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Neuroscience

चूहों के मोटर कॉर्टेक्स में लेजर प्रेरित मस्तिष्क चोट

doi: 10.3791/60928 Published: September 26, 2020
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मस्तिष्क की चोट का एक कृंतक मॉडल बनाने की तकनीक दिखाता है। यहां वर्णित विधि लेजर विकिरण का उपयोग करती है और मोटर कॉर्टेक्स को लक्षित करती है।

Abstract

प्रयोगात्मक कृंतक मॉडल में स्ट्रोक को उत्प्रेरण करने के लिए एक आम तकनीक में कैथेटर का उपयोग करके मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के क्षणिक (अक्सर एमसीएओ-टी के रूप में चिह्नित) या स्थायी (एमसीएओ-पी के रूप में नामित) क्षणिक (अक्सर चिह्नित) शामिल है। हालांकि, इसकी आम तौर पर स्वीकार की गई तकनीक की कुछ सीमाएं हैं, जिससे इसका व्यापक उपयोग सीमित हो जाता है। इस विधि द्वारा स्ट्रोक प्रेरण को अक्सर स्थानीयकरण और इस्कीमिक क्षेत्र के आकार, रक्तस्राव की आवधिक घटनाओं और उच्च मृत्यु दर में उच्च परिवर्तनशीलता की विशेषता होती है। इसके अलावा, क्षणिक या स्थायी प्रक्रियाओं में से किसी के सफल समापन के लिए विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है और अक्सर लगभग 30 मिनट तक रहता है। इस प्रोटोकॉल में, एक लेजर विकिरण तकनीक प्रस्तुत की जाती है जो कृंतक मॉडलों में मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करने और अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में काम कर सकती है।

जब नियंत्रण और एमसीएओ समूहों में चूहों की तुलना में, लेजर प्रेरण द्वारा मस्तिष्क की चोट शरीर के तापमान में परिवर्तनशीलता, infarct मात्रा, मस्तिष्क edema, इंट्राक्रैनियल नकसीर, और मृत्यु दर में कम परिवर्तनशीलता दिखाया । इसके अलावा, लेजर-प्रेरित चोट के उपयोग से एमसीएओ प्रयोगों के विपरीत मोटर कॉर्टेक्स में मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान हुआ जहां मोटर कॉर्टेक्स और स्ट्राटाल ऊतकों दोनों का विनाश देखा जाता है।

इस जांच से निष्कर्षों से पता चलता है कि लेजर विकिरण मोटर प्रांतस्था में मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक और प्रभावी तकनीक के रूप में काम कर सकता है । विधि प्रक्रिया को पूरा करने के लिए समय को भी छोटा करती है और विशेषज्ञ संचालकों की आवश्यकता नहीं होती है।

Introduction

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विश्व स्तर पर, स्ट्रोक मौत का दूसरा प्रमुख कारण है और विकलांगता का तीसरा प्रमुख कारण1। स्ट्रोक भी गंभीर विकलांगता की ओर जाता है, अक्सर चिकित्सा कर्मचारियों और रिश्तेदारों से अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है । इसलिए, विकार से जुड़ी जटिलताओं को समझने और अधिक सकारात्मक परिणामों की क्षमता में सुधार करने की आवश्यकता है।

पशु मॉडल का उपयोग रोगों को समझने के लिए प्रारंभिक कदम है। सर्वोत्तम शोध परिणामों को सुनिश्चित करने के लिए, एक विशिष्ट मॉडल में एक सरल तकनीक, सामर्थ्य, उच्च प्रजनन क्षमता और न्यूनतम परिवर्तनशीलता शामिल होगी। इस्कीमिक स्ट्रोक मॉडल में निर्धारकों में मस्तिष्क एडेमा वॉल्यूम, इनफारेक्ट आकार, रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) टूटने की सीमा, और कार्यात्मक हानि आम तौर पर न्यूरोलॉजिकल गंभीरता स्कोर 2 के माध्यम से मूल्यांकन कियाजाताहै।

कृंतक मॉडल में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली स्ट्रोक प्रेरण तकनीक मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) को क्षणिक या स्थायी रूप से 3 में लेजाताहै। यह तकनीक मनुष्यों में लोगों के समान स्ट्रोक मॉडल पैदा करती है: इसमें स्ट्रोक किए गए क्षेत्र के आसपास एक पेनुम्ब्रा होता है, अत्यधिक प्रजनन योग्य होता है, और इस्केमिया अवधि और रिफ्यूजन 4 कोनियंत्रितकरता है। फिर भी, एमसीएओ विधि में कुछ जटिलताएं हैं। इस तकनीक से इप्सिलाटेरल रेटिना में इंट्राक्रैनियल हेमरेज और चोट लगने का खतरा रहता है , जिसमें दृश्य प्रांतस्था और सामान्य हाइपरथर्मिया की शिथिलता होती है जिससे अक्सर अतिरिक्त परिणामहोतेहैं 5,6,7. अन्य सीमाओं में प्रेरित स्ट्रोक में उच्च भिन्नताएं (इस्केमिया के संभावित विस्तार से अनपेक्षित क्षेत्रों में उत्पन्न होती हैं, जैसे बाहरी कैरोटिड धमनी क्षेत्र), एमसीए का अपर्याप्त ऑक्सफ्यूजन, और समय से पहले रिफ़ेजन। इसके अलावा, विभिन्न उपभेदों और आकारों के चूहे विभिन्न इनफारेक्ट वॉल्यूम8प्रदर्शित करते हैं। सभी नुकसान का उल्लेख किया के अलावा, MCAO मॉडल गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों में छोटे अलग स्ट्रोक प्रेरित नहीं कर सकते, क्योंकि यह कैथेटराइजेशन के लिए ंयूनतम पोत आकार की अपनी आवश्यकता के मामले में तकनीकी रूप से सीमित है । यह एक वैकल्पिक मॉडल की आवश्यकता को और अधिक महत्वपूर्ण बनाता है। एक अन्य विधि, फोटोथ्रोम्बोसिस, एमसीएओ प्रक्रियाओं के लिए एक संभावित विकल्प प्रदान करता है, लेकिन दक्षता9पर सुधार नहीं करता है। यह तकनीक प्रकाश के साथ स्ट्रोक को लक्षित करती है और पिछले मॉडलों पर कुछ सुधार प्रदान करती है। हालांकि, फोटोथ्रोम्बोसिस के लिए एक आक्रामक क्रैनियोटॉमी की आवश्यकता होती है जो माध्यमिक कॉम्पिकेशन9से जुड़ी होती है।

उल्लिखित कमियों के आलोक में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल कृंतक में मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करने के लिए एक सक्षम वैकल्पिक लेजर तकनीक प्रदान करता है। लेजर तकनीक की कार्रवाई का तंत्र जीवित ऊतकों पर प्रदान किए गए लेजर के फोटोथर्मल प्रभावों पर आधारित है, जो शरीर के ऊतकों द्वारा प्रकाश बीम के अवशोषण और गर्मी में उनके रूपांतरण की ओर जाता है। लेजर तकनीक का उपयोग करने के फायदे इसकी सुरक्षा और हेरफेर में आसानी है। रक्तस्राव को रोकने के लिए गर्मी का उत्पादन करने की लेजर की क्षमता इसे दवा में बहुत महत्वपूर्ण बनाती है, जबकि किसी दिए गए बैठक बिंदु पर विभिन्न बीम को बढ़ाना करने की क्षमता यह सुनिश्चित करती है कि लेजर लक्ष्य बिंदु10के रास्ते में खड़े स्वस्थ ऊतकों को नष्ट करने से बचें। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल लेजर बीम एक कम तरल माध्यम के माध्यम से पारित कर सकते हैं, जैसे हड्डी, अपनी ऊर्जा उत्सर्जित करने के बिना और/ एक बार जब यह मस्तिष्क के ऊतकों जैसे उच्च तरल माध्यम तक पहुंच जाता है, तो यह लक्षित ऊतकों को नष्ट करने के लिए अपनी ऊर्जा का उपयोग करता है। इसलिए यह तकनीक मस्तिष्क की चोट को केवल मस्तिष्क के उपयुक्त क्षेत्र में ही प्रेरित कर सकती है।

यहां प्रस्तुत तकनीक विकिरण के अपने स्तर को विनियमित करने की क्षमता का एक जबरदस्त राशि दिखाया, मस्तिष्क की चोट के चुने हुए विविधताओं का उत्पादन शुरू से ही इरादा । मूल एमसीएओ के विपरीत जो कॉर्टेक्स और स्ट्राटम दोनों को प्रभावित करता है, लेजर तकनीक मस्तिष्क की चोट के प्रभाव को विनियमित करने में सक्षम थी, केवल इच्छित मोटर कॉर्टेक्स पर चोट को प्रेरित करती थी। इसके साथ ही, लेजर-प्रेरित मस्तिष्क चोट प्रोटोकॉल और चूहों के सेरेब्रल कॉर्टेक्स पर की गई प्रक्रिया के लिए प्रतिनिधि परिणामों का सारांश प्रदान किया जाता है।

