Vi rapporterer om anvendelsen af kvantitativ kromosomkropsformation efterfulgt af sekvensering med høj gennemløb i embryoide kroppe, der stammer fra embryonale stamceller. Denne teknik gør det muligt at identificere og koronere kontakterne mellem formodede smagsforstærkere og promotorregioner for et givet gen under embryonal stamcelledifferentiering.
Under pattedyrs udvikling bestemmes celleskæbneer gennem etablering af reguleringsnetværk, der definerer specificiteten, timingen og de rumlige mønstre af genekspression. Embryoid organer (EBs) stammer fra pluripotente stamceller har været en populær model til at studere differentieringen af de vigtigste tre kimlag og til at definere regulerende kredsløb under celle skæbne specifikation. Selv om det er velkendt, at vævsspecifikke smagsforstærkere spiller en vigtig rolle i disse netværk ved at interagere med initiativtagerne, er det stadig en udfordring at tildele dem deres relevante målgener. For at gøre dette muligt er der behov for kvantitative tilgange for at undersøge de mere omfattende kontakter og deres dynamik under udviklingen. Her har vi tilpasset en 4C-metode til at definere smagsforstærkere og deres kontakter med cognate initiativtagere i EB differentiering model. Metoden bruger ofte skære begrænsning enzymer, sonikering, og en indlejret-ligation-medieret PCR protokol kompatibel med kommercielle DNA bibliotek forberedelse kits. Efterfølgende er 4C biblioteker udsat for høj-throughput sekventering og analyseres bioinformatically, så detektion og kvantificering af alle sekvenser, der har kontakt med en valgt promotor. De resulterende sekventeringsdata kan også bruges til at få oplysninger om dynamikken i kontakt med forstærkeren under differentieringen. Den teknik, der er beskrevet for EB-differentieringsmodellen, er nem at implementere.
I mus indeholder den indre cellemasse (ICM) af 3,5 dage gamle embryoner embryonale pluripotente stamceller. ICM videreudvikler sig til epiblast på dag 4.5, genererer ektoderm, mesoderm, og endoderm celler, de tre vigtigste kim lag i fosteret. Selv om pluripotente celler i ICM kun eksisterer forbigående in vivo, kan de fanges i kulturen ved at etablere embryonale stamceller (mESC)1,2,3. MESC’erne forbliver i en udifferentieret tilstand og formere sig på ubestemt tid, men på iboende og ydre stimuli er de også i stand til at forlade pluripotency-tilstanden og generere celler i de tre udviklingskimlag2,4. Interessant, når kulturforme i suspension i små dråber, mESCs danner tre-dimensionelle aggregater (dvs. EBs), der skelner i alle tre kim lag5. EB-formationsanalysen er et vigtigt redskab til at studere den tidlige afstamningsspecifikationsproces.
Under afstamningspecifikationen får celler i hvert kimlag et specifikt genekspressionsprogram4. Den præcise spatiotemporal udtryk for gener er reguleret af forskellige cis-regulerende elementer, herunder centrale initiativtagere, smagsforstærkere, lyddæmpere, og isolatorer6,7,8,9. Smagsforstærkere, lovgivningsmæssige DNA-segmenter typisk spænder over et par hundrede base par, koordinere væv-specifikke genekspression8. Smagsforstærkere aktiveres eller lukkes af binding af transskriptionsfaktorer og cofaktorer , der regulerer den lokale kromatinstruktur8,10. Almindeligt anvendte teknikker til at identificere formodede smagsforstærkere er genomdækkende kromatinimmunudfældning efterfulgt af sekventering (ChIP-seq) og analysen for transposasetilgængelige kromatin ved hjælp af sekventeringsteknikker (ATAC-seq). Aktive smagsforstærkere er således karakteriseret ved specifikke aktive histonermærker og ved øget lokal DNA-tilgængelighed11,12,13,14. Desuden er udviklingsmæssige smagsforstærkere menes at kræve fysisk interaktion med deres cognate promotor8,9. Faktisk har det vist sig, at forstærker varianter og sletninger, der forstyrrer forstærker-promotor kontakter kan føre til udviklingsmæssige misdannelser15. Derfor er der behov for nye teknikker, der giver yderligere oplysninger til identifikation af funktionelle smagsforstærkere, der styrer udviklingsgenekspression.
