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Biochemistry

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए वीवो हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग में

Published: April 1, 2020 doi: 10.3791/60910
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland

Summary

वीवो फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण में प्रोटीन (चतुर्थ-एफपीओपी) एक हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग तकनीक है जो उनके मूल वातावरण में प्रोटीन संरचना के मानचित्रण के लिए अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल चतुर्थ-एफपीओ माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की असेंबली और सेट-अप का वर्णन करता है।

Abstract

प्रोटीन का फास्ट ऑक्सीकरण (एफपीओपी) प्रोटीन संरचना, प्रोटीन-लिगामेंट इंटरैक्शन और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) विधि है। एफपीओ हाइड्रोक्सिल कण उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के फोटोलिसिस के लिए 248 एनएम पर एक KrF एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है जो ऑक्सीडेटिव रूप से सॉल्वेंट-सुलभ अमीनो एसिड साइड चेन को संशोधित करता है। हाल ही में, हमने वीवी-एफपीओ पीडब्ल्यूओ नामक कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस (सी एलिगेंस)में वीवो ऑक्सीडेटिव लेबलिंग में एफपीओ के उपयोग का विस्तार किया। पारदर्शी सूत्रकृमि का उपयोग कई मानव रोगों के लिए मॉडल सिस्टम के रूप में किया गया है। चतुर्थ-एफपीओ द्वारा सी एलिगेंस में संरचनात्मक अध्ययन हाइड्रोजन पेरोक्साइड को तेज करने की जानवर की क्षमता, 248 एनएम पर लेजर विकिरण के लिए उनकी पारदर्शिता और संशोधन की अपरिवर्तनीय प्रकृति के कारण संभव है। चतुर्थ-एफपीओ लेबलिंग, आईवी-एफपीओ पैरामीटर, प्रोटीन निष्कर्षण, और एलसी-एमएस/एमएस अनुकूलित मापदंडों के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की असेंबली यहां वर्णित है ।

Introduction

प्रोटीन इंटरैक्शन और संरचनापरिवर्तन का अध्ययन करने के लिए हाल के वर्षों में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ प्रोटीन फुटप्रिंटिंग का उपयोग किया गया है। हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) विधियां प्रोटीन अमीनो एसिड साइड चेन को संशोधित करके प्रोटीन सॉल्वेंट एक्सेसिबिलिटी की जांच करती हैं। HRPF विधि, प्रोटीन के तेजी से फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (FPOP)1,विट्रो2में प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इन सेल (आईसी-FPOP)3,और सबसे हाल ही में वीवो (चतुर्थ-FPOP)4में । एफपीओ हाइड्रोक्साइल रेडिकल1बनाने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के फोटोलिसिस द्वारा हाइड्रोक्सिल कणों को तेजी से उत्पन्न करने के लिए 248 एनएम तरंगदैर्ध्य एक्सीमर लेजर का उपयोग करता है। बदले में, इन कणों एक माइक्रोसेकंड समय पैमाने पर 20 अमीनो एसिड में से 19 लेबल कर सकते हैं, तेजी से प्रोटीन से प्रकट कर सकते हैं । हालांकि, हाइड्रोक्सिल कणों के साथ प्रत्येक अमीनो एसिड की प्रतिक्रिया 1000-गुना फैली हुई है, एक सुरक्षा कारक (पीएफ)5की गणना करके साइड चेन ऑक्सीकरण को सामान्य करना संभव है।

चूंकि एफपीओ अपने आकार या प्राथमिक अनुक्रम की परवाह किए बिना प्रोटीन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित कर सकता है, इसलिए यह इन-सेल और वीवो प्रोटीन अध्ययनों के लिए लाभप्रद साबित होता है। चतुर्थ-FPOP सी एलिगेंस में प्रोटीन संरचना की जांच इसी तरह इन विट्रो और इन-सेल अध्ययन4के लिए करता है । सी elegans सूत्रकृमि परिवार का हिस्सा है और व्यापक रूप से मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है । निष्क्रिय और सक्रिय प्रसार दोनों द्वारा हाइड्रोजन पेरोक्साइड को तेज करने की कीड़ा की क्षमता विभिन्न शरीर प्रणालियों में प्रोटीन संरचना के अध्ययन के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, एफपी6के लिए आवश्यक 248 एनएम लेजर तरंगदैर्ध्य में उनकी पारदर्शिता के कारण सी एलिगेंस चतुर्थ-एफपीपी के लिए अनुकूल हैं। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस विधि का युग्मन पारंपरिक बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण ों का उपयोग करके कई संशोधित प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम सी एलिगेंस में प्रोटीन संरचना के विश्लेषण के लिए आईवी-एफपीओ का प्रदर्शन करने का वर्णन करते हैं। प्रायोगिक प्रोटोकॉल के लिए कोनरमैन एट अल7से अनुकूलित चतुर्थ-एफपीओके के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की असेंबली और सेट-अप की आवश्यकता होती है। चतुर्थ-एफपीओ के बाद, प्रोटीन निष्कर्षण के लिए नमूने समरूप होते हैं। प्रोटीन के नमूनों को प्रोटेलियोज़ किया जाता है और पेप्टाइड्स का विश्लेषण तरल क्रोमेटोग्राफ (एलसी) टैंडेम एमएस द्वारा किया जाता है, जिसके बाद क्वांटिफिकेशन होता है।

Protocol

1. सी elegans रखरखाव और संस्कृति

  1. मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं8के बाद अपने चौथे लार्वा (L4) चरण में कीड़े कालोनियों को उगाएं और सिंक्रोनाइज़ करें।
  2. The day of IV-FPOP experiment, wash L4 worms from bacterial lawns (OP50 E. coli) with M9 buffer (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2HPO4, 0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
  3. आईवी-एफपीओ नमूने के प्रति ~ 10,000 कीड़े के 500 μL aliquots प्राप्त करें।

