Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Farelerin Motor Korteksinde LazerE Bağlı Beyin Hasarı

doi: 10.3791/60928 Published: September 26, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Burada sunulan protokol beyin hasarı bir kemirgen modeli oluşturmak için bir teknik gösterir. Burada açıklanan yöntem lazer ışınlama kullanır ve motor korteks hedefler.

Abstract

Deneysel kemirgen modellerinde inme indükleme için yaygın bir teknik geçici içerir (genellikle MCAO-t olarak gösterilir) veya kalıcı (MCAO-p olarak belirlenmiş) orta serebral arter tıkanıklığı (MCA) bir kateter kullanarak. Ancak bu genel kabul görmüş tekniğin bazı sınırlamaları vardır ve böylece geniş kullanımını sınırlandırmıştır. Bu yöntemle inme indüksiyonu genellikle iskemik alanın lokalizasyonu nda ve boyutunda yüksek değişkenlik, periyodik kanama oluşumları ve yüksek ölüm oranları ile karakterizedir. Ayrıca, geçici veya kalıcı prosedürlerden herhangi birinin başarıyla tamamlanması uzmanlık gerektirir ve genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. Bu protokolde, kemirgen modellerinde beyin hasarının indüklemesi ve incelenmesi için alternatif bir yöntem olarak hizmet edebilen bir lazer ışınlama tekniği sunulmuştur.

Kontrol ve MCAO gruplarında sıçanlar ile karşılaştırıldığında, lazer indüksiyon ile beyin hasarı vücut ısısı, infarkt hacmi, beyin ödemi, intrakraniyal kanama ve mortalite azaltılmış değişkenlik gösterdi. Ayrıca, lazer kaynaklı bir yaralanma kullanımı, hem motor korteks inanın hem de striatal dokuların tahrip edildiği MCAO deneylerinin aksine sadece motor kortekste beyin dokularında hasara yol açtı.

Bu araştırmadan elde edilen bulgular lazer ışınlama motor kortekste beyin hasarı indükleyen alternatif ve etkili bir teknik olarak hizmet olabileceğini düşündürmektedir. Yöntem ayrıca yordamı tamamlamak için süreyi kısaltır ve uzman işleyicileri gerektirmez.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Küresel olarak, inme ölüm ikinci önde gelen nedeni ve sakatlık üçüncü önde gelen nedeni1. İnme de ağır sakatlık yol açar, genellikle tıbbi personel ve akrabalarıekstra bakım gerektiren. Bu nedenle, bozukluk ile ilişkili komplikasyonları anlamak ve daha olumlu sonuçlar için potansiyelini artırmak için bir ihtiyaç vardır.

Hayvan modellerinin kullanımı hastalıkları anlamak için ilk adımdır. En iyi araştırma sonuçlarını sağlamak için, tipik bir model basit bir teknik, karşılanabilirlik, yüksek tekrarlanabilirlik ve minimum değişkenlik içerecektir. İskemik inme modellerinde belirleyiciler beyin ödemi hacmi, infarkt boyutu, kan-beyin bariyeri ölçüde (BBB) arıza, ve fonksiyonel bozukluk genellikle nörolojik şiddetpuanı2 ile değerlendirilir .