Siden udviklingen af kromosomkropsformationsfangstteknikken (3C)16er kortlægningen af kromosomale kontakter blevet anvendt intensivt til at vurdere den fysiske afstand mellem reguleringselementer. Vigtigere er det, høj-throughput varianter af 3C teknikker er for nylig blevet udviklet, giver forskellige strategier for fiksering, fordøjelse, ligation, og inddrivelse af kontakter mellem kromatin fragmenter17. Blandt dem, in situ Hi-C er blevet en populær teknik tillader sekventering af 3C ligation produkter genom-dækkende18. De høje sekventeringsomkostninger, der er nødvendige for at nå frem til en resolution, der er egnet til analyse af kontakter med forstærkeren, gør imidlertid denne teknik upraktisk til undersøgelse af specifikke loci. Derfor blev der udviklet alternative metoder til at analysere målrettede loci ved højere opløsning19,20,21,22. En af disse metoder, nemlig 4C, kendt som en en versus alle strategi, gør det muligt at opdage alle sekvenser, der kontakter et websted valgt som synspunkt. Men en ulempe ved standard 4C teknik er den omvendte PCR kræves, som forstærker forskelligt størrelse fragmenter, favoriserer små produkter og biasing kvantificering efter høj-throughput sekventering. For nylig, UMI-4C, en ny variant af 4C teknik ved hjælp af unikke molekylære identifikatorer (UMI) er blevet udviklet til kvantitative og målrettede kromosomale kontakt profilering, der omgår dette problem23. Denne fremgangsmåde bruger hyppige fræsere, sonikering og en indlejret-ligation-medieret PCR-protokol, hvilket indebærer forstærkning af DNA-fragmenter med relativt ensartet længdefordeling. Denne homogenitet reducerer skævheder i forstærkningsprocessen af PCR-præferencer for kortere sekvenser og muliggør effektiv genopretning og nøjagtig optælling af rumligt forbundne molekyler/fragmenter.
Her beskriver vi en protokol, der tilpasser UMI-4C-teknikken til at identificere og kvantificere kromatinkontakter mellem promotorer og smagsforstærkere af afstamnings lærerige transskriptionsfaktorer under EB-differentiering.
Metoden til hængende dråbekultur kræver ikke yderligere vækstfaktorer eller cytokiner og genererer på en måde homogen population5af EB’er fra et forudbestemt antal mES5 . Her beskriver vi en protokol af kvantitative 4C tilpasset fra UMI-4C tilgang til at kvantificere forstærker-promotor kontakt af afstamning specifikke transskription faktorer i EB differentiering model. Vi identificerede chromatin regioner, der kontakter initiativtagere til Pou5f1 og T gener på en dynamisk måde under EB differentiering. Pou5f1 blev downregulated under EB differentiering og kontaktfrekvensen mellem Pou5f1 promotor og dens distale forstærker faldt. Omvendt blev T upregulated under EB differentiering, og vi identificerede tre smagsforstærkere, for hvilke kontaktfrekvenser med deres promotor er faldet (figur 3). For at bekræfte identifikationen kan der udføres en chromatinimmunudfældning (ChIP) af aktiv histonmærke H3K27ac24, da dette histonmærke har vist sig at være forbundet med forstærkeraktivering, og smagsforstærkere mister dette mærke under deres inaktivering11.
En standard 4C-teknik er blevet grundigt anvendt til at undersøge kromatinkontaktprofilen for specifikke genomiske steder25. Denne fremgangsmåde er imidlertid vanskelig at fortolke kvantitativt, selv efter en omfattende normaliseringaf 26,27,28 pågrund af de skævheder, der er indført ved pcr-fragmenterets heterogenitet og den manglende mulighed for at skelne pcr-dubletter. Vores kvantitative 4C-metode er stort set identisk med UMI-4C-teknikken, der gør det muligt at kvantificere enkelte molekyler ved hjælp af sonikering og et indlejret-ligation-medieret PCR-trin for at omgå begrænsningen af den klassiske 4C-tilgang23. Men i modsætning til UMI-4C, der bruger unikke molekylære identifikatorer, tillader vores kvantitative 4C-protokol kvantificering af enkelte molekyler baseret på den specifikke DNA-brud, der frembringes af sonikeringstrinnet. Det gør vores protokol kompatibel med kommercielle DNA bibliotek forberedelse kits, undgå behovet for primere med unikke molekylære identifikatorer.
Vores protokol omfatter flere vigtige skridt, der bør overvejes. Som i den klassiske 4C metode28, kritiske faktorer i vores protokol er effektiviteten af fordøjelsen og ligation under udarbejdelsen af 3C molekyler. Lav fordøjelse/ ligation effektivitet kan dramatisk mindske kompleksiteten af interaktion med et fragment af interesse, hvilket resulterer i en reduceret opløsning. Som tidligere beskrevet23, et andet kritisk skridt i protokollen er udformningen af primere til biblioteket forstærkning. Den anden PCR reaktion primere bør være placeret 5-15 nt fra den afhørte begrænsning site. I en 75 nt sekvensering læse, giver dette mulighed for mindst 40 nt tilbage af fange længde for kortlægning. Den primer, der anvendes i den første PCR-reaktion, skal konstrueres opstrøms for den anden primer uden overlapning, og begge bør være specifikke nok til at sikre effektiv DNA-forstærkning. Ved multipleksning skal primere konstrueres uafhængigt med henblik på en smeltetemperatur (Tm)på 60-65 °C. Som for andre 3C-teknikker bestemmes opløsningen af den kvantitative 4C-metode desuden af det restriktionsenzym, der anvendes i protokol25. Denne protokol bruger et restriktionsenzym med et 4 bp-genkendelsessted, MboI. Den maksimale opløsning med dette enzym er omkring 500 bp, men dette er meget locus afhængige og sjældent opnået. En anden begrænsning er, at interaktioner, der forekommer mellem elementer, der er placeret i det samme begrænsningsfragment, ikke kan spores. Desuden kan interaktioner, der finder sted i en afstand af ét begrænsningssted, ikke skelnes fra den ufordøjede baggrund. Brugen af et indfyldningstrin før ligation kan gøre det muligt at påvise disse interaktioner.
Kvantitativ 4C er ideel til at afhøre kromatin kontakter af målrettede loci. Men det specifikke PCR-forstærkningstrin begrænser antallet af loci, der kan undersøges samtidigt. En måde at øge antallet af målrettede loci er at multiplex PCR trin til samtidig forstærke flere mål, men dette kræver kompatibilitet af de anvendte primere og teste hver primer par før gennemførelsen. Hvis der ønskes globale ændringer af kromatinarkitektur hos initiativtagerne, vil genom-dækkende tilgange som Hi-C, PC Hi-C eller HiChIP være merehensigtsmæssige 29,30,31.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke F. Le Dily, R. Stadhouders og medlemmer af Graf laboratoriet for deres råd og diskussioner. G.S. blev støttet af et Marie Sklodowska-Curie-stipendium (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T af et postdoc-stipendium fra Juan de la Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). Dette arbejde blev støttet af Detth Europæiske Forskningsråd under 7.
0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
BSA | NEB | B9000S | 4C |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
CIP | NEB | M0212 | 4C |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
dNTP | NEB | N0447S | 4C |
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
Knockout DMEM | 10829018 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
MboI | NEB | R0147M | 4C |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |