Summary
I det nuvarande protokollet förklarar vi hur man enkelt bearbeta och kultur tonsillar mononukleära celler från friska människor genomgår partiell kirurgiska tonsillektomi att studera medfödda immunsvar vid aktivering, härma virusinfektion i mucosal vävnader.
Abstract
Att studera isolerade celler från slemhinnor-associerade lymfoida vävnader (MALT) gör det möjligt att förstå immunceller svar i patologier som involverar mukosal immunitet, eftersom de kan modellera värd-patogeninteraktioner i vävnaden. Medan isolerade celler som härrör från vävnader var den första cellkultur modell, deras användning har försummats eftersom vävnad kan vara svårt att få. I det nuvarande protokollet förklarar vi hur man enkelt bearbeta och kultur tonsillar mononukleära celler (TMCs) från friska mänskliga tonsiller att studera medfödda immunsvar vid aktivering, härma virusinfektion i mucosal vävnader. Isolering av TMCs från tonsiller är snabb, eftersom tonsiller knappt har någon epitel och ger upp till miljarder av alla större immuncelltyper. Denna metod gör det möjligt att upptäcka cytokinproduktion med hjälp av flera tekniker, inklusive immunoassays, qPCR, mikroskopi, flödescytometri, etc., liknande användningen av perifera mononukleära celler (PBMCs) från blod. Dessutom visar TMCs en högre känslighet för drogtester än PBMCs, som måste beaktas för framtida toxicitetsanalyser. Således är ex vivo TMCs kulturer en enkel och tillgänglig slemhinnor modell.
Introduction
Studier på mänskliga organ är begränsade på grund av tillgänglighet samt uppenbara etiska skäl. Men de är nödvändiga för att fullt ut förstå komplexiteten i mänsklig biologi. Kulturer av isolerade celler (primära kulturer eller cellinjer) är ett standardsystem i cellbiologistudier på grund av deras tillgänglighet. Medan isolerade cellkulturer har tillåtit enastående upptäckter, har användningen av cellinjer kommit på närmare granskning eftersom de inte helt efterlikna in vivo orgelbiologi. Emellertid, kulturen av tredimensionella celler eller vävnad explants är mycket komplex4,5,6. Faktum är att en bit vävnad eller organ är mycket heterogen eftersom dess cellsammansättning skiljer sig beroende på lokaliseringen i vävnaden. Således, med hjälp av vävnadsblock kräver analys av många tekniska och biologiska replikat, vilket leder till behovet av ett stort antal givare eller patienter.
De slemhinna-associerade lymfoida vävnader (MALT) är strukturellt liknar lymfkörtlarna men har unika funktioner, eftersom deras huvudsakliga roll är att reglera mucosal immunitet7. Till skillnad från lymfkörtlarna, som vanligtvis ligger på ett visst avstånd från vävnaderna, malt är i allmänhet ligger omedelbart under epitelet av slemhinna vävnad. Histologiskt består de huvudsakligen av höga koncentrationer av B- och T-celler, men också antigenpresenterande celler som makrofager och dendritiska celler. MALT utgör cirka 50% av lymfoid vävnad i människokroppen. MALT är indelade i nio grupper beroende på var de befinner sig: GALT (gut-), BALT (bronkerna-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (struphuvud-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organiserad) och D-MALT (diffust). O-MALT består huvudsakligen av tonsillerna i Waldeyers tonsillring och är den mest tillgängliga MALT8,,9. Faktum är att tonsiller som ligger i svalget utgör den största barriären som skyddar mag- och luftvägarna från (potentiella) invasiva mikroorganismer10. Dessutom är tonsiller omfattas av en fin stratifierad skivepitelcancer icke-keratiniserande epitel, med stöd av en kapsel av bindväv som innehåller blodkärl, nerver och lymfatik, vilket ger enkel tillgång till immuncellerna11,12. Dessutom tonsillektomi, den kirurgiska handlingen att ta bort tonsiller, är ett vanligt förfarande som utförs på barn med sömn-störd andning, vilket gör tonsiller en lätt tillgänglig vävnad13 i fysiologiska inställningar.