Kemirgen modellerinde en yaygın olarak kullanılan inme indüksiyon tekniği orta serebral arteri (MCA) geçici veya kalıcı olarak3. Bu teknik insanlarda olanlara benzer bir inme modeli üretir: bu konturlu alanı çevreleyen bir penumbra vardır, son derece tekrarlanabilir, ve iskemi süresi ve reperfüzyon düzenler4. Bununla birlikte, MCAO yöntemi bazı komplikasyonlar vardır. Teknik intrakranial kanama ve görme korteks ve sık sık ek sonuçlara yol ortak hipertermi bir disfonksiyon ile ipsilateral retina yaralanması eğilimli5,6,7. Diğer sınırlamalar indüklenen inme yüksek varyasyonları dahil (istenmeyen bölgelere iskemi olası uzantısı kaynaklanan, dış karotis arter bölgesi gibi), MCA yetersiz oklüzyon, ve erken reperfüzyon. Ayrıca, farklı suş ve boyutlarda sıçanlar çeşitli enfarktüs hacimleri8sergilerler. Bahsedilen tüm dezavantajlara ek olarak, MCAO modeli derin beyin bölgelerinde küçük izole inmeler neden olamaz, kateterizasyon için minimum damar boyutu gereksinimi açısından teknik olarak sınırlı olduğundan. Bu alternatif bir model için ihtiyaç daha kritik hale getirir. Başka bir yöntem, fototromboz, MCAO prosedürleri için olası bir alternatif sağlar ama verimliliği geliştirmek değildir9. Bu teknik ışıkla inme hedefleyen ve önceki modellerde bazı iyileştirmeler sunuyor. Ancak, fototromboz ikincil kombinasyonları ile ilişkili bir invaziv kraniyotomi gerektirir9.

Özetlenen eksikliklerin ışığında, burada sunulan protokol kemirgenlerde beyin hasarına neden olmak için yetenekli bir alternatif lazer tekniği sağlar. Lazer tekniğinin etki mekanizması, lazerin canlı dokular üzerinde verilen fototermal etkilerine dayanır ve bu da vücut dokuları tarafından ışık ışınlarının emilimine ve ısıya dönüştürülmesine yol açar. Lazer tekniği kullanmanın avantajları güvenliği ve manipülasyon kolaylığıdır. Bir lazerin kanamayı durdurmak için ısı üretme yeteneği tıpta çok önemli hale getirirken, belirli bir buluşma noktasında farklı ışınları yükseltebilme yeteneği lazerlerin hedef nokta10'unönünde duran sağlıklı dokuları yok etmekten kaçınmasını sağlar. Bu protokolde kullanılan lazer ışını, kemik gibi düşük sıvı bir ortamdan, enerjisini yaymadan ve/veya herhangi bir tahribata neden olmadan geçebilir. Beyin dokuları gibi yüksek sıvı bir ortama ulaştığında, enerjisini hedef dokuları yok etmek için kullanır. Teknik, bu nedenle, beynin uygun alanda sadece beyin hasarı neden olabilir.

Burada sunulan teknik, ışınlama düzeylerini düzenleme yeteneğinin muazzam bir miktar gösterdi, başından itibaren amaçlanan beyin hasarı seçilen varyasyonları üreten. Hem korteks hem de striatumu etkileyen orijinal MCAO'nun aksine, lazer tekniği beyin hasarının etkisini düzenlemeyi başardı ve sadece amaçlanan motor korteksüzerinde yaralanmaya neden oldu. Burada, lazer kaynaklı beyin hasarı protokolü ve sıçanların serebral korteks üzerinde yapılan işlem için temsili sonuçların bir özeti sağlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşağıdaki prosedür Avrupa Topluluğu'nun Deneysel Hayvanların Kullanımı Yönergeleri'ne göre yürütülmüştür. Deneyler, Negev'deki Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından da onaylandı.

1. Hayvan seçimi ve hazırlanması

  1. Bu işlem için hiçbir overt patoloji ile 300 ila 350 g ağırlığında 65 erkek Sprague-Dawley sıçan seçin. Küçük boyutu MCAO prosedürü için teknik zorluklar teşkil.
  2. Kafes başına 3 sıçan atayın ve en az 3 gün uyum sağlar.

2. MCAO prosedürü

  1. MCAO için 25 sıçan seçin ve prosedür11ile ilişkili %10-20 mortaliteye izin verin.
  2. McAO'yı standart bir teknik kullanarak gerçekleştirin, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi12.

3. Lazer kaynaklı beyin hasarı deneysel prosedür

  1. Lazer grubu olarak işaretlenmiş bir gruba 20, başka bir kontrol grubuna (sahte işletilen) 20 fare atayın.
  2. Lazer grubu sıçanları 50J X 10 noktada lazer ışınlama ile aşağıdaki şekilde takın:
    1. Spontan havalandırma için izin oksijen% 2 izofluran karışımı ile anestezi sıçan. Çekilme refleksinin yokluğunu görmek için kuyruğu forsepslerle sıkıştırarak yeterli anestezi derinliği olup olmadığını kontrol edin.
    2. Rektal sıcaklık teredirısıtma yastığı kullanarak deneysel prosedür boyunca farenin temel vücut sıcaklığını 37 °C'de koruyun.
    3. Bir tıraş makinesi ile yerel saç çıkarın ve% 70 alkol ve% 0.5 klorheksidin glukonat ile dezenfekte. Dezenfeksiyon adımını iki kez daha tekrarlayın.
      NOT: Cerrahi kesi büyüklüğü yaklaşık 3 cm olmalıdır. Kesi bölgesi etrafında en az 2 cm saç çıkarın.
    4. Sıçanı stereotaksik bir baş tutucuya yatkın bir pozisyonda yerleştirin ve kafa derisini yanal olarak yansıtmak ve Bregma ile Lambda arasındaki alanı ortaya çıkarmak için 3 cm'lik bir kesi yapın.
    5. Burun konisi ile anestezi yi koruyun.
    6. 50J X 10 noktalarıyönetmek için Neodimyum-YAG (Nd-YAG) lazer (Nd-YAG) lazer (pik dalga boyu 1064 nm) kullanın, 1 s darbe süresi ile, sağ yarımküreüzerinde kafatasının maruz kalan alana.
    7. Lazer ışını üretmek için cihazın lazer üreten kısmının maruz kalan bölgeden 2 mm uzaklıkta olduğundan emin olun. Farklı enerji/yüzey kombinasyonlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi nden sonra 50J X 10 puan seçilmiştir. Bu kombinasyon verimlidir ve ikincibir 10'dandaha az bir süre için uygulamadan sonra kafatasıkemik yıkımına neden olmaz.
      NOT: 2 mm lazer ışınının terminali (geçtiği optik kablodan) ile kafatası kemiği arasındaki mesafedir. Bir odaklama lens kullanılması durumunda, mesafe, merceğin istenilen hasar alanına odaklama eğim açısı dikkate alınarak hesaplanmalıdır. Uygun eğitim ve göz koruması da dahil olmak üzere bir lazer cihazı kullanırken uygun güvenliği sağlayın.
    8. Cihazdan sıçan çıkarın ve 3-0 ipek cerrahi dikiş ile kafa derisi kapatın.
    9. Anesteziyi durdurun ve tedavi için fareyi kafesine geri getirin. Ameliyat sonrası ağrıyı hemen azaltmak için lokal olarak 0.1 mL 0.1 mL bupivacaine uygulayın.
      NOT: Doğru yapılırsa işlemin tamamı 5 dakikadan az sürmelidir.
  3. Anestezi sonrası iyileşme sırasında herhangi bir sıkıntı belirtisi için sıçanı gözlemleyin. Anesteziortaya çıkmadan önce, postoperatif analjezi için 0.01mg/kg intramüsküler buprenorfin verin ve en az 48 saat boyunca her 12 saatte bir tekrarlanan dozlarla devam edin.
  4. Lazere maruz kalmadan kontrol fareleri aynı koşullara tabi türün.

4. Nörolojik şiddet skoru (NSS)

  1. Lazer kaynaklı beyin hasarından sonra nörolojik şiddet skoru 24 saat 43 puan13kullanarak değerlendirin. Daha önce ayrıntılıolarak 13,nörolojik açıkları, davranış bozuklukları, ışın dengeleme görevi ve refleksleri için hayvanlar test edin.

5. Yaralanma sonrası manipülasyonlar

  1. NSS değerlendirmesinden sonra sıçanları %20 oksijen ve %80 CO2'ye (ilham yoluyla) maruz bırakarak ötenazi sağlar ve sıçanı heparinize fosfat tamponlu salin (PBS, %0.9 NaCl) ile transkarnial olarak perfekte eder.
    NOT: CO2'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine uygun olarak önceden belirlenmiş bir oranda teslim edilmesini sağlamak. Bu adım %5 isofluran anestezi altında da yapılabilir.
  2. Hasat beyinleri ve daha önceki bir protokol11açıklandığı gibi ileri inceleme için hazırlamak .
  3. Subaraknoid kanama (SAH) kafatasından izolasyon sonra tüm beynin görsel inceleme ile değerlendirin. Gerekirse bu amaçla mikroskop veya büyüteç kullanılabilir.

6. Beyin hasarının değerlendirilmesi

  1. TTC boyama ile beyin enfarkt hacmi nin ve beyin ödeminin belirlenmesi
    NOT: 2,3,5-Triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama beyin enfarktüs algılama için uygun bir işlemdir11.
    1. Her biri 2 mm kalınlığında 6 koronal dilime bürünen beyinleri kesin.
    2. Her beyinden 30 dk 37 °C'de %0,05 TTC'de dilim ler yerleştirin.
    3. Boyama sonrasında, 1600 X 1600 dpiçözünürlüğe sahip bir optik tarayıcı ile dilimleri tarayın.
    4. Sabit beyin dilimlerinin lekesiz alanları enfarktlı12olarak tanımlanır.
    5. Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak (örneğin, freeware Image J)6 koronal dilimin her biri için lekesiz enfarktüs alanı, ipsi- ve kontralateral hemisferleri ölçer.
    6. Toplam beynin yüzdesi olarak enfarkt edilen hacmi hesaplayın:
      Equation 1
    7. Kaplan yöntemi ile beyin ödemi hesaplamak:
      Equation 2
  2. Kan beyin bariyerinin (BBB) kırılma sının boyutunun belirlenmesi
    NOT: Lazer kaynaklı beyin hasarından sonra BBB kırılmasını 24 saat olarak değerlendirin:
    1. %2 Evans Blue ile birlikte 4 mL/kg tuzlu çözeltiyi intravenöz olarak farelere kanüle edilmiş kuyruk damarı ile uygulayın ve çözeltinin 1 saat boyunca dolaşmasını bekleyin.
    2. Daha önce13açıklandığı gibi, son NSS 24 saat sonra% 20 oksijen ve% 80 CO2 (ilham yoluyla) onları maruz bırakarak sıçanlar ötanazi .
    3. İntravasküler lokalize boyayı aşağıdaki gibi hasat edin:
      1. Cerrahi pincettes ve cerrahi makas ile sıçanların göğüslerini açın.
      2. Sağ atriyumdan renksiz perfüzyon sıvısı elde edene kadar 110 mmHg kullanarak sol ventrikül ile soğutulmuş % 0.9 tuzlu hayvanlarperfit.
    4. Hasat beyinve 2 mm dilimler halinde rostrocaudally dilimleyin.
    5. Yaralı ve yaralanmamış hemisferleri ayrı ayrı değerlendirmek için sol beyin dilimlerini sağ kısımlardan ayırın.
    6. Tartın, harç ve havaneli kullanarak homojenize, ve sonra 24 saat için% 50 trikloroasetik asit beyin dokuları kuluçka.
    7. 20 dakika için 10.000 × g homojenize beyin dilimleri santrifüj.
    8. 1:3'te 1.5 mL etanol ile santrifüjlü beyinden süpernatantın 1 mL'sini karıştırın ve 620 nm uyarma dalga boyunda (10 nm bant genişliği) ve 680 nm emisyon dalga boyunda (10 nm bant genişliği) bir floresan dedektörü kullanarak kan-beyin bariyerinin kırılmasını değerlendirin.
      NOT: Her iki sıçan grubu da BBB arızasını belirlemek için aynı protokolden geçer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kontrol veya deney gruplarında ölüm veya SAH kaydı bulunmamaktadır(Tablo 1). MCAO grubunda hem mortalite hem de SAH oranı %20 idi.

Her iki grubun sıçanlarında göreceli vücut ısısı değişiklikleri de benzerdi, her iki grubun değişkenlik farkı rağmen(Tablo 1).

Hem lazer (16 ± 1.1) hem de MCAO (20 ± 1.5) modellerinde, sham-operated kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha kötü NSS vardı (1 ± 0.3; Tablo 1; p<0.01).

Lazere bağlı beyin hasarı da hedef yarımkürede enfarktüs hacminde önemli bir artışa neden olmuş, şam tarafından işletilen kontrol grubuna göre (2.4% ± 0.3 vs 0.5% 0.1; Tablo 2 ve Şekil 1A; p<0.01), Mann-Whitney U testine göre. Ancak lazer modelinin enfarktüs hacmi MCAO tekniğine göre daha küçüktü (%2.4 ± 0.3 vs % 9.9 ± 2.9).

Beyin hasarı sonrası 24 saat saptanan beyin ödemi Şekil 1B ve Tablo 2'degösterilmiştir. Lazerkaynaklı beyin hasarı modeli ile sahte ameliyatlı kontrol grubu arasında beyin ödemi arasında fark yoktu (%3.4 ± 0.6 vs %0.7 ± 1.2). Lazer modeli ile MCAO tekniği arasında beyin ödeminde anlamlı fark vardı (3.4 ± 0.6 vs 7 ± 2.6†). Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur.

Şam tarafından işletilen kontrol grubuile karşılaştırıldığında, lazerkaynaklı beyin hasarı ve MCAO tekniği, yaralanmamış hemisferde BBB kırılmasında önemli bir artışa neden oldu (sırasıyla 563 ng/g ± 66 ve 1176 ng/g ± 168, vs 141 ng/g ± 14; Şekil 2A ve Tablo 2; p<0.01) ve hedef hemisfer (2204 ng/g ± 280 ve 2764 ng/g ± 256, vs 134 ng/g ± 11; Şekil 2B ve Tablo 2; p<0.01).

Sıçan beyinlerinin histolojik incelemesi Şekil 3'tegösterilmiştir.

Nss Sıcaklık, °C SAH, % Mortalite, %
Grup ortalama ± SEM değişkenlik, % ortalama ± SEM değişkenlik, %
Sham ile çalışan kontrol 1 ± 0,3 97 37.2 ± 0.1 59 0 0
Lazer 50J x10 16 ± 1.1* 30 37.4 ± 0.1 84 0 0
p-MCAO 20 ± 1,5* 37 38.3 ± 0.1* 129 20* 20*

Tablo 1: NSS, vücut ısısı, subaraknoid kanama ve mortalite nin değerlendirilmesi. * = p < 0.01

Bbb Enfarktt lı Hacim Beyin Ödemi
Grup ortalama ± SEM değişkenlik, % ortalama ± SEM değişkenlik, % ortalama ± SEM değişkenlik, %
Sham ile çalışan kontrol 134 ± 11 25 0,5 ± 0,1 77 0.7 ± 1.2 573
Lazer 50J x10 2204 ± 280* 40 2.4 ± 0.3* 34 3.4 ± 0.6 58
p-MCAO 2764 ± 256* 29 9.9 ± 2.9* 92 7 ± 2.6* 115

Tablo 2: BBB disması, enfarktüs zonu ve beyin ödeminin değerlendirilmesi. * = p < 0,01

Figure 1
Şekil 1: McAO modeli ve sham-operated kontrolü ile karşılaştırıldığında yaralanma dan sonra 24 saat lazer modelinde beyin hasarının değerlendirilmesi. (A) Enfarkt hacminin değerlendirilmesi. Lazer modelinde enfarktüs hacminde, sahte işletilen kontrole (*p<0.01) göre artış oldu. Ancak lazer modelindeki enfarktüs hacmi MCAO modeline göre daha küçüktü (*p<0.01). (B) Total beyin ödeminin değerlendirilmesi. MCAO modelinde beyin ödeminde lazer modeli ne de sahte kontrol ile karşılaştırıldığında bir artış vardı. Beyin ödeminde lazer modeli ile sahte ameliyatlı kontrol arasında fark yoktu. Veriler kontralateral yarımküreye % olarak ölçülür ve ortalama ± SEM olarak ifade edilir.