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Protocol

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निम्नलिखित प्रक्रिया यूरोपीय समुदाय के प्रायोगिक जानवरों के उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित की गई थी । इन प्रयोगों को नेगेव की बेन-गुरियन यूनिवर्सिटी में एनिमल केयर कमेटी ने भी मंजूरी दी थी ।

1. पशु चयन और तैयारी

  1. इस प्रक्रिया के लिए कोई खुलकर विकृति के साथ 300 से 350 ग्राम वजनी 65 पुरुष स्प्राग-डावले चूहों का चयन करें। छोटे आकार एमसीएओ प्रक्रिया के लिए तकनीकी कठिनाइयों बन गया है ।
  2. पिंजरे के प्रति 3 चूहों को असाइन करें और उन्हें कम से कम 3 दिनों के लिए अनुकूलित करें।

2. एमसीएओ प्रक्रिया

  1. एमसीएओ के लिए 25 चूहों का चयन करें जोप्रक्रिया11 से जुड़े 10-20% मृत्यु दर के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. एक मानक तकनीक का उपयोग कर MCAO प्रदर्शन, जैसा कि पहले विस्तार सेवर्णित 12

3. लेजर प्रेरित मस्तिष्क चोट प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. लेजर समूह के रूप में चिह्नित समूह को 20 चूहों और एक अन्य नियंत्रण समूह (नकली-संचालित) को 20 चूहों को असाइन करें।
  2. निम्नलिखित तरीके से 50जे एक्स 10 अंक पर लेजर विकिरण के लिए लेजर समूह चूहों विषय:
    1. सहज वेंटिलेशन के लिए अनुमति देने वाले ऑक्सीजन में 2% आइसोफ्लुन के मिश्रण के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें। वापसी पलटा की अनुपस्थिति को देखने के लिए संदंश के साथ पूंछ चुटकी द्वारा पर्याप्त संवेदनाहारी गहराई के लिए जांच करें।
    2. गुदा तापमान विनियमित हीटिंग पैड का उपयोग करके प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान चूहे के कोर शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    3. 70% अल्कोहल और 0.5% क्लोरहेक्सीडीन ग्लूकोनेट के साथ शेवर और कीटाणुरहित के साथ स्थानीय बालों को हटा दें। कीटाणुशोधन कदम को दो बार और दोहराएं।
      नोट: सर्जिकल चीरा का आकार लगभग 3 सेमी होना चाहिए। चीरा क्षेत्र के आसपास कम से कम 2 सेमी बाल निकालें।
    4. चूहे को एक प्रवण स्थिति में स्टीरियोटैक्सिक हेड होल्डर पर रखें और सिर को पार्श्व रूप से प्रतिबिंबित करने और ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के बीच के क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए 3 सेमी चीरा लगाएं।
    5. नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें।
    6. सही गोलार्द्ध के ऊपर खोपड़ी के उजागर क्षेत्र में 1 एस पल्स अवधि के साथ 50जे एक्स 10 अंक,प्रशासन करने के लिए नियोडिमियम-वाईजी (एनडी-वाईजी) लेजर (पीक वेवलेंथ 1064 एनएम) का उपयोग करें।
    7. सुनिश्चित करें कि उपकरण का लेजर उत्पादन हिस्सा एक लेजर बीम का उत्पादन करने के लिए उजागर क्षेत्र से 2 मिमी की दूरी पर है। विभिन्न ऊर्जा/सतह संयोजनों के सावधानीपूर्वक मूल्यांकन के बाद 50जे एक्स 10 अंकों का चयन किया गया। यह संयोग कुशल है और इससे दूसरे10से भी कम समय तक प्रशासन के बाद खोपड़ी की हड्डी नष्ट नहीं होती .
      नोट: 2 मिमी लेजर बीम के टर्मिनल के बीच की दूरी है (ऑप्टिकल केबल से यह माध्यम से पारित किया जाता है) और खोपड़ी की हड्डी। यदि एक फोकसिंग लेंस का उपयोग किया जाता है, तो नुकसान के वांछित क्षेत्र में बीम को केंद्रित करने के लिए लेंस के झुकाव के कोण को ध्यान में रखते हुए दूरी की गणना की जानी चाहिए। उचित प्रशिक्षण और आंखों की सुरक्षा सहित लेजर डिवाइस का उपयोग करते समय उचित सुरक्षा सुनिश्चित करें।
    8. डिवाइस से चूहे को निकालें और 3-0 रेशम सर्जिकल टांके के साथ खोपड़ी को बंद करें।
    9. संज्ञाहरण बंद करो और वसूली के लिए अपने पिंजरे में चूहा वापस। सर्जरी के तुरंत बाद पश्चात दर्द को कम करने के लिए स्थानीय रूप से 0.25% bupivacaine के 0.1 एमएल प्रशासन।
      नोट: पूरी प्रक्रिया 5 मिनट से भी कम समय तक अगर सही ढंग से प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  3. संज्ञाहरण वसूली के बाद के दौरान संकट के किसी भी संकेत के लिए चूहे का निरीक्षण करें। संज्ञाहरण से उद्भव से पहले, पश्चात एनाल्जेसिया के लिए 0.01 mg/kg इंट्रामस्कुलर बुप्रेनोरफिन दें और कम से कम 48 घंटे के लिए हर 12 घंटे में बार-बार खुराक जारी रखें।
  4. उन्हें लेजर के अधीन किए बिना एक ही शर्तों के लिए विषय नियंत्रण चूहों।

