Summary

Isolering af tonsillar mononukleare celler til at studere Ex Vivo medfødte immunrespons i en human slimhinde lymfoide væv

Published: June 14, 2020
doi:

Summary

I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler fra raske mennesker, der gennemgår delvis kirurgisk tonsillektomi for at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv.

Abstract

Undersøgelse af isolerede celler fra slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) giver mulighed for forståelse af immunceller respons i patologier involverer slimhinde immunitet, fordi de kan modellere vært-patogen interaktioner i vævet. Mens isolerede celler stammer fra væv var den første cellekultur model, deres anvendelse er blevet forsømt, fordi væv kan være svært at opnå. I denne protokol forklarer vi, hvordan man nemt behandler og kultur tonsillar mononukleare celler (TPC’ er) fra sunde menneskelige mandler til at studere medfødte immunrespons ved aktivering, efterligne virusinfektion i slimhindevæv. Isolering af TPC’ere fra mandlerne er hurtig, fordi mandlerne knap nok har nogen epitel og udbytte op til milliarder af alle større immuncelletyper. Denne metode gør det muligt at påvise cytokinproduktion ved hjælp af flere teknikker, herunder immunassays, qPCR, mikroskopi, flowcytometri osv., svarende til brugen af perifere mononukleare celler (PBMCs) fra blod. Desuden, TPC’ere viser en højere følsomhed over for test af lægemidler end PBMCs, som skal overvejes for fremtidige toksicitet assays. Således ex vivo TMCs kulturer er en nem og tilgængelig slimhindemodel.

Introduction

Undersøgelser af menneskelige organer er begrænset på grund af tilgængelighed samt indlysende etiske årsager. Men de er afgørende for fuldt ud at forstå kompleksiteten af den menneskelige biologi. Kulturer af isolerede celler (primære kulturer eller cellelinjer) er et standardsystem i cellebiologiundersøgelser på grund af deres tilgængelighed. Mens isolerede cellekulturer har tilladt fremragende opdagelser, er brugen af cellelinjer kommet nærmere undersøgt, fordi de ikke fuldt ud efterligner in vivo orgelbiologi. Men kulturen i tre-dimensionelle celler eller væv explants er meget kompleks4,5,6. Faktisk er et stykke væv eller organ meget heterogent, fordi dets cellesammensætning varierer afhængigt af lokaliseringen i vævet. Således, ved hjælp af væv blokke kræver analyse af mange tekniske og biologiske replikater, hvilket fører til behovet for et stort antal donorer eller patienter.

Den slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) er strukturelt ligner lymfeknuder, men har unikke funktioner, fordi deres vigtigste rolle er at regulere slimhinde immunitet7. I modsætning til lymfeknuderne, som normalt er placeret i en vis afstand fra vævene, er MALT generelt placeret umiddelbart under slimhindevævets epitel. Histologisk består de hovedsageligt af høje koncentrationer af B- og T-celler, men også antigenoppræsendende celler som makrofager og dendritiske celler. MALT udgør omkring 50% af lymfoide væv i den menneskelige krop. MALT er opdelt i ni grupper afhængigt af deres placering: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktival), LALT (strubehoved-), SALT (hud-), VALT (vulvo-), O-MALT (organiseret) og D-MALT (diffust). O-MALT består hovedsagelig af mandlerne fra Waldeyers tonsillarrring og er den mest tilgængelige MALT8,9. Tonsiller i oropharynx udgør den største barriere, der beskytter fordøjelsessystemet og luftvejene mod (potentielle) invasive mikroorganismer10. Desuden er mandlerne dækket af en fin stratificeret planocelløs ikke-keratinizing epitel, understøttet af en kapsel bindevæv, der indeholder blodkar, nerver og lymfeknuder, giver nem adgang til immuncellerne11,12. Endvidere, tonsillektomi, den kirurgiske handling at fjerne mandler, er en fælles procedure, der udføres på børn, der har søvn-uorden vejrtrækning, hvilket gør mandler en let tilgængelig væv13 i fysiologiske indstillinger.

Mandler tillader undersøgelse af immuncellerespons i patologier, der involverer slimhindeimmunitet. Faktisk, i hiv-infektion, fordi mandler er sammensat af en høj koncentration af immunceller, de er det vigtigste mål for viral replikation, men også producere en stor mængde cytokiner, der ikke er påvist icirkulationen 14,15. På steady stater, sjældne populationer af medfødte-lignende celler er til stede i forskellige slimhindevæv, herunder mandler, men er hovedsagelig fraværende fra blod.

Således mononukleare celler fra mandler (TMCs) er en mere relevant og kompleks model end PBMCs og kan besvare mere dybtgående spørgsmål. På den anden side kan brugen af vævs explants være kompleks og ikke altid relevant for medfødte immunundersøgelser. Således har vi etableret en model til at studere slimhinde immun aktivering ved hjælp af TMCs16. Her beskriver vi en metode til effektiv isolering af TPC’er fra friske menneskelige mandler. Denne metode gør det muligt at inddrive et stort antal immunceller og samtidig bevare deres integritet for ex vivo undersøgelser.

Protocol

Prøverne indsamles ikke specifikt til forskningsformål, og undersøgelsen betragtes ikke som invasiv. Men indsamling af mandler til mennesker kræver etisk godkendelse fra de lokale relevante myndigheder. I vores tilfælde blev det godkendt af Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Desuden anmodes der om samtykke fra hver patient eller juridisk repræsentant til at indhente donorernes personoplysninger (f.eks. køn, alder, historie af ENT-infektioner), som kan hjælpe med at fortolke eksperi…

Representative Results

Vi først karakteriseret immunprofilen af celler til stede i kulturen og analyseret mængden af TPC’er. Vi fænotypede TPC’erne fra mandler med flowcytometri. Som vist i figur 1var alle større immuncelletyper, der foregav i PBMCs fra blod, repræsenteret i TPC’erne fra mandler. I TPC’er var hyppigheden af alle celletyper, undtagen B-celler, dog lavere end i PC’er. <img alt="Figure 1" class="xfigimg…

Discussion

Menneskelige mandler repræsenterer en integrativ og fysiologisk ex vivo model til at studere medfødte immunrespons på slimhinden interface, fordi de efterligner den rolle, som en sekundær lymfoide organ. Det er interessant, den cellulære sammensætning af TPC’er svarer til PBMCs og omfatter alle de store cellepopulationer, selv om deres procentdel kan være forskellig fra PBMCs fra blod (Figur 1). Yderligere populationer kan også findes, da alle immunresponser påbegyndes i væv (slimh…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) for eksperimenterne og N.B. stipendium (AAP 2017 166). N.S. anerkender støtte fra ANRS for Fellowship (AAP 2016 1), Den Europæiske Molekylærbiologi Organisation EMBO for Fellowship (LT 834 2017), opstart finansieringsprogrammet “Baustein” af det medicinske fakultet ulm Universitet (LSBN.0147) og Deutsche Forschungsgeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Materials

10 meshes steel grid – 1910 µm Dutscher 198586 To put in the cell strainer Cellector
60 meshes steel grid – 230 µm Dutscher 198591 To put in the cell strainer Cellector
70 µm white ClearLine cell strainers Dutscher 141379C
Anios Excell D detergent Dutscher 59852 Detergent
Antibiotic solution, 100x Thermo Fisher 15140122 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media
BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL BD Biosciences 352063 FACS Tubes
Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter Dutscher 198585
CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay Promega G7572 Viability assay
Centrifuge 5810 R Eppendorf
Conical tubes Falcon 50 mL Dutscher 352070
Curved tweezers Dutscher 711200
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537 Without calcium and magnesium
EnVision PerkinElmer Measures the luminescence
Fetal Bovine Serum (FBS) To add to culture media
Fluorescence labeles antibodies See Table 1
Glass Pestle Dutscher 198599
Hepes (1M) Thermo Fisher 15630056 Use at 20 mM
Incubator
LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel BioLegend 740390 Bead-based immunoassay
Lymphoprep StemCell 7801 Density gradient medium
Mr. Frosty container Thermo Fisher 5100-0001 Slow freezing container
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Fisher 28908
Resiquimod (R848) InvivoGen tlrl-r848 TLR7/8 agonist
RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich R8758
SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) Dutscher 330009
Surgical blade sterile N°23 Dutscher 132523
UltraComp eBeads Compensation Beads Thermo Fisher 01-2222-41
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 To make wash buffer in PBS

References

  1. Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
  2. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  3. Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
  4. Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
  5. Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
  6. Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
  7. Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
  8. Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
  9. Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
  10. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
  11. Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
  12. Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
  13. Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
  14. Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
  15. Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
  16. Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
  17. Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
  18. Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
  19. Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
  20. Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).

Play Video

Cite This Article
Smith, N., Bekaddour, N., Leboulanger, N., Richard, Y., Herbeuval, J. Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (160), e60914, doi:10.3791/60914 (2020).

View Video