Figure 2
Şekil 2: BBB arıza sının kapsamı sahte kontrollere göre dir. (A) Kontralateral (yaralanmamış) yarımküre. Hem lazer hem de MCAO modelleri, şam-işletilen kontrol grubuna (*p<0.01) göre yaralanmamış hemisferde BBB kırılmasında önemli bir artışa yol açmıştır. (B) Ipsilateral (yaralı) hemisfer. Lazer ve MCAO modellerinde ipsilateral BBB arızası, sham ile çalışan kontrole göre farklılık (*p<0.01) idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sıçanların beyinlerinin sahte, lazer ve MCAO gruplarından histolojik incelemesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lazer grubunda ölüm veya SAH olmadığı göz önüne alındığında, lazer tekniğinin minimal invaziv olduğunu varsaymak yanlış olmaz. Ölüm ve SAH birincil nedeni intrakranial basınç (ICP) bir yükseklik yol açan kan damarlarının hasarı, orijinal MCAO teknikleri gösterildiği gibi10. Lazer grubunda ölüm ve SAH yokluğu lazerlerin özel etkileri nedeniyle muhtemeldir: onlar kan damarları üzerinde doğrudan etkisi yoktur ve sızıntı durumunda pıhtılaşma neden olabilir. Düşük enfarkt hacmi ve beyin ödemi de ölüm riskini en aza indirmeye yardımcı olur. Lazerkullanımı en az yan sonuçlar ile beyin hasarı indüklemek için uygun bir teknik olarak düşünülmelidir, inme tetiklemek için orijinal MCAO teknikleri göz önüne alındığında (hem geçici hem de kalıcı) ölüm ve SAH üretmek için gösterilmiştir6.

Lazer grubunda düşük vücut ısısı bulguları lazer tekniği vücut ısısını düzenleyen hipotalamik arter okkapalı olmadığını göstermektedir, orijinal MCAO genellikle yaptığı gibi7, lazer tekniği daha hedefli olduğu teorisini destekleyen. Parametrelerin kurulu genelinde düşük değişkenlik beyin hasarı neden lazerlerin kullanımında tutarlılık gösterdi araştırılmış, ancak bu tür ince sonuçlar çok güç seçimine bağlıdır. Yeterli güç istenilen sonuçları sağlarken, çok az veya fazla kalibrasyonlar düşük veya aşırı performansa neden olabilir ve bu da her iki durumda da zararlıdır. Yine de, hedefe nişan yeteneği hala tekniği daha az riskli hale getirir. Bu nedenle, doğru kullanım lazer tekniği ni kullanarak kesin olarak sonuç elde etmeyi ve istenen etkiler için yöntemi düzenlemeyi kolaylaştırır.

Lazer tekniğinin hassaslığı ve etkinliği striatum zarar vermeden sadece motor korteks grev yeteneği nde belirgindi, lazer tekniği MCAO ile elde etmek neredeyse imkansız lokalize yaralanma üretebilir düşündüren10. Lazer tekniği ile elde edilebilir bu sonuç lazer ışını ve gücünü düzenleyen yeteneği nedeniyle ve lazer yöntemi mcao ile elde edilemez küçük, periferik ve derin ve tanımlanmış beyin hasarı indüklemek için bir model tekniği yapar. Bir lazer makinesi manipüle basitlik çok arzu yapar. Zorlu eğitim ve uzmanlar gerektiren MCAO tekniklerinin aksine, lazer kullanmak daha basittir, hiçbir uzman veya pahalı eğitim gerektirir. Lazer tekniğinin kullanımı araştırmayı artırabilir ve sadece MCAO yönteminden daha hızlı bir şekilde daha iyi sonuçlar ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir.

Lazer tekniğinin sınırlamaları açısından, lazer ışınlarının kullanımı mükemmel akut vasküler oklüzif inme benzer beyin yaralanmaları üretmez. Özellikle, lazerler birkaç gün eski bir vasküler oklüzif inme karşılaştırılabilir hedef sitede acil doku izleri üretmek. Bu nedenle teknik, inmenin yayılmasını önlemeyi amaçlayan ilaçların değerlendirilmesi için uygun olmayabilir, ancak uzun süreli motor, bilişsel ve davranışsal bozukluklarda izole motor korteks inme lerinin değerlendirilmesinde ideal olmalıdır. Bu araştırma için sıçan az sayıda kullanımı da bir sınırlama oldu, beyin hasat ve inme boyutunun incelenmesi için kullanılan her grupta sıçan sayısının sadece yarısı (n = 10), beyin ödemi ölçüde, BBB kırılması, ve SAH varlığı.

Tekniğimiz ve diğer lazer yöntemleri arasında karşılaştırma olmaması da bir sınırlama olarak kabul edilebilir. Karşılaştırmalı yöntemler gerçekleştirmeyi değerlendirdik ama yapmamaya karar verdik çünkü bu diğer lazer yöntemlerinin neden olduğu hasarı değerlendirmek zordur. Örneğin, fototromboz tekniği6 beyin şişmesi ve oluşabilir diğer koşulları değerlendirmek için zor kılan zayıf hasara neden olur. Ayrıca, iskemi için lazer tekniğinde kraniyotomi kullanımı çok invaziv ve BBB geçirgenliğini artırabilir, inme ile ilişkili değildir ek beyin hasarına neden olduğu için sorunludur. Bu tür hasarları yöntemimizle karşılaştırmak için değerlendirmek neredeyse imkansızdır. Lazer modeli kraniyotomi olmadan kafatası yoluyla radyasyon ile inme inme neden olur.

Birçok model gibi, lazer modeli faydaları ve sınırlamaları vardır, en göz kamaştırıcı dezavantajı ile diğer modeller gibi tam olarak mükemmel insan inme taklit etmek için yetersizlik. Bununla birlikte, çoğu parametrenin birincil sonuçlarıdüşük değişkenlik, onun hassasiyet, uygun fiyat, yeteneği küçük beyin yaralanmaları neden, ve basit uygulama kemirgenlerde beyin hasarı için uygun bir alternatif teknik yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Soroka Üniversitesi Tıp Merkezi Anesteziyoloji Bölümü'ne ve Negev Ben-Gurion Üniversitesi laboratuvar personeline bu deneyin performansına yardımcı olan yardımcılarından dolayı teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride SIGMA - ALDRICH 298-96-4
50% trichloroacetic acid SIGMA - ALDRICH 76-03-9
Brain & Tissue Matrices SIGMA - ALDRICH 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P SIGMA - ALDRICH Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances SIGMA - ALDRICH HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale SIGMA - ALDRICH Rs 4,000
Dissecting scissors SIGMA - ALDRICH Z265969
Eppendorf pipette SIGMA - ALDRICH Z683884
Eppendorf Tube SIGMA - ALDRICH EP0030119460
Ethanol 96 % ROMICAL Flammable Liquid
Evans Blue 2% SIGMA - ALDRICH 314-13-6
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff ABN IC-500
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
Multiset TEVA MEDICAL 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F
Petri dishes SIGMA - ALDRICH P5606
Scalpel blades 11 SIGMA - ALDRICH S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder KOPF 900LS
Sterile Syringe 2 ml Braun 4606027V
Syringe-needle 27 G Braun 305620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, Geneva. (2014).
  2. Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
  3. Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  6. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  7. Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
  9. Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
  10. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
  11. Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
  12. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
  13. Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).
Farelerin Motor Korteksinde LazerE Bağlı Beyin Hasarı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).More

Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter