Isolering af tonsillar mononukleare celler til at studere Ex Vivo medfødte immunrespons i en human slimhinde lymfoide væv
Summary
I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler fra raske mennesker, der gennemgår delvis kirurgisk tonsillektomi for at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv.
Abstract
Undersøgelse af isolerede celler fra slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) giver mulighed for forståelse af immunceller respons i patologier involverer slimhinde immunitet, fordi de kan modellere vært-patogen interaktioner i vævet. Mens isolerede celler stammer fra væv var den første cellekultur model, deres anvendelse er blevet forsømt, fordi væv kan være svært at opnå. I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler (TPC’ er) fra sunde menneskelige mandler til at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv. Isolering af TPC’ere fra mandlerne er hurtig, fordi mandlerne knap nok har nogen epitel og udbytte op til milliarder af alle større immuncelletyper. Denne metode gør det muligt at påvise cytokinproduktion ved hjælp af flere teknikker, herunder immunassays, qPCR, mikroskopi, flowcytometri osv., svarende til brugen af perifere mononukleare celler (PBMCs) fra blod. Desuden, TPC’ere viser en højere følsomhed over for test af lægemidler end PBMCs, som skal overvejes for fremtidige toksicitet assays. Således ex vivo TMCs kulturer er en nem og tilgængelig slimhindemodel.
Introduction
Undersøgelser af menneskelige organer er begrænset på grund af tilgængelighed samt indlysende etiske årsager. Men de er afgørende for fuldt ud at forstå kompleksiteten af den menneskelige biologi. Kulturer af isolerede celler (primære kulturer eller cellelinjer) er et standardsystem i cellebiologiundersøgelser på grund af deres tilgængelighed. Mens isolerede cellekulturer har tilladt fremragende opdagelser, er brugen af cellelinjer kommet nærmere undersøgt, fordi de ikke fuldt ud efterligner in vivo orgelbiologi. Men kulturen i tre-dimensionelle celler eller væv explants er meget kompleks4,5,6. Faktisk er et stykke væv eller organ meget heterogent, fordi dets cellesammensætning varierer afhængigt af lokaliseringen i vævet. Således, ved hjælp af væv blokke kræver analyse af mange tekniske og biologiske replikater, hvilket fører til behovet for et stort antal donorer eller patienter.
Den slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) er strukturelt ligner lymfeknuder, men har unikke funktioner, fordi deres vigtigste rolle er at regulere slimhinde immunitet7. I modsætning til lymfeknuderne, som normalt er placeret i en vis afstand fra vævene, er MALT generelt placeret umiddelbart under slimhindevævets epitel. Histologisk består de hovedsageligt af høje koncentrationer af B- og T-celler, men også antigenoppræsendende celler som makrofager og dendritiske celler. MALT udgør omkring 50% af lymfoide væv i den menneskelige krop. MALT er opdelt i ni grupper afhængigt af deres placering: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (strubehoved-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organiseret) og D-MALT (diffust). O-MALT består hovedsagelig af mandlerne fra Waldeyers tonsillarrring og er den mest tilgængelige MALT8,9. Tonsiller i oropharynx udgør den største barriere, der beskytter fordøjelsessystemet og luftvejene mod (potentielle) invasive mikroorganismer10. Desuden er mandlerne dækket af en fin stratificeret planocelløs ikke-keratinizing epitel, understøttet af en kapsel bindevæv, der indeholder blodkar, nerver og lymfeknuder, giver nem adgang til immuncellerne11,12. Endvidere, tonsillektomi, den kirurgiske handling at fjerne mandler, er en fælles procedure, der udføres på børn, der har søvn-uorden vejrtrækning, hvilket gør mandler en let tilgængelig væv13 i fysiologiske indstillinger.
Mandler tillader undersøgelse af immuncellerespons i patologier, der involverer slimhindeimmunitet. Faktisk, i hiv-infektion, fordi mandler er sammensat af en høj koncentration af immunceller, de er det vigtigste mål for viral replikation, men også producere en stor mængde cytokiner, der ikke er påvist icirkulationen 14,15. På steady stater, sjældne populationer af medfødte-lignende celler er til stede i forskellige slimhindevæv, herunder mandler, men er hovedsagelig fraværende fra blod.
Således mononukleare celler fra mandler (TMCs) er en mere relevant og kompleks model end PBMCs og kan besvare mere dybtgående spørgsmål. På den anden side kan brugen af vævs explants være kompleks og ikke altid relevant for medfødte immunundersøgelser. Således har vi etableret en model til at studere slimhinde immun aktivering ved hjælp af TMCs16. Her beskriver vi en metode til effektiv isolering af TPC’er fra friske menneskelige mandler. Denne metode gør det muligt at inddrive et stort antal immunceller og samtidig bevare deres integritet for ex vivo undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menneskelige mandler repræsenterer en integrativ og fysiologisk ex vivo model til at studere medfødte immunrespons på slimhinden interface, fordi de efterligner den rolle, som en sekundær lymfoide organ. Det er interessant, den cellulære sammensætning af TPC’er svarer til PBMCs og omfatter alle de store cellepopulationer, selv om deres procentdel kan være forskellig fra PBMCs fra blod (Figur 1). Yderligere populationer kan også findes, da alle immunresponser påbegyndes i væv (slimh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) for eksperimenterne og N.B. stipendium (AAP 2017 166). N.S. anerkender støtte fra ANRS for Fellowship (AAP 2016 1), Den Europæiske Molekylærbiologi Organisation EMBO for Fellowship (LT 834 2017), opstart finansieringsprogrammet “Baustein” af det medicinske fakultet ulm Universitet (LSBN.0147) og Deutsche Forschungsgeinschaft DFG (SM 544/1 1).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
References
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