4. न्यूरोलॉजिकल गंभीरता स्कोर (एनएसएस)

  1. 43-पॉइंट स्कोर13का उपयोग करके लेजर-प्रेरित मस्तिष्क चोट के बाद न्यूरोलॉजिकल गंभीरता स्कोर 24 घंटे का मूल्यांकन करें। न्यूरोलॉजिकल घाटे, व्यवहार में गड़बड़ी, बीम-संतुलन कार्य और सजगता के लिए जानवरों का परीक्षण करें, अधिक गंभीर विकलांग के लिए उच्च स्कोर निर्दिष्ट करें, जैसा कि पहले विस्तृत13है।

5. चोट के बाद जोड़तोड़

  1. एनएसएस मूल्यांकन के बाद, चूहों को 20% ऑक्सीजन और 80% CO2 (प्रेरणा के माध्यम से) को उजागर करके इच्छामृत्यु दें और हेपरिनाइज्ड फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, 0.9% एनएसीएल) के साथ चूहे को पार करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सीओ2 संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार एक पूर्व निर्धारित दर पर दिया जाता है । यह कदम 5% आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत भी किया जा सकता है।
  2. कटनी दिमाग और आगे की परीक्षा के लिए तैयार के रूप में एक पहले प्रोटोकॉल11में वर्णित है ।
  3. खोपड़ी से अलगाव के बाद पूरे मस्तिष्क की दृश्य परीक्षा के माध्यम से सबराचनॉयड हेमरेज (एसएएच) के लिए मूल्यांकन करें। यदि आवश्यक हो, तो इस उद्देश्य के लिए एक माइक्रोस्कोप या आवर्धक चश्मे का उपयोग किया जा सकता है।

