Summary

Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

Published: April 08, 2020
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Summary

All’interfaccia di solventi organici e acquosi, proteine arofhiliche elastine su misura si assemblano in complesse strutture supramolecolari come vescicoli, fibre e coacervate innescate da parametri ambientali. I protocolli di assemblaggio descritti producono compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) con proprietà regolabili, consentendo l’incapsulamento di vari carichi.

Abstract

Gli elementi costituti recanti in modo proteico su misura sono candidati versatili per l’assemblaggio di strutture sopramolecolari come cellule minime, veicoli per la consegna di farmaci e scaffold enzimatici. A causa della loro biocompatibilità e sintonabilità a livello genetico, le proteine simili a Elastin (ELP) sono elementi costitutivi ideali per applicazioni biotecnologiche e biomediche. Tuttavia, l’assemblaggio di strutture sopramolecolari basate su proteine con proprietà fisiochimiche distinte e un buon potenziale di incapsulamento rimane impegnativo.

Qui forniamo due protocolli efficienti per l’autoassemblaggio guidato di ELP anfifile in architetture proteiche supramolecolari come coacervates sferiche, fibre e vescicole stabili. I protocolli di assemblaggio presentati generano compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) basati su ELP con proprietà fisico adattabili. I PMBC dimostrano il comportamento della separazione di fase e rivelano la fusione della membrana dipendente dal metodo e sono in grado di incapsulare molecole di carico fluorescenti chimicamente diverse. I PNG risultanti hanno un alto potenziale applicativo come piattaforma di formulazione e somministrazione di farmaci, cellule artificiali e spazio di reazione compartimentato.

Introduction

L’assemblaggio di strutture sovramolecolari per applicazioni biotecnologiche sta diventando sempre più importante1,2,3,4,5. Per l’assemblaggio di architetture funzionali come coacervate, vescicoli e fibre con proprietà fisico desiderate è importante comprendere e controllare le proprietà fisicochimiche e conformazionali dei componenti. A causa della precisione molecolare delle molecole presenti in natura, i mattoni per le strutture sopramolecolari sono sempre più basati su lipidi, acidi nucleici o proteine. Rispetto ai polimeri sintetici, gli elementi costitutivi proteici consentono un controllo preciso sulle strutture sopramolecolari emergenti6 a livello genetico. La sequenza primaria di amminoacidi (aa) dei singoli blocchi di costruzione proteica codifica intrinsecamente le informazioni per il loro potenziale di assemblaggio dalla molecola fino al livello macroscopico, nonché la forma tridimensionale e le proprietà fisiche della struttura sopramolecolare finale7.

I metodi segnalati per l’assemblaggio di diverse strutture sopramolecolari spesso coinvolgono proteine anfifile come le proteine di elastina sensibili alla temperatura (ELP)5,8,9, oleosina ricombinante10e proteine artificiali anfifili11. I metodi innescati dalla temperatura hanno portato all’assemblaggio di micelle4,10,12Fibre13Fogli14e vesciche9,15,16. Sono stati applicati metodi che coinvolgono solventi organici per la formazione di vesciche dinamiche a base di proteine8,11,14. Finora, i protocolli applicati per la formazione delle vesciche spesso non hanno il controllo dell’assemblaggio su assiemi di dimensioni micrometriche16,17o hanno un rendimento di assemblaggio limitato5. Inoltre, alcune vesciche a base di ELP segnalate hanno compromesso il potenziale di incapsulamento12stabilità limitata nel tempo9. Affrontando questi inconvenienti, i protocolli presentati consentono l’autoassemblaggio di strutture sovramolecolari di dimensioni micrometriche e sub micrometriche con proprietà fisiologiche distinte, buon potenziale di incapsulamento e stabilità a lungo termine. Gli ELP anfifile su misura si assemblano in strutture supramolecolari, spaziando dalla gamma di coacervates sferiche e fasci di fibre contorte altamente ordinati alle vescicole unilamellar a seconda del protocollo applicato e delle condizioni ambientali associate. Grandi compartimenti vescicolari a base di membrana (PMBC) rivelano tutti i principali fenotipi come la fusione della membrana e il comportamento di separazione di fase analogo ai liposomi. I PMCC incapsulano in modo efficiente molecole di carico fluorescenti chimicamente diverse che possono essere monitorate utilizzando una semplice microscopia a epifluorescenza. I domini ELP ripetitivi utilizzati in questo studio sono interessanti elementi costitutivi per architetture sovramolecolari basate su proteine18. L’unità di ripetizione pentapeptide ELP (VPGVG) è nota per tollerare diverse aa oltre alla prolina alla quarta posizione (valine, V), pur conservando le sue proprietà strutturali e funzionali19. Il design di ELP anfifili contenenti domini idrofili e idrofobici distintivi è stato realizzato inserendo residui di aa guest (X) nella ripetizione VPGXG con distinta idifobicità, polarità e carica20. I domini anfifili di ELP in cui sono dotati di fenilalanina idrofobica (F) o isoleuina (I) mentre il dominio idrofilo conteneva acido glutamico caricato (E) o arginina (R) come residui ospiti. Un elenco di costrutti ELP anfilici idonei e sequenze aa corrispondenti può essere trovato nelle informazioni supplementari e nei riferimenti8,21. Tutti i mattoni dove dotati di piccoli coloranti fluorescenti o proteine fluorescenti per la visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza. mEGFP e altre proteine fluorescenti sono state fuse N-terminalemente ai domini idrofili degli anfifili ELP . I coloranti organici sono stati coniugati attraverso ceppo privo di rame promosso cicloaddition alkyne-azide (SPAAC) a un aminoacido innaturale introdotto in modo co-traduzionale (UAA). L’incorporazione co-traduzionale dell’UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22permette la modifica n-terminale del dominio eLP idrofilo. In questo modo il coloranti verde fluorescente BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) o qualsiasi piccola molecola fluorescente con un ciclooctyne teso può essere utilizzato come sonda fluorescente. L’incorporazione di successo dell’UAA pAzF e la cicloaddition del colorante tramite SPAAC possono essere facilmente confermate tramite LC-MS/MS a causa di un’efficiente ionizzazione dei corrispondenti peptidi triptici8. Questo piccolo tincolo organico è stato applicato per ampliare la scelta del solvente per i protocolli di assemblaggio, poiché le proteine fluorescenti sono incompatibili con la maggior parte dei solventi organici. I due protocolli di assemblaggio più efficienti per le strutture sopramolecolari sviluppati nel nostro laboratorio sono descritti di seguito. Il metodo di gonfiore THF è compatibile solo con il tinri organico modificato ELP anfilico. Al contrario, il metodo di estrusione 1-butanol (BuOH) è compatibile con molte proteine come sonda fluorescente ad esempio mEGFP, poiché il metodo descritto conserva completamente la fluorescenza di queste proteine di fusione. Inoltre, l’incapsulamento di piccole molecole e il comportamento di fusione vescicolare funzionano meglio impiegando il metodo di estrusione BuOH.