Tonsiller tillåter studier av immuncellsvar i patologier som involverar mukosal immunitet. Faktum är att i HIV-infektion, eftersom tonsiller består av en hög koncentration av immunceller, de är det huvudsakliga målet för virusreplikation men också producera en stor mängd cytokiner som inte upptäcks i cirkulationen14,15. Vid steady states, sällsynta populationer av medfödda-liknande celler finns i olika slemhinnor vävnader, inklusive tonsiller, men är i huvudsak frånvarande från blod.
Mononukleära celler från tonsiller (TMCs) är alltså en mer relevant och komplex modell än PBMCs och kan svara på mer djupgående frågor. Å andra sidan kan användningen av vävnad explants vara komplex och inte alltid relevant för medfödda immunstudier. Således etablerade vi en modell för att studera mucosal immunaktivering med TMCs16. Här beskriver vi en metod för effektiv isolering av TMCs från färska mänskliga tonsiller. Denna metod möjliggör återvinning av ett stort antal immunceller samtidigt som deras integritet för ex vivo studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proverna samlas inte in specifikt för forskningsändamål och studien anses inte vara invasiv. Insamling av mänskliga tonsiller kräver dock etiskt godkännande av de lokala berörda myndigheterna. I vårt fall godkändes det av Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Dessutom uppmanas samtycke från varje patient eller juridiskt ombud att inhämta givares personuppgifter (t.ex. kön, ålder, historia av ENT-infektioner) som kan bidra till att tolka experimentella resultat.
1. Hantering av human tonsillarvävnad
- Lägg tonsiller från varje givare i en steril injektionsflaska på 50 ml som innehåller 25 ml PBS 1x och transportera i rumstemperatur (RT) till laboratoriet enligt myndighetens rekommendationer (använd tre skyddsnivåer: injektionsflaska, en säkerhetsbox och en påse).
OBS: Hela proceduren bör utföras i ett laboratorium för biologisk säkerhetsnivå 2. Alla mänskliga exemplar bör hanteras varsamt eftersom de inte tidigare har kvalificerats och kan innehålla smittämnen. -
Rengör alla verktyg mellan varje användning.
- Ta isär cellsilen efter användning och förvara alla andra instrument (t.ex. mortelstöt, pincett) i ett bad som innehåller en tvättmedelslösning (1/10 volym tvättmedel i H2O) över natten.
- Borsta varje redskap för att ta bort vävnaden och tvätta med rent vatten.
- Torka alla delar väl, förbered sedan cellsilen (85 ml, 37 mm diameter) genom att placera ett 60 mesh stålgaller ovanpå ett 10 mesh stålgaller och tätt stänga ringen.
- Placera alla verktyg i sterila påsar och autoklav.
2. Dissekering av human tonsillarvävnad och isolering av tonsillar mononukleära celler (TMCs)
- Placera cellsilen på en cellodlingsskål på 150 x25 mm 2 (SPL150) och alla instrument i en annan SPL150 för att hålla dem sterila.
- Överför tonsillerna från flaskan till cellsilen med sterila pincett. Häll också i alla PBS, som innehåller några celler som har gått ut tonsiller. Om det behövs lägger du till mer PBS för att sänka ned gallret.
OBS: Vävnaden bör alltid sänkas ned för att undvika uttorkning. - Ta bort cauterized, blodig, och fibroid vävnad med pincett och en skalpell.
OBS: Tonsiller bort från barn behöver inte detta steg. - Skär vävnaderna i små bitar med en diameter på mindre än 0,5 cm med hjälp av skalpellen och de böjda pincetterna. Skär all vävnad så att de små bitarna kan sänkas ned hela tiden.
- Placera några bitar av vävnad i cellen sil och skrapa dem på nätet med ett glas mortelstöt tills endast ett riktigt tunt lager av vit stroma kvarstår. Ta bort och kasta stroma för att undvika igensättning av nätet.
- När alla vävnader har pressats genom nätet, använd en 10 ml pipett för att överföra alla cellfjädring på nätet och skrapa den en sista gång.
- Överför cellfjädringen med en 10 ml pipett till en steril injektionsflaska. Tvätta gallret och cellsilen med PBS 1x. Låt cellupphängningen vila i 5 min vid RT på bänken. Detta steg möjliggör utfällning och gytter av överblivna stroma, döda celler, och eventuella utsläppta DNA, och kommer att underlätta nästa steg.
- Placera en steril sikt på 70 μm ovanpå en ny 50 ml-injektionsflaska (ta försiktigt bort från kuvertet) och överför försiktigt cellfjädringen på den med en 10 ml pipett. Blanda inte suspensionen, eftersom en pellet är ofta närvarande. Om sikten är igensatt, använd baksidan av en steril 1 ml pipettspets för att repa cellerna genom sikten. Ändra sikten så ofta som behövs.
- Centrifugera cellerna vid 250 x g i 10 min vid 4 °C.
- Kasta supernatanten och resuspend pelleten genom att försiktigt blanda flaskan, sedan återsuspend cellerna i 35 ml PBS.
- I en ny injektionsflaska, placera en ny 70 μm sikt ovanpå och överför cellfjädringen på den med en 10 ml pipett. Om sikten är igensatt, använd den teknik som beskrivs i steg 2.7.
3. Isolering av TMCs av Cell Density Gradient
OBS: TMCs kan användas efter steg 2.10. Men för att få en tydligare celllösning och för att ta bort andra cellskräp och eventuella röda blodkroppar rekommenderas det att utföra en celltäthetsgradientisolering av mononukleära celler.
- Tillsätt 15 ml av densitetsgradientmediet (d = 1,076 g/ml) i en ny 50 ml-injektionsflaska. Häll TMCs-lösningen ovanpå densitetsgradientmediet, var noga med att minimera blandningen av fjädringen med densitetsgradientmediet.
- Centrifugera lösningen på 1000 x g i 30 min vid RT med acceleration och avbrott.
- Ta bort med en 10 ml pipett och kassera det övre lagret (som innehåller mestadels PBS 1x) utan att störa gränssnittet mellan TMCs och densiteten gradient medium.
OBS: TFC innehåller ett lågt antal erytrocyter, därför är lösningen tydlig. Således kan gränssnittet mellan lösningen av TMCs i PBS och densitet gradient medium vara svårt att visualisera. Följaktligen kan celler återsuspenderas i RPMI 1640 kompletteras med 20 mM HEPES (utan FBS) innan densitetsgradienten utförs. - Ta bort TMCs med en steril 1 mL pipett spets och placera i en ny 50 ml injektionsflaska.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 50 ml PBS som innehåller 2 % av fetala bovinserum (FBS) och 2 mM EDTA och centrifugera röret vid 250 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna de återstående trombocyterna.
- Upprepa steg 3.5, men centrifugera röret vid 400 x g i 10 min vid 4 °C.
- Förbered odlingsmedium (R10) genom att komplettera RPMI 1640 med 10% värme inaktiverad FBS, 2 mM L-glutamin och antibiotikalösningen (100 U/mL penicillium och 100 μg/ml streptomycin).
- Resuspend TMCs i 10 ml R10 och räkna cellerna. I genomsnitt ger denna teknik 5 x 108-2 x 109 TMCs per par tonsiller. Cellerna kan nu användas för undersökningar som PBMCs från helblod (t.ex. rening av specifik celltyp, cellkultur, flödescytometri, RT-qPCR, frysning, etc.).
-
Om det behövs, frysa cellerna för vidare användning med hjälp av standardtekniker för primär cellfrysning.
- Räkna antalet celler.
- Centrifugera cellerna och ta bort supernatanten. Lös upp pelleten i tillräckligt med 100% FBS för en slutlig koncentration av 1 x 108 celler/ml, tillsätt sedan samma volym av en 80% FBS + 20% DMSO-lösning. Cellerna kommer då att vara på 5 x 107 celler/ml. Detta steg bör göras vid 4 °C och FBS- och DMSO-lösningen bör hållas vid 4 °C före användning.
- Fördela 1 ml av celllösningen i kryorör och lägg dem i en långsam frysbehållare som har legat vid 4 °C över natten för att kontrollera cellfrysningshastigheten. Placera den vid -80 °C.
- För att tina cellerna, placera cryovials i ett varmt bad vid 37 °C i några sekunder med konstant agitation. Så snart cellerna börjar tina, överför dem till 49 ml R10 och centrifug för att ta bort DMSO. Räkna cellerna och använd dem som PBMCs.
OBS: Även frysning och upptining tmcs kommer att ta bort skräp, kommer det också att skada vissa sällsynta celltyper. Om klumpar eller skräp finns efter upptining, är det bäst att passera cellfjädringen genom en steril sikt på 70 μm innan du använder den.
