejam introduzidas bolhas de ar na seringa.
- No final da tomada capilar, colocar um tubo cônico de 15 mL envolto em folha de alumínio contendo 6 mL de 40 mM N'-Dimethylththiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-fenilnitronena (PBN), e 1% de sulfóxido de dimetil para suprimir o excesso de H2O2, radicais hidroxilais, e inibir methiona sulfoxide reductase,
- Inicie o laser excimer da janela do software, espere pelo primeiro pulso e inicie o fluxo de amostra da seringa dupla.
NOTA: As amostras devem ser executadas em duplicatas biológicas em triplicados técnicos em 3 condições de amostras: irradiação a laser com H2O2 (amostra), sem irradiação a laser com H2O2 e sem irradiação laser no H2O2 (controles), totalizando 9 amostras por conjunto biológico. - Coletar toda a amostra no tubo de 15 mL, enquanto monitora ativamente o fluxo de amostra para quaisquer vazamentos visuais, pois alguma pressão traseira da seringa da amostra pode às vezes se acumular.
- Seguindo IV-FPOP, vermes de pelota por centrifugação a 805 x g por 2 min. Remova a solução de saciedade, adicione 250 μL de tampão de lysis (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonyl fluoreto [PMSF]). Transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga limpo, congele o flash e armazene a -80 °C até a digestão da amostra.
5. Extração de proteínas, purificação e proteolíse
- Descongele amostras congeladas no gelo e homogeneize por sononização por 10 s, seguido por uma incubação de gelo de 60 s. Várias rodadas de sonação podem ser necessárias, homogeneizar pode ser observado um microscópio estereomicroscópio colocando uma alíquota de amostra de 2 μL em um slide de microscópio. A homogeneização da amostra é completa quando pequenos ou nenhum pedaço de vermes são vistos.
- Centrifugagem vermes homogeneizados a 400 x g por 5 min a 4 °C e coletar o sobrenadante em um tubo de microcentrífuga limpo.
- Determine as concentrações de proteínada amostra usando um ensaio de ácido bicinchonínico (ensaio BCA) usando as instruções do fabricante.
NOTA: A concentração da amostra pode ser determinada usando qualquer ensaio de concentração de proteína bioquímica de escolha. Tenha em mente a compatibilidade do reagente com tampão de lysis (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Além disso, uma diluição tampão pode ser necessária. - Obtenha 100 μg de proteína de cada amostra e coloque em tubos de microcentrífuga limpos.
- Adicione dithiothreitol (DTT) a uma concentração final de 10 mM para reduzir as ligações de dissulfeto em todas as amostras. Vórtice, desça e incuba amostras a 50 °C por 45 min.
- Amostras frias à temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione iodoacetamida (IAA) a uma concentração final de 50 mM para resíduos reduzidos alquilados. Vórtice, spin down e incubar amostras por 20 min à temperatura ambiente protegida da luz.
- Imediatamente após a alquilação, precipitar a amostra de proteína adicionando 4 volumes de acetona pré-refrigerada 100% e incubar a -20 °C durante a noite.
- No dia seguinte, a proteína de pelota precipitada por centrifugação a 16.000 x g por 10 min. Lave a pelota da amostra com 90% de acetona, remova o sobrenadante e deixe a pelota secar por 2-3 min.
- Suspenda novamente a pelota proteica em 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL). Adicione tripsina em uma protease final para a razão proteína de 1:50 (c/w) e digerir amostras a 37 °C durante a noite.
- No dia seguinte, sacie a reação de digestão da tripsina adicionando 5% de ácido fórmico.
NOTA: É necessário um mínimo de 0,5 μg de peptídeos por amostra para análise de LC-MS/MS (etapas 6.1-6.5). Determine as concentrações de peptídeos da amostra usando um ensaio de peptídeo colorimétrico quantitativo (ver a Tabela de Materiais) conforme descrito pelo protocolo do fabricante.
6. Espectrometria de massa líquida de alto desempenho (LC-MS/MS)
- Utilize as seguintes fases móveis lc: água em 0,1% FA (A) e ACN em 0,1% FA (B).
- Carregue 0,5 μg de peptídeos em uma coluna de armadilha (180 μm × 20 mm) contendo C18 (5 μm, 100 Å) e lave a amostra com 99% solvente A e 1% B para 15 min a 15 μL/min de fluxo.
- Peptídeos separados utilizando uma coluna interna (0,075 mm i.d. × 20 mm) com material de fase reversa C18 (5 μm, 125 Å).
- Utilize o seguinte método de separação analítica: o gradiente foi bombeado a 300 nL/min por 120 min: 0-1 min, 3% B; 2-90 min, 10-45% B; 100-105 min, 100% B; 106-120 min, 3% B.
- Realize a aquisição de dados de peptídeos no modo íon positivo ionização nano-eletrospray (nESI) usando um espectrômetro de massa de alta resolução.
NOTA: Para este protocolo, utilizou-se um conjunto de instrumentos LC (UPLC) de ultra-desempenho para um espectrômetro de massa de alta resolução. Utilizou-se a aquisição dependente de dados. A faixa de varredura m/z para MS1 foi de 3750-1500 com resolução de 60.000 e exclusão dinâmica de 60 s. Foram excluídos íons com estados de carga +1 e >6. Um controle automático de ganho (AGC) alvo de 5.5e5 foi utilizado com um tempo máximo de injeção de 50 ms e um limiar de intensidade de 5.5e4. Os íons selecionados para MS2 foram submetidos à fragmentação de dissociação colisiva de maior energia (DCC) utilizando 32% de energia de colisão normalizada. Foram detectados íons fragmentados no espectrômetro com resolução de 15.000 e alvo 5.0e4 AGC.
7. Análise de dados
- Pesquise arquivos MS tandem com um software de análise proteômica de baixo para cima contra o banco de dados C. elegans.
- Defina os parâmetros de pesquisa de análise de proteínas da seguinte forma: um decote perdido de tripsina, alcance de massa de peptídeo de 375-1500 m/z, tolerância em massa de fragmentos de 0,02 e tolerância de massa precursora de 10 ppm. A carbamidometilação é definida como uma modificação estática e todos sabem as modificações da cadeia lateral radical hidroxila9,10 como dinâmica. A identificação do peptídeo é estabelecida em 95% de confiança (média) e resíduo em 99% de confiança (alta). A taxa de descoberta falsa (FDR) é definida como 1%.
- Exportar dados para um banco de dados eletrônico e resumir a extensão da oxidação por peptídeo ou resíduo usando a equação abaixode 11:
NOTA: Quando a área eic modificada é a área cromatográfica de íons extraídos (EIC) do peptídeo ou resíduo com uma modificação oxidativa, e a área eIC é a área total do mesmo peptídeo ou resíduo com e sem a modificação oxidativa.
Representative Results
No sistema de fluxo microfluido usado para IV-FPOP, H2O2 e os vermes são mantidos separados até pouco antes da irradiação laser. Esta separação elimina a quebra de H2O2 por catalase endógena e outros mecanismos celulares12. O uso de um capilar de 250 μm mostra uma recuperação amostral total entre 63-89% em duas réplicas biológicas, enquanto o capilar de 150 μm mostra apenas recuperação de 21-31%(Figura 3A). O uso de um capilar de i.d.maior (250 μm) leva a um melhor fluxo de vermes durante o IV-FPOP e o fluxo de vermes únicos(Figura 3B)quando comparado a um fio de pilar de i.d. menor (150 μm)(Figura 3C). O capilar de 150 μm i.d. não permite o fluxo de vermes únicos(Figura 3C)e vários vermes são vistos fluindo juntos na janela de irradiação do laser, o que diminui a quantidade de exposição a laser por um único verme.
IV-FPOP é uma técnica de rotulagem covalente que sonda acessibilidade de solventes em C. elegans. A Figura 4A mostra um representante extraído de cromatogramas de íons (EIC) de um peptídeo modificado e não modificado fpop. O rótulo radical hidroxila altera a química dos peptídeos oxidativamente modificados, tornando os peptídeos modificados do FPOP mais polares. Na cromatografia de fase inversa, os peptídeos modificados IV-FPOP têm tempos de retenção mais cedo do que peptídeos não modificados. A fragmentação de peptídeos isolados de MS/MS permite a identificação de resíduos oxidativamente modificados (Figura 4B).
IV-FPOP demonstrou ter modificado oxidativamente um total de 545 proteínas em duas réplicas biológicas dentro de C. elegans (Figura 5A,B). Uma vantagem do IV-FPOP como método de pegada de proteínas depende da capacidade da técnica de modificar proteínas em uma variedade de sistemas corporais dentro dos vermes (Figura 5C). Este método permitiria sondar a estrutura proteica e interações proteicas, independentemente do tecido corporal ou órgão dentro do verme. Além disso, a análise tandem MS confirma a acessibilidade de sondas IV-FPOP in vivo. Analisou-se o padrão de oxidação da proteína de choque térmico 90 (Hsp90) em complexo com a proteína de chaperon de miosina UNC-45 (Figura 6). A análise de MS/MS para Hsp90 mostra que quatro resíduos oxidativamente modificados(Figura 6C,D), a extensão normalizada da modificação do FPOP (ln(PF))5 indica que o resíduo de Hsp90 M698 é menos acessível a solventes do que os resíduos R697, E699 e E700 quando vinculados à UNC-45(Figura 6C). Essas diferenças na oxidação são validadas pelos cálculos da área de superfície acessível para solventes da literatura (SASA) (PDB 4I2Z13). O resíduo M698 tem um valor SASA de 0,03 que é considerado um resíduo enterrado quando comparado aos resíduos R697, E699 e E700 com valores SASA mais elevados(Figura 6C). 14
Figura 1. Esquema do sistema de fluxo microfluido FPOP in vivo. (A) As duas linhas de infusão (laranja) do sistema de fluxo IV-FPOP são mostradas dentro da tubulação FEP (amarela), a posição de ligação correta da resina epóxi é representada pelo círculo azul claro. (B) Mistura-T montada completa formada pelos três capilares de 250 μm i.d. A posição correta de ligação da resina do capilar de saída ao tubo FEP é representada pelo círculo azul claro. (C) O sistema completo de fluxo montado para rotulagem covalente in vivo de C. elegans. Antes do FPOP, os worms são mantidos separados de H2O2 até pouco antes da rotulagem; a janela de irradiação laser é mostrada em azul claro e o raio laser é representado pelo raio roxo. Os números não são para escalar. Esta figura foi modificada a partir de Espino et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Sistema microfluido durante IV-FPOP. (A) Imagem representativa de C. elegans dentro da seringa de 5 mL. Sem mexer, os vermes se acomodam na parte inferior da seringa (esquerda). Os agitadores magnéticos e o bloco do agitador mantêm os vermes em suspensão durante os experimentos IV-FPOP (à direita). (B) Imagem representativa de uma seringa de 5 mL, infundindo capilar e retirando capilares conectados à válvula 3-2. A pega da válvula 3-2 é mostrada na posição de retirada. (C) Sistema de fluxo microfluido durante o IV-FPOP, o bloco do agitador magnético está posicionado acima da seringa de 5 mL dos vermes. (D) Capilar de saída preso ao estágio de irradiação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação do fluxo e recuperação de C. elegans usando dois capilares de id. (A) Recuperação percentual de vermes após IV-FPOP para duas réplicas biológicas (BR) com 250 (cinza) e 150 (preto) μm i.d. capilares. As barras de erro são calculadas a partir do desvio padrão entre triplicados técnicos. C. elgans fluindo através da janela de irradiação a laser através de um capilar de 250 μm(B)e 150 μm(C)i.d. Os vermes são mais bem compactados no capilar menor. A capilar de 150 μm mostra a despedadeza de vermes. Esta figura foi modificada a partir de Espino et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Resultado representativo LC-MS/MS após IV-FPOP. (A) EIC de um peptídeo modificado FPOP (vermelho) e não modificado (azul). O peptídeo selecionado pertence à proteína actina-1. (B) Espectro MS/MS do peptídeo actin-1 não modificado duplamente carregado 317-327. (C) Espectro MS/MS do peptídeo de actina modificado FPOP-1 duplamente carregado 317-327, neste exemplo P323 foi oxidativamente modificado (y5+ íon, vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. IV-FPOP modifica oxidativamente proteínas dentro de C. elegans. (A) Diagrama de venn de proteínas oxidativamente modificadas na presença de peróxido de hidrogênio de 200 mM a 50 Hz em duas réplicas biológicas (BR), BR1 está em azul e BR2 em amarelo. (B) Diagrama de Venn de proteínas oxidativamente modificadas identificadas em amostras irradiadas, controle de peróxido de hidrogênio e controle somente de vermes em BR2 através de triplicações técnicas. (C) Gráfico de pie de proteínas oxidativamente modificadas dentro de diferentes sistemas corporais C. elegans. Esta figura foi modificada a partir de Espino et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Correlacionando modificações IV-FPOP para acessibilidade de solventes. (A) Proteína de chaperon de miosina UNC-45 (cinza) (PDB ID 4I2Z13) destacando dois peptídeos modificados identificados pela análise lc/ms/ms, 669-680 e 698-706 (verde, entrada esquerda). UNC-45 está ligado ao fragmento de peptídeo Hsp90 (azul). Resíduos oxidativamente modificados dentro deste fragmento são mostrados em varas (vermelhas) e UNC-45 é renderizado como uma superfície (entrada direita). (B) Espectro súmico Tandem MS do peptídeo UNC-45 669-680 (superior) e 698-706 (inferior) mostrando b- e íons y para a perda de CO2, uma modificação FPOP. (C) O ln(PF) calculado para os resíduos modificados oxidativamente Hsp90, R697, M698, E699 e E700. Os valores calculados de SASA para Hsp90 são denotados acima de cada resíduo. (D) Espectro spectra Tandem MS para R697, M698, E699 e E700 mostrando uma modificação +16 FPOP. Esta figura foi modificada a partir de Espino et al.4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A referência atual para o estudo das interações proteína simultânea in vivo (PPI) é a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Em sua forma mais simples, esta técnica estuda PPI por transferência de energia entre duas moléculas quando estão próximas uma da outra15. Ao contrário das técnicas de Esm, a FRET não tem a resolução para caracterizar mudanças conformacionais e locais de interação ao nível de aminoácidos. As técnicas baseadas em Esm têm sido cada vez mais utilizadas para o estudo do PPI16. IV-FPOP é um método hrpf que permite a análise estrutural da proteína in vivo em C. elegans. Para rotular com sucesso C. elegans por IV-FPOP, é importante montar adequadamente o sistema de fluxo microfluido para reduzir a perda de amostras. O capilar de 250 μm i.d. mostrou maximizar a recuperação da amostra quando comparado com os capilares de i.d. menores4. Os capilares maiores não foram testados, porém o sistema de fluxo microfluido foi projetado usando um capilar com a mesma id. como um sistema de citometria de fluxo comercialmente disponível para a classificação de C. elegans. 17 O tamanho da amostra de vermes também é importante, um tamanho amostral inferior a ~10.000 por amostra antes do FPOP não produz concentrações de proteínas altas o suficiente para análise de LC-MS/MS. Tamanhos de amostras mais altos (>10.000 worms) também podem ser usados ajustando o volume inicial inicial (etapa 4.5).
A montagem adequada do sistema de fluxo microfluido é importante. Vazamentos na via amostra resultam em um fluxo inconsistente dos vermes ou H2O2. As ferrules, mangas e válvulas 3-2 podem ser reutilizadas a partir de múltiplos experimentos IV-FPOP se devidamente limpos após cada experimento. No entanto, recomendamos montar um novo sistema de fluxo microfluido para cada réplica biológica. Se os microfluidos forem montados corretamente, os vermes e H2O2 se misturarão na mistura-T com pressão mínima para trás. Como controle de qualidade (QC) do sistema de fluxo microfluido, recomendamos testar a eficiência da mistura usando corantes coloridos. É importante monitorar o movimento dos agitadores magnéticos dentro da seringa de verme durante iv-FPOP, a mistura de amostra inadequada na seringa de verme ou a mistura-T pode resultar em pressão traseira causando vazamentos. Além disso, condições de mistura ruins levam a grandes perdas de amostras, baixa exposição a laser de vermes na janela do laser e entupimento.
A manutenção de Elegans é importante para diminuir a oxidação de fundo. Recomendamos o crescimento dos vermes a baixas temperaturas condições de baixo estresse, pois altas temperaturas podem afetar a oxidação total do fundo. Recomenda-se um conjunto de amostras de controle apenas de vermes, sem H2O2 e sem irradiação a laser, é recomendado para todos os experimentos IV-FPOP para explicar a oxidação de fundo devido à manutenção laboratorial. Uma das limitações atuais desta técnica é o número total de peptídeos oxidativamente modificados identificados e o número total de resíduos oxidados por peptídeo, a fim de obter maiores informações estruturais proteicas. Embora não recomendado, um aumento nas modificações oxidativas poderia ser alcançado usando maiores concentrações de peróxido de hidrogênio. Um aumento no peróxido de hidrogênio poderia alterar significativamente importantes vias biológicas, bem como levar a desdobramentos induzidos por oxidação. Se a concentração de peróxido de hidrogênio para IV-FPOP for aumentada, recomenda-se testar a viabilidade do verme e a oxidação de fundo, pois as concentrações superiores a 200 mM não foram testadas.
O protocolo LC-MS/MS descrito pode ser otimizado e modificado para atender ao MS QC de outros laboratórios. O uso de técnicas de cromatografia 2D tem sido previamente demonstrado para aumentar a identificação de peptídeos e proteínas oxidativamente modificados18. No entanto, as técnicas de enriquecimento proteico que visam uma proteína específica de interesse não são recomendadas, incluindo, mas não se limitando a precipitação de anticorpos ou ensaios de retirada. Essas técnicas podem influenciar um conformer de proteína se o sítio epítopo/encadernação da proteína tiver sido oxidativamente modificado pelo IV-FPOP. Novos desenvolvimentos na pegada de reagentes radicais, como o sulfato radicalanion 10 ou trifluorometilação19 poderiaaumentar a versatilidade do IV-FPOP. Embora o único reagente de rotulagem testado in vivo até agora seja o peróxido de hidrogênio, outros radicais ativados a laser poderiam ser otimizados. O uso de outros radicais deve ser compatível com a viabilidade do verme, permeável celular e o comprimento de onda laser de 248 nm. Devido ao uso de C. elegans como um sistema modelo para muitas doenças humanas, o IV-FPOP tem o potencial de ter um forte impacto no estudo do papel da estrutura proteica na patogênese da doença.
Disclosures
Esta publicação foi escrita em cumprimento parcial da tese de doutorado da JAE. Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por fundos de start-up da Universidade de Maryland, Baltimore e do NIH 1R01 GM 127595 concedido ao LMJ. Os autores agradecem ao Dr. Daniel Deredge por sua ajuda na edição do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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