6. मस्तिष्क की चोट का मूल्यांकन

  1. टीटीसी धुंधला द्वारा मस्तिष्क इनफाक्ट वॉल्यूम और मस्तिष्क एडिमा का निर्धारण
    नोट: 2,3,5-ट्रिपेनिल्टेट्राजोलियम क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला मस्तिष्क इनफाक्ट डिटेक्शन11के लिए एक सुविधाजनक प्रक्रिया है।
    1. 6 कोरोनल स्लाइस में काटा दिमाग अनुभाग, प्रत्येक 2 मिमी मोटाई ।
    2. 0.05% टीटीसी में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रत्येक मस्तिष्क से स्लाइस के सेट को इनक्यूबेट करें।
    3. धुंधला होने के बाद, 1600 X 1600 डीपीआई के संकल्प के साथ ऑप्टिकल स्कैनर के साथ स्लाइस को स्कैन करें।
    4. मस्तिष्क के निश्चित स्लाइस के अन दागदार क्षेत्रों को12के रूप में परिभाषित किया गया है ।
    5. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (जैसे, फ्रीवेयर इमेज जे)का उपयोग करके 6 कोरोनल स्लाइस में से प्रत्येक के लिए अन दागदार इनफार्टेड क्षेत्र, ipsi-और कॉन्ट्रालेट्रल गोलार्द्धों को मापते हैं।
    6. कुल मस्तिष्क के प्रतिशत के रूप में इन्फेक्टेड वॉल्यूम की गणना करें:
      Equation 1
    7. कयोजना विधि का उपयोग करके मस्तिष्क एडिमा की गणना करें:
      Equation 2
  2. रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) टूटना की सीमा का निर्धारण
    नोट: इस प्रकार लेजर प्रेरित मस्तिष्क चोट के बाद BBB टूटना 24 घंटे का आकलन:
    1. 2% इवांस ब्लू को 4 एमएल/किलो नमकीन समाधान के साथ नसों में कैनुलेटेड पूंछ नस के माध्यम से चूहों को मिश्रित करें और समाधान को 1 घंटे के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें।
    2. पिछले एनएसएस के बाद 20% ऑक्सीजन और 80% सीओ 2 (प्रेरणा के माध्यम से)24 घंटे के लिए उन्हें उजागर करके चूहों को इच्छामृत्यु, जैसा कि पहले13वर्णित है।
    3. इंट्रावैस्कुलरली स्थानीयकृत डाई को इस प्रकार काटा जाए:
      1. सर्जिकल पिनसेट और सर्जिकल कैंची के साथ चूहों के चेस्ट खोलें।
      2. सही एट्रियम से एक रंगहीन पर्फ्यूजन तरल प्राप्त करने तक 110 एमएमएचजी का उपयोग करके बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से ठंडा 0.9% खारा वाले जानवरों को पर्फ्यूज करें।
    4. दिमाग को काटें और उन्हें 2 मिमी स्लाइस में रोस्ट्रोकाउडली रूप से काट लें।
    5. घायल और गैर-घायल गोलार्द्धों का अलग से मूल्यांकन करने के लिए बाएं मस्तिष्क के स्लाइस को दाएं भागों से अलग करें।
    6. मोर्टार और मूसल का उपयोग करके वजन, समरूप, और फिर 24 घंटे के लिए 50% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड में मस्तिष्क के ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
    7. 20 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर समरूप मस्तिष्क स्लाइस अपकेंद्रित्र।
    8. 1:3 पर 96% इथेनॉल के 1.5 मिलील के साथ अपकेंद्रित्र मस्तिष्क से सुपरनेटेंट के 1 मिलीएल मिलाएं और 620 एनएम उत्तेजन तरंग (10 एनएम बैंडविड्थ) और 680 एनएम उत्सर्जन तरंग (10 एनएम बैंडविड्थ) पर फ्लोरेसेंस डिटेक्टर का उपयोग करके रक्त-मस्तिष्क बाधा टूटना का आकलन करें।
      नोट: चूहों के दोनों समूहों BBB टूटने का निर्धारण करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल से गुजरना ।

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Representative Results

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नियंत्रण या प्रायोगिक समूहों(तालिका 1)में कोई मृत्यु या साह पंजीकृत नहीं थे। एमसीएओ समूह में मृत्यु दर और साह दोनों की 20% दर थी ।

दोनों समूहों के चूहों में सापेक्ष शरीर के तापमान में परिवर्तन भी समान थे, दोनों समूहों(तालिका 1)की परिवर्तनशीलता में अंतर के बावजूद।

नकली-संचालित नियंत्रण समूह (1 ± 0.3) की तुलना में लेजर (16 ± 1.1) और एमसीएओ (20 ± 1.5) मॉडल दोनों में काफी बदतर एनएसएस था; तालिका 1; पीएंड एलटी;0.01) ।

लेजर-प्रेरित मस्तिष्क चोट ने भी नकली-संचालित नियंत्रण समूह (2.4% ± 0.3 बनाम 0.5% ± 0.1; तालिका 2 और चित्रा 1A; पीएंडटीटी;0.01), मान-व्हिटनी यू टेस्ट के अनुसार । हालांकि, लेजर मॉडल की इनफाक्ट वॉल्यूम एमसीएओ तकनीक (2.4% ± 0.3 बनाम 9.9% ± 2.9) की तुलना में छोटा था।

मस्तिष्क की चोट के बाद मस्तिष्क एडिमा निर्धारित 24 घंटे चित्रा 1B और तालिका 2में दिखाया गया है । लेजर-प्रेरित मस्तिष्क चोट मॉडल और नकली-संचालित नियंत्रण समूह (3.4% ± 0.6 बनाम 0.7% ± 1.2) के बीच मस्तिष्क एडिमा में कोई अंतर नहीं था। लेजर मॉडल और एमसीएओ तकनीक (3.4 ± 0.6 बनाम 7 ± 2.6†) के बीच मस्तिष्क एडीमा में एक महत्वपूर्ण अंतर था। डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं।

नकली संचालित नियंत्रण समूह की तुलना में, लेजर प्रेरित मस्तिष्क चोट और एमसीएओ तकनीक दोनों गैर घायल गोलार्द्ध में BBB टूटना में एक महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बना (५६३ एनजी/जी ± ६६ और ११७६ एनजी/जी ± १६८, क्रमशः, बनाम १४१ एनजी/जी ± 14; चित्रा 2ए और तालिका 2; पीएंड एलटी;0.01) और लक्ष्य गोलार्द्ध (2204 एनजी/जी ± 280 और 2764 एनजी/जी ± 256, क्रमशः, बनाम 134 एनजी/ चित्रा 2B और तालिका 2; पीएंड एलटी;0.01) ।

चूहों के दिमाग की हिस्टोलॉजिकल जांच चित्र 3में दिखाई गई है ।

एनएसएस तापमान, डिग्री सेल्सियस साह, % मृत्यु दर, %
समूहों मतलब ± SEM परिवर्तनशीलता, % मतलब ± SEM परिवर्तनशीलता, %
शाम संचालित नियंत्रण 1 ± 0.3 97 37.2 ± 0.1 59 0 0
लेजर 50J x10 16 ± 1.1 * 30 37.4 ± 0.1 84 0 0
पी-एमसीएओ 20 ± 1.5 * 37 38.3 ± 0.1 * 129 20* 20*

तालिका 1: एनएसएस, शरीर के तापमान, सबराक्नॉइड हेमरेज और मृत्यु दर का आकलन। * = पी एंड एलटी; 0.01

बीबीबी इनफेक्टेड वॉल्यूम ब्रेन एडिमा
समूहों मतलब ± SEM परिवर्तनशीलता, % मतलब ± SEM परिवर्तनशीलता, % मतलब ± SEM परिवर्तनशीलता, %
शाम संचालित नियंत्रण 134 ± 11 25 0.5 ± 0.1 77 0.7 ± 1.2 573
लेजर 50J x10 2204 ± 280* 40 2.4 ± 0.3 * 34 3.4 ± 0.6 58
पी-एमसीएओ 2764 ± 256* 29 9.9 ± 2.9 * 92 7 ± 2.6* 115

तालिका 2: बीबीबी ब्रेकडाउन, इनफारेक्ट जोन और ब्रेन एडिमा का आकलन। * = पी एंड एलटी; 0.01

Figure 1
चित्रा 1: एमसीएओ मॉडल और नकली संचालित नियंत्रण की तुलना में चोट के बाद लेजर मॉडल 24 घंटे में मस्तिष्क की चोट का आकलन। }Aइनफारेक्ट वॉल्यूम का आकलन। नकली-संचालित नियंत्रण (*पीएंड एलटी;001) की तुलना में लेजर मॉडल में इनफारेक्ट वॉल्यूम में वृद्धि हुई थी। हालांकि, लेजर मॉडल में इनफारेक्ट वॉल्यूम एमसीएओ मॉडल (*पीएंड एलटी;0.01) की तुलना में छोटा था। (ख)कुल मस्तिष्क एडिमा का आकलन । या तो लेजर मॉडल या नकली संचालित नियंत्रण की तुलना में एमसीएओ मॉडल में मस्तिष्क एडिमा में वृद्धि हुई थी। लेजर मॉडल और नकली संचालित नियंत्रण के बीच मस्तिष्क एडिमा में कोई अंतर नहीं था। डेटा को कॉन्ट्रालेट्रल गोलार्द्ध के रूप में मापा जाता है और मतलब ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: नकली नियंत्रण की तुलना में BBB टूटने की हद तक । (A)कॉन्ट्रालेट्रल (गैर-घायल) गोलार्द्ध। लेजर और एमसीएओ दोनों मॉडलों ने नकली-संचालित नियंत्रण समूह (*पीएंडटी;0.01) की तुलना में गैर-घायल गोलार्द्ध में बीबीबी टूटना में उल्लेखनीय वृद्धि की। (ख)इप्सिल्टरल (घायल) गोलार्द्ध । नकली संचालित नियंत्रण (*पीएंड एलटी;0.01) की तुलना में लेजर और एमसीएओ मॉडल में ipsilateral BBB टूटने में अंतर था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: नकली, लेजर और एमसीएओ समूहों से चूहों के दिमाग की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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यह मानना उचित है कि लेजर तकनीक न्यूनतम आक्रामक है, यह देखते हुए कि लेजर समूह में कोई मौत या साह नहीं हुआ। मृत्यु और साह का प्राथमिक कारण रक्त वाहिकाओं को नुकसान होता है जो इंट्राक्रैनियल दबाव (आईसीपी) की ऊंचाई की ओर जाता है, जैसा कि मूल एमसीएओ तकनीकों में दिखाया गया है10। लेजर समूह में मृत्यु और साह की अनुपस्थिति लेजर के विशिष्ट प्रभावों के कारण होने की संभावना है: उनका रक्त वाहिकाओं पर सीधा प्रभाव नहीं पड़ता है और रिसाव के मामले में जमावट को प्रेरित कर सकता है। कम इनफारेक्ट वॉल्यूम और ब्रेन एडिमा भी मौत के खतरे को कम करने में मदद करते हैं। लेजर के उपयोग को न्यूनतम प्रतिकूल परिणामों के साथ मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक के रूप में माना जाना चाहिए, यह देखते हुए कि स्ट्रोक (क्षणिक और स्थायी दोनों) को ट्रिगर करने के लिए मूल एमसीएओ तकनीकों को मौतों और साह6का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है।

लेजर समूह में कम शरीर के तापमान निष्कर्षों से पता चलता है कि लेजर तकनीक हाइपोथैलेमिक धमनी है कि शरीर के तापमान को नियंत्रित करता है, के रूप में मूल एमसीएएओ आम तौर पर7करता है, सिद्धांत है कि लेजर तकनीक अधिक लक्षित है समर्थन नहीं करता है । मापदंडों के बोर्ड में कम परिवर्तनशीलता की जांच की मस्तिष्क की चोट को प्रेरित करने के लिए लेजर के उपयोग में स्थिरता का संकेत दिया है, लेकिन इस तरह के ठीक परिणाम सत्ता की पसंद पर बहुत ज्यादा निर्भर करते हैं । पर्याप्त शक्ति वांछित परिणाम प्रदान करती है, जबकि कम या अधिशेष अंशांकन कम या अधिक प्रदर्शन का कारण बन सकते हैं, जो किसी भी मामले में हानिकारक है। फिर भी, लक्ष्य के लिए लक्ष्य करने की क्षमता अभी भी तकनीक कम जोखिम भरा बनाता है । इसलिए, सही हैंडलिंग लेजर तकनीक का उपयोग करके सटीकता के साथ परिणाम प्राप्त करना आसान बनाती है, साथ ही वांछनीय प्रभावों के लिए विधि को विनियमित करती है।

लेजर तकनीक की सटीकता और प्रभावकारिता स्ट्रेटम को नुकसान पहुंचाए बिना केवल मोटर कॉर्टेक्स को हड़ताल करने की क्षमता में स्पष्ट थी, यह सुझाव देते हुए कि लेजर तकनीक स्थानीयकृत चोट का उत्पादन कर सकती है जिसे एमसीएओ10के साथ प्राप्त करना लगभग असंभव है। लेजर तकनीक के साथ यह प्राप्त परिणाम लेजर बीम और इसकी शक्ति को विनियमित करने की क्षमता के कारण है और लेजर विधि को छोटे, परिधीय, और गहरी और परिभाषित मस्तिष्क चोट उत्प्रेरण के लिए एक मॉडल तकनीक बनाता है जिसे एमसीएओ के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है। एक लेजर मशीन में हेरफेर की सादगी यह बहुत वांछनीय बनाता है। MCAO तकनीकों के विपरीत है कि कठिन प्रशिक्षण और विशेषज्ञों की मांग, पराबैंगनीकिरण का उपयोग कर अधिक सरल है, कोई विशेषज्ञों या महंगी प्रशिक्षण की आवश्यकता है । लेजर तकनीक का उपयोग अनुसंधान को बढ़ावा देने और बेहतर परिणामों को उजागर करने में मदद कर सकता है और अधिक जल्दी से अकेले MCAO विधि से ।

लेजर तकनीक की सीमाओं के संदर्भ में, लेजर बीम का उपयोग मस्तिष्क की चोटों का उत्पादन नहीं करता है जो पूरी तरह से तीव्र संवहनी ऑक्सीक्लुसिव स्ट्रोक के समान हैं। विशेष रूप से, लेजर लक्ष्य स्थल पर तत्काल ऊतक निशान का उत्पादन करते हैं जो कई दिनों पुराने एक संवहनी ऑक्सीक्लुसिव स्ट्रोक के बराबर होते हैं। इसलिए, तकनीक उन दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है जिनका उद्देश्य स्ट्रोक के प्रसार को रोकना है, लेकिन लंबे समय तक मोटर, संज्ञानात्मक और व्यवहार हानि पर अलग मोटर कॉर्टेक्स स्ट्रोक का आकलन करने में आदर्श होना चाहिए। इस शोध के लिए चूहों की एक छोटी संख्या का उपयोग भी एक सीमा थी, जिसमें मस्तिष्क संचयन और स्ट्रोक के आकार की परीक्षा के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक समूह में चूहों (एन = 10) की केवल आधी संख्या, मस्तिष्क एडीमा, बीबीबी टूटना और साह उपस्थिति की सीमा थी।

हमारी तकनीक और अन्य लेजर तरीकों के बीच तुलना की कमी भी एक सीमा समझा जा सकता है। हमने तुलनात्मक तरीकों के प्रदर्शन पर विचार-विमर्श किया लेकिन ऐसा नहीं करने का फैसला किया क्योंकि इन अन्य लेजर तरीकों से होने वाले नुकसान का आकलन करना मुश्किल है । उदाहरण के लिए, फोटोथ्रोम्बोसिस तकनीक6 कमजोर क्षति का कारण बनती है जो मस्तिष्क की सूजन और अन्य स्थितियों का मूल्यांकन करना चुनौतीपूर्ण बनाता है। इसके अलावा, इस्केमिया के लिए लेजर तकनीक में क्रैनियोटॉमी का उपयोग समस्याग्रस्त है क्योंकि क्रैनियोटॉमी बहुत आक्रामक है और बीबीबी की पारगम्यता को बढ़ा सकता है, जिससे अतिरिक्त मस्तिष्क चोट हो सकती है जो स्ट्रोक से जुड़ी नहीं है। हमारी विधि के साथ तुलना के लिए इस तरह के नुकसान का आकलन लगभग असंभव है । लेजर मॉडल क्रैनिओटॉमी के बिना खोपड़ी के माध्यम से विकिरण के साथ स्ट्रोक लाती है।

कई मॉडलों की तरह, लेजर मॉडल के अपने लाभ और सीमाएं हैं, सबसे ज्वलंत दोष के साथ अन्य मॉडलों के रूप में ठीक से पूरी तरह से मानव स्ट्रोक की नकल करने में असमर्थता है। फिर भी, अधिकांश मापदंडों के प्राथमिक परिणामों में कम परिवर्तनशीलता, इसकी सटीकता, सामर्थ्य, छोटे मस्तिष्क चोटों को प्रेरित करने की क्षमता, और इसका सीधा अनुप्रयोग इसे कृंतक में मस्तिष्क की चोट के लिए एक उपयुक्त वैकल्पिक तकनीक बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सोरोका विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र के एनेस्थिसियोलॉजी विभाग और इस प्रयोग के प्रदर्शन में उनकी मदद के लिए नेगेव के बेन-गुरियन विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride SIGMA - ALDRICH 298-96-4
50% trichloroacetic acid SIGMA - ALDRICH 76-03-9
Brain & Tissue Matrices SIGMA - ALDRICH 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P SIGMA - ALDRICH Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances SIGMA - ALDRICH HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale SIGMA - ALDRICH Rs 4,000
Dissecting scissors SIGMA - ALDRICH Z265969
Eppendorf pipette SIGMA - ALDRICH Z683884
Eppendorf Tube SIGMA - ALDRICH EP0030119460
Ethanol 96 % ROMICAL Flammable Liquid
Evans Blue 2% SIGMA - ALDRICH 314-13-6
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff ABN IC-500
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
Multiset TEVA MEDICAL 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F
Petri dishes SIGMA - ALDRICH P5606
Scalpel blades 11 SIGMA - ALDRICH S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder KOPF 900LS
Sterile Syringe 2 ml Braun 4606027V
Syringe-needle 27 G Braun 305620

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References

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चूहों के मोटर कॉर्टेक्स में लेजर प्रेरित मस्तिष्क चोट
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Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).More

Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).

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