4. Fenotypning av TMCs av Flow Cytometry
- Hämta 5 x 106 celler från den tidigare lösningen för varje antikroppsblandningspanel som behöver testas och placeras i ett 5 ml cytometrirör. Hämta 1 x 106 celler för den ofläckade kontrollen.
- Tvätta cellerna i PBS och centrifugen vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. Resuspend dem i 500 μL PBS (1 x 106 celler/ml) och inkubera med en livsduglighetsfläck i 30 min vid 4 °C i mörker.
- Tillsätt 5 μl värme inaktiverat humant AB-serum per 100 μl cellfjädring och inkubera i 15 min vid 4 °C i mörker.
- Tvätta cellerna i PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (tvättbuffert) och centrifug vid 400 x g i 5 min vid 4 °C.
- Resuspend TMCs i 500 μL tvättbuffert som innehåller antikropparna enligt tabell 1. Inkubera cellerna i 30 min vid 4 °C i mörker.
- Tvätta cellerna i tvättbuffert och centrifug i 400 x g i 5 min vid 4 °C. Resuspend TMCs i 500 μL PBS som innehåller 0,5% av paraformaldehyd (PFA). Förvaras i mörker vid 4 °C tills förvärv genom flödescytometri.
OBS: PFA är farligt. Använd en kommersiell färdiglösning för att förbereda 0,5 % PFA-lösningen.
| Antikropp | Klon | Fluorokrom | Företag |
| Levande-Död | BV405 (på andra sätt) | ThermoFisher Vetenskapliga | |
| CD3 | SP34-2 | V500 | BD Pharmingen |
| CD8 (PÅ) | SK1 | Amcyan (ort i) | BD Pharmingen |
| CD8 (PÅ) | BW135/80 | VioBlue (på flaska) | Miltenyi Biotec |
| CD4 | RPA-T4 | PE-Cy7 | BD Pharmingen |
| CD45 (på andra sätt) | HI30 (PÅ) | PerCP-cy5.5 | Bd |
| CD19 | HD237 (på andra sätt) | Ecd | Beckman Coulter |
| CD20 | 2H7 (2H7) | Alexa Fluor 700 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 (M5E2) | PE-cy7 | BD Pharmingen |
| CD14 | M5E2 (M5E2) | Apc | BD Pharmingen |
| CD16 | 3G8 (På andra sätt) | APC-H7 | BD Pharmingen |
| CD56 (på andra) | MEM188 | Pe | BD Pharmingen |
| CD123 | 7G3 (på andra sätt) | Pe | BD Pharmingen |
| BDCA-1 | L161 (161) | Stilla blå | BD Pharmingen |
| BDCA-3 | AD5-14H12 | Fitc | Miltenyi Biotec |
| BDCA-4 | AD5-17F6 | Apc | Miltenyi Biotec |
| HLA-DR | G646-6 | PerCP-cy5.5 | BD Pharmingen |
| CD11c (CD11c) | 3.9 | Alexa Fluor 700 | ebiovetenskap |
Tabell 1: Lista över antikroppar för cellkarakterisering efter flödescytometri.
5. Exempel på aktivering av TMCs och mätning av cytokinproduktion
- Späd TMCs i R10 medium för att få en koncentration av 2 x 106 celler/ml.
- Fördela 400 000 TMCs i 200 μL R10 i en 96 väl rund bottenplatta.
- För att aktivera cellerna, tillsätt 5 μg/ml av TLR7/8 agonist resiquimod (R848) över natten.
- Centrifugera plattorna och hämta TMCs supernatant och frysa den för vidare analys. Cytokinproduktionen kommer att bedömas med hjälp av pärlbaserade immunanalyser för att kvantifiera flera lösliga cytokiner samtidigt med hjälp av en flödescytometer enligt tillverkarens protokoll.
- Bedöm cellernas livskraft med hjälp av en självlysande cellens lönsamhetsanalys enligt tillverkarens protokoll. Lägg kortfattat till 60 μL cellens livsduglighetslösning till brunnarna och mät luminescensen inom 10 min (förvärv för 1 s/brunn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi karakteriserade först immunprofilen för celler som finns i kulturen och analyserade mängden TMCs. Vi fenotypade TMCs från tonsiller med flöde cytometri. Som visas i figur 1var alla större immuncelltyper som finns i PBMCs från blod representerade i TMCs från tonsiller. I TMCs var dock frekvensen för alla celltyper, utom B-celler, lägre än i PBMCs.