2. माइक्रोफ्लूइडिक फ्लो सिस्टम असेंबली

  1. फ्लोरिनेट एथिलीन प्रोपलीन (एफईपी) ट्यूबिंग (1/16 में) बाहरी व्यास (o.d.) x 0.020 इन इन इन इनर व्यास (i.d.)) के 2 सेमी टुकड़े को काटकर फ्लो सिस्टम असेंबली शुरू करें।
  2. एक साफ विच्छेदन सुई का उपयोग करना, FEP ट्यूबिंग के i.d. को चौड़ा करने के लिए केवल एक छोर पर एक छोटा गड्ढा बनाने के लिए, लंबाई में ~ ५० मिमी । गड्ढा काफी बड़ा करने के लिए जुड़े सिलिका के दो ३६० μm o.d. टुकड़े फिट होना चाहिए ।
    नोट: विपरीत छोर को चौड़ा न करें क्योंकि इस अंत का उपयोग केवल आउटलेट केशिका फिट करने के लिए किया जाएगा।
  3. सिरेमिक कटर से 250 माइक्रोन यानी फ्यूज्ड सिलिका के दो 15 सेमी के टुकड़े काट दिए। ये दोनों टुकड़े प्रवाह प्रणाली की इंप्लीसिंग लाइनें बन जाएंगी।
  4. आत्म चिपकने वाला टेप का उपयोग करना, टेप दो २५० μm यानी केशिकाओं एक साथ सुनिश्चित करने के लिए वे एक दूसरे के समानांतर है और उनके सिरों १००% निकाल रहे हैं ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि फ्यूज्ड सिलिका सिरों को काटने के बाद कुचल नहीं दिया जाता है, और सीधे और 100% एक दूसरे के खिलाफ फ्लश किए जाते हैं, आवर्धक ग्लास का उपयोग करके या स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे उनकी जांच करने की सिफारिश की जाती है।
  5. FEP ट्यूबिंग के हस्तनिर्मित गड्ढा में दो टेप केशिकाओं डालें। केशिकाओं को हस्तनिर्मित गड्ढा के बहुत किनारे तक धकेलें।
    सावधानी: प्रवाह प्रणाली की प्रभावकारिता बनाए रखने के लिए, हस्तनिर्मित गड्ढा पिछले धक्का नहीं है(चित्रा 1a)।
  6. एक साफ सतह पर एपॉक्सी राल की एक छोटी सी बिंदी रखें और एक विच्छेदन सुई के साथ मिलाएं।
  7. जल्दी से, एक ही सुई का उपयोग करके, इंफ्यूजिंग केशिकाओं के अंत में राल की एक छोटी सी बूंद रखें जहां वे एफईपी ट्यूबिंग से जुड़ते हैं और राल को सूखने, आउटलेट-साइड को लटकाने की अनुमति देते हैं, कुछ मिनटों के लिए(चित्रा 1a)।
  8. जबकि रेसिन सूख जाता है, FEP ट्यूबिंग और दो केशिकाओं को एक साथ बाध्यकारी, एक नया २५० μm यानी केशिका काट । नई केशिका प्रवाह प्रणाली की दुकान केशिका बन जाएगा। केशिका की वांछित लंबाई नीचे समीकरण का उपयोग कर गणना की जा सकती है:
    Equation 1
    जहां एल केशिका की लंबाई सेंटीमीटर में कटौती की जाती है, टी मिनटों में वांछित प्रतिक्रिया समय है, एफ एमएल/मिन में प्रवाह दर है, और यानी सेंटीमीटर में केशिका का आंतरिक व्यास है ।
    नोट: आउटलेट केशिका काटने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए समाप्त होता है कि वे सीधे हैं और कुचल नहीं की जांच करें।
  9. एक बार जब रेसिन सूख जाता है, तो एफईपी ट्यूबिंग आउटलेट अंत के माध्यम से नए केशिका डालें। आउटलेट केशिका के अंदर सिरों और दो infusing केशिकाओं FEP ट्यूबिंग के अंदर एक दूसरे के खिलाफ फ्लश किया जाना चाहिए, यह मिश्रण टी(चित्रा 1b)बनाता है ।
  10. आउटलेट केशिका और FEP ट्यूबिंग को ताजा एपॉक्सी राल के साथ बांधें जैसा कि चरण 2.6 और 2.7 में वर्णित है।
  11. प्रवाह प्रणाली को एक साथ बांधने के लिए रात भर सूखने के लिए रेसिन की अनुमति दें। अगले दिन माइक्रोफ्लूइडिक फ्लो सिस्टम स्थापित करें(चित्रा 1c)।