Protocol

1. Progettazione e clonazione di proteine anficani che assomigliano all’elastina (ELP) Clonare e progettare i costrutti come descritto altrove8,20. Plasmidi sono disponibili su richiesta. 2. Espressione proteica, purificazione e preparazione Espressione di F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry Inoculare la cultura dell’espressione principale dalla pre-cultura notturna a un OD600 di 0,3. Incubare a 3…

Representative Results

Sviluppo di protocolli per la produzione di vescicoliFigura 1 delinea i due diversi metodi di preparazione vescicano. Il metodo di gonfiore THF sul lato sinistro è composto da tre fasi successive e si traduce in diversi assemblaggi sopramolecolari dell’ELP a seconda della temperatura. Nella figura 1A le immagini di microscopia epifluorescenza mostrano vescicoli assemblati da BDP-R20F20 e strutture fibrillari ass…

Discussion

Un difetto mentre seguii i protocolli descritti per l’assemblaggio di strutture sopramolecolari definite porta principalmente alla formazione di aggregati non specifici (Figura 2, IV) o ad anfifili ELP distribuiti omogeneamente. I passaggi critici del protocollo sono descritti di seguito:

Per l’alta resa dell’alta espressione dell’ELP anfipotico, una temperatura relativamente bassa di 20 gradi centigradi è ottimale. Per una purificazione basata sull’affinità di …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il BMBF per il sostegno finanziario e il Center for Biological Systems Analysis per aver fornito la struttura di ricerca. Siamo grati a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, Stati Uniti per aver fornito il pEVOL-pAzF plasmide. Ringraziamo lo staff del Life Imaging Center (LIC) del Center for Biological Systems Analysis (BSA) dell’Albert-Ludwigs-University Friburgo per l’aiuto con le loro risorse di microscopia confocale, e l’eccellente supporto nella registrazione delle immagini.

Materials

1 µm and 0.2 µm Steril Filter VWR
1,4-Dithiothreitol Merck
1-butanol. >99.5% p.a. Roth
2log DNA ladder NEB
2-Mercaptoethanol Roth
50 mL Falcon tubes VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye Sigma Aldrich
Acetic acid glacial VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99% Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO Jena Bioscience
Biofuge Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie) Roth
BspQI NEB
Camera DS Qi1 Nikon
Centrifuge 5417r Eppendorf
Centrifuge 5810r Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid EMS
Chloramphenicol Roth
CompactStar CS 4 VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral Life Technologies
Digital sonifier Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO) Applichem
Dnase I Applichem
EarI NEB
EcoRI-HF NEB
Environmental shaker incubator ES-20 Biosan
Ethanol absolute Roth
Ethidium bromide solution Roth
Filter supports Avanti
Glass plates Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade Amresco
Glycin Applichem
H4-Azido-Phe-OH Bachhem
Heat plate MR HeiTec Heidolph
HindIII NEB
HisTrap FF crude column GE Life Sciences Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. Merck
Illuminator ix 20 INTAS
Illuminator LAS-4000 Fujifilm
Imidazole Merck
Immersions oil for microscopy Merck
Incubators shakers Unimax 1010 Heidolph
Inkubator 1000 Heidolph
IPTG, >99% Roth
Kanamycinsulfate Roth
L(+)-Arabinose Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE Sartorius
LB-Medium Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC Christ
Lysozyme, 20000 U/mg Roth
Microscope CM 100 Philips
Microscope Eclipse TS 100 Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) VWR
Microscopy slides VWR
Microwave Studio
Mini-Extruder Set Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a. Roth
Natriumhydroxid pellets Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro 5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane Avanti
PH meter 766 calimatic Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) Roth
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen
PowerPac basic BioRad
Propanol-2-ol Emplura
Protein ladder 10-250 kDa NEB
Recirculating cooler F12 Julabo
Reinforcement rings Herma
SacI HF NEB
SDS Pellets Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate VWR
T4 DNA Ligase NEB
TEMED Roth
TexasRed Dextran-Conjugate MolecularProbes
Thermomix comfort Eppendorf
THF, >99.5% p.a. Acros
Triton X 100 Roth
Trypton/Pepton from Casein Roth
Ultrasonic cleaner VWR
Urea p.a. Roth
Vacuum pump 2.5 Vacuubrand
XbaI NEB
XhoI NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) Roth

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Schreiber, A., Stühn, L. G., Geissinger, S. E., Huber, M. C., Schiller, S. M. Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro. J. Vis. Exp. (158), e60935, doi:10.3791/60935 (2020).

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