Figur 1: Fenotypning av TMCs i tonsiller. TMCs från friska givare erhölls efter dissekering av mänskliga tonsillar vävnad och isolering av celler. (A) Celler var färgade och data förvärvades av flöde cytometri. Data representerar ett representativt experiment. (B)Tabellen sammanfattar procentandelen av varje celltyp i levande TMCs i tonsiller från sex olika friska givare och jämför var och en med procentandelen av varje celltyp i PBMCs från blod, enligt definitionen i litteraturen18,19. Data visas som procentandelen levande celler SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi testade sedan de immunologiska svaren från TMCs. Ett sätt att reproducera en cells aktivering mot en patogen är att stimulera de medfödda immunsensorerna från familjen Toll-Like Receptors (TLRs). TLRs finns främst i monocyter/makrofager, alla dendritiska cell (DC) subtyper, plasmacytoid dendritiska celler (pc), och även i B-celler. I det här exemplet studerade vi TLR7 och TLR8, eftersom de är specialiserade på antivirala svar och de flesta fall av halsfluss (dvs. tonsillinfektioner) orsakas av en virusinfektion. Således stimulerades TMCs från tonsiller (diagram i blått) från sju friska givare över natten med TLR7/8 ligand resiquimod (R848). Som i PBMCs (graf i grönt), aktivering genom TLR7/8 signalering utlöste produktion av typ I interferons (IFN) och pro-inflammatoriska cytokiner. Faktum är att cytokinen som producerades mest i TMCs vid aktivering var IFNα, en medlem av typen I IFN-familjen som huvudsakligen är involverad i medfödd immunitet mot virusinfektion och som oftast produceras av datorerna. Alla cytokiner testade, utom IFN2/3 och IL-8, producerades av TMCs, men på lägre nivåer än i PBMCs. Intressant nog var vissa cytokiner (främst IL-8, men även IL-6, IL-10 och TNFα) närvarande i större mängd på basala nivåer. Dessutom jämförde vi cytokinen som produceras av isolerade TMCs eller av tonsillar vävnadsblock beredda som beskrivits tidigare6. Vi mätte alla typer av IFN som produceras i supernatant av båda cellkulturerna med hjälp av STING-37 cellinje reporter analys som beskrivits tidigare17 och visade att vi bara kunde mäta IFN nivåer i isolerade TMCs.
Figur 2: TMCs producerade cytokiner vid stimulering. (A)Renade och isolerade TMCs (blå) och PBMCs (grön) stimulerades över natten med R848 (5 μg/ml). Supernatants hämtades och frystes tills de användes. En pärla-baserade immunoassay utfördes för att kvantifiera flera lösliga cytokiner samtidigt med hjälp av ett flöde cytometer. Diagrammen representerar koncentrationen i piktogram per milliliter för varje uppmätt cytokin. Veckökningarna är kommenterade i rött på diagrammen. Mann-Whitney U-test. b)Renade och isolerade TMCs från tonsiller (blå) och tonsiller vävnad block (orange) stimulerades för 24 h med influensa A-virus (IAV). En STING-37 reporter celllinje analys användes för att mäta IFN produktion i supernatant. Box- och morrhårstromer med median ± minimum till maximum. Mann-Whitney U-test. P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05. NS = icke-stimulerad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Slutligen testade vi livskraften i TMCs. Det finns flera tekniker för att mäta cellens bärkraft. Här använde vi en självlysande cell lönsamhet analys, en enkel och snabb tvåstegsanalys. Som visas i figur 3upptäckte vi tydligt cytotoxicitet som orsakas av förening 1 i TMCs, som inte var giftigt för PBMCs. Således visade TMCs en högre känslighet för det testade läkemedlet.
Figur 3: Förening 1 var giftig för TMCs. Renade och isolerade TMCs och PBMCs var förinkuberade med förening 1 (C1) vid olika koncentrationer för 1 h och stimuleras sedan över natten med R848 (5 μg/mL). Supernatants hämtades, 60 μL cell livsduglighet lösning tillsattes och luminescence mättes. * representerar den statistiska analysen som jämför C1 med NS. Box- och morrhårstromer med median ± minimum till maximum. Kruskal-Wallis testar med Dunns post hoc-korrigering. P < 0.0001, ***P < 0.001, **P < 0.01, *P & 0.05. NS = icke-stimulerad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mänskliga tonsiller representerar en integrativ och fysiologisk ex vivo modell för att studera medfödda immunsvar vid mucosal gränssnittet, eftersom de efterliknar rollen av en sekundär lymfoida organ. Intressant nog är den cellulära sammansättningen av TMCs liknar PBMCs och omfattar alla de stora cellpopulationerna, även om deras andel kan skilja sig från PBMCs från blod (figur 1). Ytterligare populationer kan också hittas, eftersom alla immunsvar initieras i vävnader (slemhinnor eller sekundära lymfoida organ) och inte i blod.
Användningen av mänskliga vävnad explants samt användning av cellkultur eller blodkroppar har alla sina fördelar. Men för studien cytokin sekretion och cell aktivering, vävnad explants var inte den bästa modellen. I själva verket kunde vi inte upptäcka någon IFN produktion i supernatant av vävnad explants (Figur 2B). Vi spekulerar att det är direkt konsumeras av de omgivande cellerna. Å andra sidan kan stimulering av blodkroppar (PBMCs) efterlikna det primära svaret på infektion men inte efterlikna vad som händer i vävnaderna, där de flesta cytokiner produceras och där virus replikera. Därför sätter vi upp ett protokoll för att isolera och rena celler som uppstår ur en sekundär lymfoid vävnad, tonsill. Vi renade TMCs från friska mänskliga tonsiller, vilket gör att vi kan undersöka immuncellaktivering vid stimulering. Emellertid, en av begränsningarna i denna modell är att TMCs inte producerar så många pro-inflammatoriska cytokiner som PBMCs ex vivo på TLR7/8 stimulering, även om nivåerna av IFNα, de viktigaste antivirala cytokin, är liknande i båda kulturerna.
Studien av sammansatt toxicitet på TMCs kontra PBMCs visade att TMCs är mer känsliga för ett giftigt läkemedel (figur 3). Således bör toxiciteten hos nya läkemedel och framtida behandlingar testas i celler från vävnader och inte bara på cellinjer, PBMCs, eller vävnad explants. Därför verkar användningen av TMCs för drogtester vara en framtida tillämpning av den beskrivna metoden.
Tonsiller från vuxna eller barn kan erhållas och bearbetas enligt beskrivningen. Vi rekommenderar dock att få tonsiller från barn av två huvudsakliga skäl: 1) Barnens tonsiller innehåller fler celler än de vuxnas20. I själva verket tonsillar hypertrofi är särskilt vanligt hos barn, eftersom de kämpar mer barndomvirus. Således kan dessa stora tonsiller bli obstruktiv tonsiller och måste tas bort av en partiell tonsillektomi för att undvika komplikationer som sömnapné13; 2) Eftersom vuxnas tonsiller vanligtvis avlägsnas efter flera episoder av öron-näsa-hals (ENT) infektioner, dessa tonsiller är mindre naiva och innehåller färre celler.
Det är viktigt att arbeta på tonsiller så snart som möjligt efter avlägsnande kirurgi, helst <3 h efter insamling. Faktum är att direkt efter avlägsnande och tills dissekering, halsmandlarna från varje sida hålls samman i en 50 ml sterilflaska som innehåller cirka 20 ml PBS, så att de är helt nedsänkt.
Interdonors variabilitet kan utgöra en viktig fråga för reproducerbarhet. I själva verket kan variationen i cellulär sammansättning mellan givare vara betydande. Vårt protokoll, med hjälp av TMCs och inte vävnad explants, begränsar denna variation eftersom cellerna från hela tonsiller blandas innan de pläteras och placeras i kultur, medan vävnad explants ger intradonor variation i cellulär sammansättning eftersom bitarna kommer från olika områden inom samma exemplar. Partiell tonsillektomi kan endast utföras på noninflamed tonsiller, vilket begränsar den inflammatoriska statusvariationen mellan patienter. Vi rekommenderar också att samla tonsiller kirurgiskt bort på olika dagar. Vi har tydligt märkt att inter-kirurg och inter-day variabilities är högre än interdonor variaability (data visas inte).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) för experiment och N.B. stipendium (AAP 2017 166). N.S. bekräftar stöd från ANRS for fellowship (AAP 2016 1), European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), startup funding program "Baustein" vid medicinska fakulteten vid Ulm University (LSBN.0147) och Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (544/1 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin - to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