3. वीवो एफपीओपी में माइक्रोफ्लूइडिक फ्लो सिस्टम

  1. एक 5 मिलीसी सिरिंज के अंदर चार चुंबकीय उभारक डालें। यह सिरिंज सैंपल सिरिंज बन जाती है। चुंबकीय उभारक आईवी-एफपीओपी(चित्रा 2A)के दौरान सिरिंज के अंदर बसने से कीड़े को रोकते हैं।
  2. M9 के साथ दो 5 mL सिरिंज भरें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक सिरिंज के अंदर कोई हवा बुलबुले नहीं हैं क्योंकि वे प्रवाह दर और मिश्रण दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं।
  3. प्रत्येक 5 मिलीस सिरिंज के लिए एक Luer एडाप्टर कनेक्ट सुनिश्चित करने के लिए वे उंगली तंग कर रहे है और जगह में सुरक्षित ।
  4. प्रत्येक सिरिंज को एक 3-2 वाल्व से अटैच करें। सिरिंज को वाल्व के मध्य बंदरगाह(चित्रा 2 बी)से जोड़ा जाना चाहिए।
  5. डुअल सिरिंज पंप के लिए प्रत्येक 5 mL सिरिंज सुरक्षित और पुशर ब्लॉक से सिरिंज के लिए दबाव को रोकने के लिए यांत्रिक स्टॉप कॉलर समायोजित करें। स्टॉप कॉलर सेट करते समय चुंबकीय उभारा ओं को जोड़कर ध्यान रखें।
  6. सुपर फ्लैक्स नट, एफईपी स्लीव और सुपर फ्लैक्स फेरूल(चित्रा 2B)का उपयोग करके प्रत्येक 3-2 वाल्व के शीर्ष बंदरगाह पर घर का बना माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली के प्रत्येक संचार केशिका अंत को संलग्न करें।
  7. 3-2 वाल्व (नीचे बंदरगाह) के शेष खोले गए बंदरगाह के लिए, सुपर फ्लैक्सनट, एफईपी स्लीव और सुपर फ्लैक्सेस फर्रूल(चित्रा 2B)का उपयोग करके 10 सेमी 450 माइक्रोन यानी केशिका देते हैं। ये केशिकाएं वापस लेने वाले नमूने केशिकाएं बन जाती हैं।
  8. पंप प्रवाह शुरू करें और दृश्य लीक के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली के सभी कनेक्शनों की जांच करें। प्रायोगिक प्रवाह दर का उपयोग करके कम से कम तीन सिरिंज की मात्रा प्रवाहित करें। अंतिम प्रवाह दर लेजर विकिरण खिड़की, लेजर आवृत्ति, और एक शून्य अपवर्जन अंश मात्रा पर निर्भर है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, 375.52 माइक्रोन/मिन की अंतिम प्रवाह दर की गणना 2.55 मिमी, 250 माइक्रोन यानी फ्यूज्ड सिलिका, शून्य अपवर्जन अंश और 50 हर्ट्ज आवृत्ति की लेजर विकिरण खिड़की से की गई थी।
    1. प्रवाह पथ 3-2 वाल्व हैंडल पर तीर से चिह्नित है। प्रत्येक सिरिंज को वापस लेने की स्थिति में वाल्व हैंडल से मैन्युअल रूप से फिर से भरा जा सकता है।
      नोट: 3-2 वाल्व पर लीक सुपर flangeless अखरोट फिर से पंगा लेना या वाल्व कनेक्शन (सुपर flangeless अखरोट, FEP आस्तीन, या सुपर flangeless ferrule) के किसी भी जगह से तय किया जा सकता है । मिक्सिंग-टी पर लीक के लिए माइक्रोफ्लूइडिक फ्लो सिस्टम (चरण 2.1 से 2.11) की पुनर्सभा की आवश्यकता होती है।
  9. प्रायोगिक पीठ के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली ले जाएँ और एक 360 μm o.d. स्टेनलेस स्टील यूनियन(चित्रा 2सी, डी)का उपयोग कर विकिरण मंच के लिए आउटलेट केशिका सुरक्षित।
  10. लंबी पहुंच वाले लाइटर का उपयोग करके, लेजर विकिरण खिड़की पर फ्यूज्ड सिलिका की कोटिंग जलाएं। लिंट-मुक्त ऊतक और मेथनॉल का उपयोग करके जले हुए कोटिंग को साफ करें।
    नोट: जलते चक्र और मेथनॉल सफाई चक्र के बीच वैकल्पिक केशिका को अधिक गर्म करने से बचने के लिए अतिरिक्त गर्मी पिघल सकता है और/
  11. चुंबकीय उभारक युक्त 5 मिलीसी सिरिंज के ऊपर चुंबकीय उभारा ब्लॉक की स्थिति। चुंबकीय रबड़ ब्लॉक की गति और स्थिति को समायोजित करें ताकि 5 मिली सिरिंज के अंदर चुंबकीय उभारक धीरे-धीरे और लगातार घूम रहे हैं।

4. वीवो एफपीओपी में

  1. KrF एक्सीमर लेजर चालू करें और थायराट्रॉन को वार्म-अप करने की अनुमति दें।
    सावधानी: लेजर 248 एनएम तरंगदैर्ध्य पर दृश्यमान और अदृश्य विकिरण उत्सर्जित करता है जो आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। लेजर चालू करने और बीम निकास खिड़की खोलने से पहले उचित आंखों की सुरक्षा पहननी चाहिए।
  2. बीम एग्जिट विंडो पर ऑप्टिकल सेंसर रखकर कम से कम 100 दालों के लिए 50 हर्ट्ज की फ्रीक्वेंसी पर लेजर एनर्जी को मापें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, 150 ± 2.32 एमजे की लेजर ऊर्जा के साथ 2.55 मिमी विकिरण खिड़की का उपयोग किया गया था।
  3. लगभग 10,000 कीड़े (500 माइक्रोन) प्राप्त करें और नमूने सिरिंज में मैन्युअल रूप से नमूने को वापस लें।
  4. 3 mL के अंतिम नमूना मात्रा के लिए M9 बफर के 2.5 mL के साथ नमूना सिरिंज भरें। सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले नमूना सिरिंज में पेश कर रहे हैं।
  5. 200 mM H2O2के 3 mL के साथ दूसरी सिरिंज भरें, फिर से सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कोई हवा बुलबुले पेश कर रहे हैं।
  6. आउटलेट केशिका के अंत में, एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे 15 mL शंकुली ट्यूब जिसमें 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 m M N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN), और 1% डिमेथिल सल्फास ऑक्साइड अतिरिक्त एच2O2,हाइड्रोक्सील कट्टरपंथियों, और मेथिओनीन सल्फास ऑक्साइड को क्रमशः बाधित करते हैं।
  7. सॉफ्टवेयर विंडो से एक्सीमर लेजर शुरू करें, पहली पल्स की प्रतीक्षा करें, और दोहरी सिरिंज से नमूना प्रवाह शुरू करें।
    नोट: नमूनों को 3 नमूनों की स्थिति के तहत तकनीकी त्रिपेटिकेट्स में जैविक डुप्लिकेट में चलाया जाना चाहिए: एच2ओ2 (नमूना) के साथ लेजर विकिरण, एच2ओ2 के साथ कोई लेजर विकिरण और कोई लेजर विकिरण नहीं एच2ओ2 (नियंत्रण), जैविक सेट प्रति 9 नमूनों के लिए कुल ।
  8. 15 mL ट्यूब में पूरे नमूने ले लीजिए, जबकि सक्रिय रूप से नमूना सिरिंज से कुछ वापस दबाव के रूप में किसी भी दृश्य लीक के लिए नमूना प्रवाह की निगरानी कभी कभी निर्माण कर सकते हैं।
  9. चतुर्थ-एफपीओ के बाद, 2 मिन के लिए 805 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा पैलेट कीड़े। 2 मिन के लिए 805 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करके पैलेट कीड़े निकालें, लाइसिस बफर (8 एम यूरिया, 0.5% एसडीएस, 50 एमएम हेप्स, 50 एमएम नासीएल, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम फिनाइलमेथाइलसुल्फीनिल फ्लोराइड [पीएमएसएफ]) के 250 माइक्रोन जोड़ें। नमूना पाचन तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक साफ माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज ट्यूब, फ्लैश फ्रीज और स्टोर करें।

5. प्रोटीन निष्कर्षण, शुद्धि, और प्रोटेलियोलिसिस

  1. बर्फ पर जमे हुए नमूने गल और 10 एस के लिए ध्वनि द्वारा समरूपता, एक ६० एस बर्फ ऊष्मायन के बाद । ध्वनि के कई दौर की आवश्यकता हो सकती है, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 2 माइक्रोन नमूना अलीकोट रखकर एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे होमोजेनेट देखा जा सकता है। जब कीड़े के टुकड़े नहीं छोटे होते हैं तो नमूना समरूपता पूर्ण होता है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र समरूप कीड़े और एक साफ माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में अधिनात इकट्ठा।
  3. निर्माता के निर्देशों का उपयोग करके बिकिकोनिनिक एसिड परख (बीसीए परख) का उपयोग करके नमूना प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें।
    नोट: नमूना एकाग्रता पसंद के किसी भी जैव रासायनिक प्रोटीन एकाग्रता परख का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । लिसिस बफर (8 एम यूरिया, 0.5% एसडीएस, 50 एमएम एचईपी, 50 एम एम एनआइसी, 1 एमएम ईटीए, 1 एमएम पीएमएसएफ) के साथ रिएजेंट अनुकूलता को ध्यान में रखें। इसके अतिरिक्त, एक बफर कमजोर पड़ना आवश्यक हो सकता है।
  4. प्रत्येक नमूने से 100 μg प्रोटीन प्राप्त करें और साफ माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में रखें।
  5. सभी नमूनों में डिफिफाइड बांड को कम करने के लिए 10 एमएम अंतिम एकाग्रता में dithiothreitol (DTT) जोड़ें। भंवर, नीचे स्पिन, और ४५ मिन के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट नमूने ।
  6. 10 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान के लिए शांत नमूने।
  7. कम अवशेषों को अल्कालेट करने के लिए 50 एमएम अंतिम एकाग्रता में iodoacetamide (आईएए) जोड़ें। भंवर, नीचे स्पिन, और कमरे के तापमान पर 20 मेंस के लिए इनक्यूबेट नमूने प्रकाश से संरक्षित ।
  8. एल्किलेशन के तुरंत बाद, प्रोटीन के नमूने को 100% प्री-ठंडा एसीटोन की 4 मात्रा जोड़कर और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके बढ़ादें।
  9. अगले दिन, पैलेट प्रोटीन 10 000 x ग्राम पर 10 000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा उपजी। 90% एसीटोन के साथ नमूना गोली धोएं, सुपरनेट को हटा दें, और पैलेट को 2-3 मिन के लिए सूखने दें।
  10. 25 एमएम ट्रिस-एचसीएल (1 μg/μL) में प्रोटीन पैलेट को फिर से सस्पेंड करें । 1:50 (w/w) के प्रोटीन अनुपात में अंतिम प्रोटीज पर ट्राइप्सिन जोड़ें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने पचाएं।
  11. अगले दिन 5% फोरमिक एसिड जोड़कर ट्राइप्सिन पाचन प्रतिक्रिया को बुझाएं।
    नोट: एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण (चरण 6.1-6.5) के लिए प्रति नमूना पेप्टाइड्स की न्यूनतम 0.5 माइक्रोन की आवश्यकता होती है। निर्माता के प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित मात्रात्मक रंगीन पेप्टाइड परख (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके नमूना पेप्टाइड सांद्रता निर्धारित करें।

6. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस)

  1. निम्नलिखित एलसी मोबाइल चरणों का उपयोग करें: 0.1% एफए (ए) में पानी और 0.1% एफए (बी) में एसीएन।
  2. एक जाल कॉलम (180 μm × 20 मिमी) जिसमें C18 (5 μm, 100 Å) युक्त पेप्टाइड्स का 0.5 μg लोड करें और 15 माइक्रोन/मिन प्रवाह दर पर 15 मिन के लिए 99% विलायक ए और 1% बी के साथ 1% बी धोएं।
  3. सी18 रिवर्स फेज मटेरियल (5 माइक्रोन, 125 Å) के साथ इन-हाउस पैक्ड कॉलम (0.075 मिमी यानी × 20 मिमी) का उपयोग करके अलग पेप्टाइड्स।
  4. निम्नलिखित विश्लेषणात्मक पृथक्करण विधि का उपयोग करें: ढाल 120 00 00 00 के लिए 300 nL/मिन पर पंप किया गया था: 0−1 मिन, 3% बी; 2−90 मिन, 10−45% बी; 100−105 मिन, 100% बी; 106−120 मिन, 3% बी
  5. उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके सकारात्मक आयन मोड नैनो-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (एनएसईएसआई) में पेप्टाइड्स का डेटा अधिग्रहण करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, एक अल्ट्रा-परफॉर्मेंस एलसी (UPLC) इंस्ट्रूमेंट कपल टू ए हाई-रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया गया था। डेटा निर्भर अधिग्रहण का उपयोग किया गया था। एमएस1 के लिए एम/जेड स्कैन रेंज 60,000 रेजोल्यूशन पर 3750-1500 और 60 एस डायनेमिक अपवर्जन पर थी। +1 और >6 के चार्ज राज्यों वाले आयनों को बाहर रखा गया था । 5.5e5 के एक स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य का उपयोग अधिकतम इंजेक्शन समय 50 एमएस और 5.5e4 की तीव्रता सीमा के साथ किया गया था। MS2 के लिए चयनित आयनों को 32% सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा का उपयोग करके उच्च ऊर्जा टकराव विच्छेदन (एचसीडी) विखंडन के अधीन किया गया था। स्पेक्ट्रोमीटर में 15,000 संकल्प और 5.004 एजीसी लक्ष्य के साथ टुकड़े आयनों का पता चला।

7. डेटा विश्लेषण

  1. सी एलिगेंस डेटाबेस के खिलाफ बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स एनालिसिस सॉफ्टवेयर के साथ मिलकर एमएस फाइलें खोजें।
  2. प्रोटीन विश्लेषण खोज मापदंडों का पालन करें के रूप में सेट: एक ट्रिप्सिन चूक दरार, 375-1500 मीटर/z पेप्टाइड मास रेंज, ०.०२ के खंड जन सहिष्णुता, और 10 पीपीएम के अग्रदूत जन सहिष्णुता । कार्बामिडोमथाइलेशन को स्थिर संशोधन के रूप में सेट किया गया9है और सभी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी पक्ष-श्रृंखलासंशोधन9,10 को गतिशील के रूप में जानते हैं। पेप्टाइड पहचान 99% आत्मविश्वास (उच्च) पर 95% आत्मविश्वास (मध्यम) और अवशेषों पर स्थापित की जाती है। झूठी खोज दर (एफडीआर) 1% निर्धारित है।
  3. एक इलेक्ट्रॉनिक डेटाबेस में डेटा का निर्यात करें और11से नीचे के समीकरण का उपयोग करके पेप्टाइड या अवशेषों के अनुसार ऑक्सीकरण की सीमा को संक्षेप में प्रस्तुत करें:
    Equation 2
    नोट: जहां ईआईसी क्षेत्र संशोधित एक ऑक्सीडेटिव संशोधन के साथ पेप्टाइड या अवशेषों का निकाला आयन क्रोमेटोग्राफिक क्षेत्र (ईआईसी) है, और ईआईसी क्षेत्र ऑक्सीडेटिव संशोधन के साथ और बिना एक ही पेप्टाइड या अवशेषों का कुल क्षेत्र है।

Representative Results

आईवी-एफपीओ के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली में, एच2ओ2 और कीड़े को लेजर विकिरण से ठीक पहले तक अलग रखा जाता है। यह अलगाव एच2ओ2 के एंडोजेनस कैटालेज और अन्य सेलुलर तंत्र12से टूटने को समाप्त करता है । 250 माइक्रोन यानी केशिका का उपयोग दो जैविक प्रतिकृतियों में 63-89% के बीच कुल नमूना वसूली दिखाता है, जबकि 150 माइक्रोन यानी केशिका केवल 21-31% वसूली(चित्रा 3ए)दिखाता है। एक छोटे यानी केशिका (150 माइक्रोन)(चित्रा 3 सी)की तुलना में चतुर्थ-एफपीओ और एकल कृमि प्रवाह(चित्रा 3 बी)के दौरान एक बड़े यानी केशिका (250 माइक्रोन) के उपयोग से बेहतर कृमि प्रवाह होता है। 150 माइक्रोन यानी केशिका एकल कृमि प्रवाह(चित्रा 3 सी)के लिए अनुमति नहीं देता है और कई कीड़े लेजर विकिरण खिड़की पर एक साथ बहते हुए देखे जाते हैं जो प्रति एकल कीड़े लेजर एक्सपोजर की मात्रा को कम कर देता है।

चतुर्थ-एफपीओ एक सहसंयोजक लेबलिंग तकनीक है जो सी एलिगेंसमें विलायक पहुंच की जांच करती है। चित्रा 4A एक प्रतिनिधि एक FPOP संशोधित और असंशोधित पेप्टाइड के आयन क्रोमेटोग्राम (ईआईसी) निकाले दिखाता है । हाइड्रोक्सिल रेडिकल लेबल ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित पेप्टाइड्स की केमिस्ट्री को बदलता है, इस प्रकार एफपीओ संशोधित पेप्टाइड्स को अधिक ध्रुवीय बनाता है। रिवर्स चरण क्रोमेटोग्राफी में, आईवी-एफपीओ संशोधित पेप्टाइड्स में असंशोधित पेप्टाइड्स की तुलना में पहले प्रतिधारण समय होता है। अलग पेप्टाइड्स के एमएस/एमएस विखंडन ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित अवशेषों(चित्रा 4B)की पहचान के लिए अनुमति देता है ।

चतुर्थ-एफपीओ ने सी एलिगेंस (चित्रा 5ए, बी)के भीतर दो जैविक प्रतिकृतियों में कुल 545 प्रोटीन को संशोधित किया है। प्रोटीन फुटप्रिंटिंग विधि के रूप में चतुर्थ-एफपीओ का लाभ कीड़े के भीतर विभिन्न प्रकार के शरीर प्रणालियों में प्रोटीन को संशोधित करने की तकनीक की क्षमता पर निर्भर करता है(चित्रा 5C)। इस विधि को कीड़ा के भीतर शरीर के ऊतकों या अंग की परवाह किए बिना प्रोटीन संरचना और प्रोटीन बातचीत की जांच करने की अनुमति होगी । इसके अलावा, मिलकर एमएस विश्लेषण वीवी-एफपीओ जांच वीवो में सॉल्वेंट एक्सेसिबिलिटी की पुष्टि करता है। मायोसिन चैपरन प्रोटीन यूएनसी-45 के साथ जटिल में हीट शॉक प्रोटीन 90 (Hsp90) के ऑक्सीकरण पैटर्न का विश्लेषण किया गया था(चित्रा 6)। Hsp90 के लिए एमएस/एमएस विश्लेषण चार ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित अवशेषों(चित्रा 6सी, डी),FPOP संशोधन (ln (पीएफ))5 की सामान्यीकृत सीमा से पता चलता है Hsp90 के अवशेष M698 इंगित करता है कम अवशेषों R697, E699, और E700 से सुलभ जब UNC-45(चित्र6C)के लिए बाध्य होता है । ऑक्सीकरण में ये अंतर साहित्य विलायक सुलभ सतह क्षेत्र (एसएएसए) गणना (पीडीबी 4I2Z13)द्वारा मान्य हैं। अवशेष M698 में 0.03 का एसएएसए मूल्य है जिसे अवशेषों R697, E699 और उच्च एसएएसए मूल्यों(चित्र6C)के साथ E700 की तुलना में एक दफन अवशेष माना जाता है। 14

Figure 1
चित्रा 1. वीवो एफपीओ माइक्रोफ्लूइडिक फ्लो सिस्टम में योजनाबद्ध। (क)आईवी-एफपीओ प्रवाह प्रणाली की दो इंफ्यूजिंग लाइनें (नारंगी) एफईपी ट्यूबिंग (पीले) के अंदर दिखाई जाती हैं, एपॉक्सी राल की सही बाध्यकारी स्थिति हल्के नीले रंग के सर्कल द्वारा दर्शाई जाती है। (ख)तीन 250 माइक्रोन यानी केशिकाओं द्वारा गठित पूर्ण असेंबल मिक्सिंग-टी। एफईपी ट्यूबिंग के आउटलेट केशिका की सही रेसिन बाध्यकारी स्थिति हल्के नीले रंग के सर्कल द्वारा दर्शाई गई है। (ग) सी एलिगेंसके वीवो सहसंयोजक लेबलिंग में पूरी तरह से असेंबल फ्लो सिस्टम । FPOP से पहले, कीड़े एच2ओ2 से अलग रखा जाता है जब तक बस लेबलिंग से पहले; लेजर विकिरण खिड़की हल्के नीले रंग में दिखाया गया है और लेजर बीम बैंगनी बिजली बोल्ट द्वारा प्रतिनिधित्व किया है। आंकड़े पैमाने पर नहीं हैं । इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. चतुर्थ-एफपीओ पीवी के दौरान माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम। (A)5 मिलीआर सिरिंज के अंदर सी एलिगेंस की प्रतिनिधि तस्वीर । सरगर्मी के बिना, कीड़े सिरिंज (बाएं) के तल पर बसते हैं। चुंबकीय उभारक और क्रियाकर्ता ब्लॉक चतुर्थ-FPOP प्रयोगों (दाएं) के दौरान कीड़े को निलंबन में रखते हैं। (ख)5 मिलीसी सिरिंज की प्रतिनिधि तस्वीर, केशिका को इंफ्यूज करना और 3-2 वाल्व से जुड़े केशिका को वापस लेना । 3-2 वाल्व हैंडल वापस लेने की स्थिति में दिखाया गया है। (ग)आईवी-एफपीओ पीओपी के दौरान माइक्रोफ्लूइडिक फ्लो सिस्टम, चुंबकीय उभारब्लॉक कीड़े के 5 मिलीसी सिरिंज से ऊपर की स्थिति है । (D)आउटलेट केशिका विकिरण चरण में सुरक्षित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3. सी एलिगेंस प्रवाह और वसूली की तुलना दो यानी केशिकाओं का उपयोग कर। (A)250 (ग्रे) और 150 (काले) माइक्रोन यानी केशिकाओं के साथ दो जैविक प्रतिकृति (बीआर) के लिए चतुर्थ-एफपीओ के बाद कीड़े की प्रतिशत वसूली। त्रुटि सलाखों की गणना तकनीकी ट्रिपलिकेट्स में मानक विचलन से की जाती है। सी एल्गन ्स लेजर विकिरण खिड़की के माध्यम से 250 माइक्रोन(बी)और 150 माइक्रोन(सी)यानी केशिकाओं के माध्यम से बहते हैं। कीड़े छोटे केशिका में अधिक कसकर संकुचित होते हैं। 150 माइक्रोन यानी केशिका कीड़े की झुरमुट दिखाती है। इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि एलसी-एमएस/एमएस चतुर्थ-FPOP के बाद परिणाम । (A)एफपीओ संशोधित पेप्टाइड (लाल) और असंशोधित (नीला) का ईआईसी। चयनित पेप्टाइड ऐक्टिन-1 प्रोटीन से संबंधित है। (ख)दोगुना आवेशित असंशोधित ऐक्टिन-1 पेप्टाइड 317-327 का एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम । (ग)दोगुना आवेशित एफपीओ संशोधित ऐक्टिन-1 पेप्टाइड 317-327 के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रम, इस उदाहरण में P323 ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित किया गया था (y5+ आयन, लाल) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5. चतुर्थ-एफपीओ ऑक्सीडेटिव रूप से सी एलिगेंस के भीतर प्रोटीन को संशोधित करता है। (A)दो जैविक प्रतिकृति (बीआर) में 50 हर्ट्ज पर 200 एमएम हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित प्रोटीन के वेन आरेख, बीआर1 नीले रंग में है और बीआर 2 पीला है। (ख)विकिरणित नमूनों में पहचाने गए ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित प्रोटीन के वेन आरेख, हाइड्रोजन पेरोक्साइड नियंत्रण, और तकनीकी ट्रिपलिकेट्स में बीआर 2 में कीड़ा-केवल नियंत्रण । (ग)विभिन्न सी एलिगेंस बॉडी सिस्टम के भीतर ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित प्रोटीन का पाई चार्ट। इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6. विलायक पहुंच के लिए चतुर्थ-FPOP संशोधनों से संबंधित। (A)मायोसिन चैपरन प्रोटीन यूएनसी-45 (ग्रे) (पीडीबी आईडी 4I2Z13)ने एलसी/एमएस/एमएस विश्लेषण, 669−680 और 698−706 (ग्रीन, लेफ्ट इनसेट) द्वारा पहचाने गए दो संशोधित पेप्टाइड्स को रेखांकित किया। यूएनसी-45 Hsp90 पेप्टाइड टुकड़ा (नीला) के लिए बाध्य है। इस टुकड़े के भीतर ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित अवशेष लाठी (लाल) में दिखाए जाते हैं, और यूएनसी-45 को सतह (दाएं इनसेट) के रूप में प्रदान किया जाता है। (ख)यूएनसी-45 पेप्टाइड 669−680 (ऊपर) और 698−706 (नीचे) के टैंडेम एमएस स्पेक्ट्रा ने सीओ2के नुकसान के लिए बी-एंड वाई-आयनों को दिखाया, जो एक एफपीओ संशोधन है । (ग)एचएसपी90 ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित अवशेषों, R697, M698, E699 और E700 के लिए गणना एलएन (पीएफ) । Hsp90 के लिए गणना एसएएसए मान प्रत्येक अवशेष ों के ऊपर निरूपित हैं। (डी)R697, M698, E699, और E700 के लिए मिलकर एमएस स्पेक्ट्रा एक + 16 FPOP संशोधन दिखा । इस आंकड़े को एस्पिनो एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

वीवो प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) के अध्ययन के लिए वर्तमान बेंचमार्क फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) है। अपने सबसे सरल रूप में, यह तकनीक पीपीआई का अध्ययन दो अणुओं के बीच ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा करती है जब वे एक-दूसरे15के करीब निकटता में होते हैं। एमएस तकनीकों के विपरीत, FRET में अमीनो-एसिड स्तर पर संरचना परिवर्तन और बातचीत साइटों की विशेषता का संकल्प नहीं है। पीपीआई16के अध्ययन के लिए एमएस आधारित तकनीकों का तेजी से उपयोग किया गया है । चतुर्थ-एफपीओ एक एचआरपीएफ विधि है जो सी एलिगेंस में वीवो प्रोटीन संरचनात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। चतुर्थ-एफपीओ द्वारा सी एलिगेंस को सफलतापूर्वक लेबल करने के लिए, नमूना हानि को कम करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली को ठीक से इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है। 250 माइक्रोन यानी केशिका ने छोटे यानी केशिकाओंकीतुलना में नमूना वसूली को अधिकतम करने के लिए दिखाया है। बड़े यानी केशिकाओं का परीक्षण नहीं किया गया है, हालांकि माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली को सी एलिगेंसकी छंटाई के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह साइटोमेट्री प्रणाली के रूप में एक केशिका का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया है। 17 कृमि नमूना आकार भी महत्वपूर्ण है, FPOP से पहले प्रति नमूना ~१०,००० से कम का नमूना आकार एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए पर्याप्त उच्च प्रोटीन सांद्रता उपज नहीं है । प्रारंभिक प्रारंभिक प्रारंभिक मात्रा (चरण 4.5) को समायोजित करके उच्च नमूनों के आकार (और 10,000 कीड़े) का भी उपयोग किया जा सकता है।

माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली की उचित असेंबली महत्वपूर्ण है। नमूना मार्ग में लीक कीड़े या एच2ओ2के असंगत प्रवाह में परिणाम है । प्रत्येक प्रयोग के बाद ठीक से साफ होने पर कई चतुर्थ-एफपीओ प्रयोगों से फर्रूल्स, आस्तीन और 3-2 वाल्व का पुन: उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, हम हर जैविक दोहराने के लिए एक नया माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली को इकट्ठा करने की सलाह देते हैं। यदि माइक्रोफ्लुइडिक्स को ठीक से इकट्ठा किया जाता है, तो कीड़े और एच2ओ2 मिश्रण-टी पर न्यूनतम बैक प्रेशर के साथ मिश्रण करेंगे। माइक्रोफ्लूइडिक प्रवाह प्रणाली के गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) के रूप में, हम रंगीन रंगों का उपयोग करके मिश्रण दक्षता का परीक्षण करने की सलाह देते हैं। चतुर्थ-एफपीओ के दौरान कृमि सिरिंज के अंदर चुंबकीय उभारक की गति की निगरानी करना महत्वपूर्ण है, कृमि सिरिंज पर अनुचित नमूना मिश्रण या मिश्रण-टी के परिणामस्वरूप लीक होने का दबाव हो सकता है। इसके अलावा, खराब मिश्रण स्थितियों बड़े नमूना नुकसान, लेजर खिड़की पर कीड़े के गरीब लेजर जोखिम, और clogging के लिए सीसा ।

पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण को कम करने के लिए सी एलिगेंस रखरखाव महत्वपूर्ण है। हम कम तनाव की स्थिति में कम तापमान पर कीड़े उगाने की सलाह देते हैं क्योंकि उच्च तापमान कुल पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण को प्रभावित कर सकता है। केवल कीड़े का एक नियंत्रण नमूना सेट, कोई एच2ओ2 और कोई लेजर विकिरण, प्रयोगशाला रखरखाव के कारण पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण के लिए खाते में सभी चतुर्थ-FPOP प्रयोगों के लिए सिफारिश की है। इस तकनीक की वर्तमान सीमाओं में से एक ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित पेप्टाइड्स की पहचान की गई कुल संख्या है और उच्च प्रोटीन संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रति पेप्टाइड ऑक्सीकृत अवशेषों की कुल संख्या है। हालांकि अनुशंसित नहीं है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उच्च सांद्रता का उपयोग करके ऑक्सीडेटिव संशोधनों में वृद्धि प्राप्त की जा सकती है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड में वृद्धि महत्वपूर्ण जैविक रास्तों को काफी बदल सकती है और साथ ही ऑक्सीकरण-प्रेरित खुलासा करने के लिए नेतृत्व कर सकती है । यदि आईवी-एफपीओ के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता में वृद्धि की जाती है, तो कृमि व्यवहार्यता और पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि 200 मीटर से अधिक सांद्रता का परीक्षण नहीं किया गया है।

वर्णित एलसी-एमएस/एमएस प्रोटोकॉल को अन्य प्रयोगशालाओं के एमएस क्यूसी को पूरा करने के लिए अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है । 2D-क्रोमेटोग्राफी तकनीकों का उपयोग पहले ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित पेप्टाइड्स और प्रोटीन18की पहचान बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। बहरहाल, प्रोटीन संवर्धन तकनीक है कि ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन लक्ष्य की सिफारिश नहीं कर रहे हैं, सहित लेकिन एंटीबॉडी वर्षा या पुल नीचे assays तक ही सीमित नहीं है । यदि प्रोटीन की एपिटोप/बाध्यकारी साइट को चतुर्थ-एफपीओद्वारा संशोधित किया गया है तो ये तकनीक ें एक प्रोटीन कंपआम की ओर पूर्वाग्रह कर सकती हैं । इस तरह के सल्फेट कट्टरपंथी एनीऑन10 या ट्राइफ्लोरोथाइलेशन19 के रूप में कट्टरपंथी अभिकर्मकों, पैरों के निशान में नए विकास चतुर्थ-FPOP की बहुमुखी प्रतिभा में वृद्धि हो सकती है । हालांकि वीवो में परीक्षण किए गए एकमात्र लेबलिंग रिएजेंट हाइड्रोजन पेरोक्साइड है, अन्य लेजर-सक्रिय कणों को अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य कणों का उपयोग कृमि व्यवहार्यता, कोशिका चालगम्य, और 248 एनएम लेजर तरंगदैर्ध्य के साथ संगत साबित होना चाहिए। कई मानव रोगों के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में सी एलिगेंस के उपयोग के कारण, चतुर्थ-FPOP रोग रोगजनकन में प्रोटीन संरचना की भूमिका का अध्ययन करने में एक मजबूत प्रभाव की क्षमता है ।

Disclosures

यह प्रकाशन जेई पीएचडी थीसिस की आंशिक पूर्ति में लिखा गया था। लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को मैरीलैंड विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर और एनआईएच 1R01 जीएम 127595 से स्टार्ट-अप फंडों द्वारा समर्थित किया गया था एलएमजे को सम्मानित किया गया था। लेखक पांडुलिपि के संपादन में मदद के लिए डॉ डेनियल डेएज का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock SGE Analytical Science 008760 2 minimum
60 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FM3279 This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient
Acetone, HPLC Grade Fisher Scientific A929-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg Waters 186007496
ACQUITY UPLC M-Class System Waters
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-100 any brand is sufficient
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material Phenomenex
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Dissecting Needle Fisher Scientific 50-822-525 only a couple are needed
Dithiothreiotol (DTT) AmericanBio AB00490-00005
DMSO, Anhydrous Invitrogen D12345
Epoxy instant mix 5 minute Loctite 1365868
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific S311-100
EX350 excimer laser (248 nm wavelength) GAM Laser
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID IDEX Health & Sciene 1548L
Formic Acid, LC/MS Grade Fisher Scientific A117-50
HEPES Fisher Scientific BP310-500
HV3-2 VALVE Hamilton 86728 2 minimum
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Iodoacetamide (IAA) ACROS Organics 122270050
Legato 101 syringe pump KD Scientific 788101
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene IDEX Health & Sciene P-618L 2 minimum
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M65-500
Methanol, LC/MS Grade Fisher Scientific A454SK-4 4 L quantity is not necessary
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) ACROS Organics 116891000
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' IDEX Health & Sciene F-242X
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" IDEX Health & Sciene F-246
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) ACROS Organics 177350250
OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich 7110-OP any protease inhibitor is sufficient
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
PE50-C pyroelectric energy meter Ophir Optronics 7Z02936
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Scientific 23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific A53225
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 Polymicro Technologies 1068150026
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 Polymicro Technologies 1068150625
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 Polymicro Technologies 1068150019
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P382-500
Proteome Discover (bottom-up proteomics software) Thermo Scientific OPTON-30799
Rotary Magnetic Tumble Stirrer V&P Scientific, Inc. VP 710D3
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps V&P Scientific, Inc. VP 710D3-4
Scissors Fisher Scientific 50-111-1315 any scissors are sufficient
Self-Adhesive Label Tape Fisher Scientific 15937 one roll is sufficient
Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes Fisher Scientific 05-402 any brand is sufficient
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific 15-525-017
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate Fisher Scientific S373-500
Stereo Zoom Microscope Fisher Scientific 03-000-014 a magnifying glass is sufficient
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD IDEX Health & Sciene P-259X
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD IDEX Health & Sciene P-255X
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick V&P Scientific, Inc. VP 722F
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" Thorlabs Inc. UBP2
Urea Fisher Scientific U5378
VHP MicroTight Union for 360µm OD IDEX Health & Sciene UH-436 2 minimum
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

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References

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 158 कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस,हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग एफपीओपी मास स्पेक्ट्रोमेट्री वीवो में प्रोटेओमिक्स
<em>कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस</em> में प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए वीवो हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग में
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Espino, J. A., Jones, L. M. In Vivo… More

Espino, J. A., Jones, L. M. In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (158), e60910, doi:10.3791/60910 (2020).

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