Vi rapportera tillämpningen av kvantitativa kromosom konformation fånga följt av hög genomströmning sekvensering i embryoid organ som genereras från embryonala stamceller. Denna teknik gör det möjligt att identifiera och kvantifiera kontakterna mellan förmodade förstärkare och promotorregioner av en viss gen under embryonal stamcellsdifferentiering.
Under däggdjursutvecklingen bestäms cellöditet genom att upprätta regleringsnätverk som definierar genuttryckens specificitet, timing och rumsliga mönster. Embryoid organ (EBs) som härrör från pluripotenta stamceller har varit en populär modell för att studera differentiering av de viktigaste tre könsceller lager och att definiera regulatoriska kretsar under cell öde specifikation. Även om det är välkänt att vävnadsspecifika förstärkare spelar en viktig roll i dessa nätverk genom att interagera med initiativtagare, är det fortfarande svårt att tilldela dem till deras relevanta målgener. För att göra detta möjligt behövs kvantitativa metoder för att studera förstärkare-initiativtagare kontakter och deras dynamik under utveckling. Här har vi anpassat en 4C-metod för att definiera förstärkare och deras kontakter med cognate-initiativtagare i EB-differentieringsmodellen. Metoden använder ofta skärande begränsning enzymer, ultraljudsbehandling, och en kapslad-ligation-medierad PCR protokoll kompatibel med kommersiella DNA-bibliotek förberedelse kit. Därefter utsätts 4C-biblioteken för sekvensering med hög genomströmning och analyseras bioinformatiskt, vilket möjliggör detektion och kvantifiering av alla sekvenser som har kontakter med en vald promotor. De resulterande sekvenseringsdata kan också användas för att få information om dynamiken i förstärkare-promotor kontakter under differentiering. Den teknik som beskrivs för EB-differentieringsmodellen är lätt att implementera.
Hos möss innehåller den inre cellmassan (ICM) av 3,5 dagar gamla embryon embryon embryonala pluripotenta stamceller. ICM utvecklas ytterligare till epiblast på dag 4,5, genererar ektoderm, mesoderm, och endoderm celler, de viktigaste tre könsceller i embryot. Även om pluripotenta celler i ICM endast finns övergående in vivo, kan de fångas i kultur genom inrättandet av mus embryonala stamceller (mESCs)1,2,3. De mESC kvar i ett odifferentierat tillstånd och föröka sig på obestämd tid, men på inneboende och intrinsic stimuli de är också i stånd att lämna pluripotency tillstånd och generera celler i de tre utvecklingsmässiga groddar lager2,4. Intressant, när odlas i suspension i små droppar, mESC bildar tredimensionella aggregat (dvs. EBs) som skiljer sig i alla tre groddar lager5. EB-formationsanalysen är ett viktigt verktyg för att studera den tidiga härstamningsspecifikationsprocessen.
Under härstamningsspecifikationen förvärvar celler i varje könsskikt ett specifikt genuttrycksprogram4. Den exakta spatiotemporal uttryck av gener regleras av olika cis-reglerande element, inklusive centrala initiativtagare, förstärkare, ljuddämpare och isolatorer6,,7,8,9. Förstärkare, regulatoriska DNA-segment som vanligtvis spänner över några hundra baspar, samordna vävnadsspecifika genuttryck8. Förstärkare aktiveras eller tystas genom bindning av transkriptionsfaktorer och kofaktorer som reglerar lokal kromatinstruktur8,10. Vanliga tekniker för att identifiera förmodade förstärkare är genom-hela kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-seq) och analysen för transposas-tillgänglig kromatin med sekvensering (ATAC-seq) tekniker. Således kännetecknas aktiva förstärkare av specifika aktiva histonmärken och av ökad lokal DNA-tillgänglighet11,12,13,14. Dessutom, utvecklingsmässiga förstärkare tros kräva fysisk interaktion med sin cognate promotor8,9. Det har faktiskt visat sig att förstärkare varianter och strykningar som stör förstärkare-promotor kontakter kan leda till utvecklingsmässiga missbildningar15. Därför finns det ett behov av nya tekniker som ger ytterligare information för identifiering av funktionella förstärkare som styr utvecklingsgenuttryck.
Sedan utvecklingen av kromosomkonformationsavskiljning (3C) teknik16,kartläggning av kromosomal kontakter har intensivt använts för att bedöma fysiskt avstånd mellan regulatoriska element. Viktigt, hög genomströmning varianter av 3C tekniker har nyligen utvecklats, vilket ger olika strategier för fixering, matsmältning, ligering, och återvinning av kontakter mellan kromatin fragment17. Bland dem, in situ Hi-C har blivit en populär teknik som möjliggör sekvensering av 3C ligering produkter genomet hela18. De höga sekvenseringskostnader som krävs för att nå en lösning som lämpar sig för analys av förstärkare-promotor kontakter gör dock denna teknik opraktiskt för studier av specifika lokus. Därför utvecklades alternativa metoder för att analysera riktade lokus vid högre upplösning19,20,21,22. En av dessa metoder, nämligen 4C, känd som en en mot alla strategi, gör det möjligt att upptäcka alla sekvenser som kontaktar en webbplats som valts som synvinkel. Men en nackdel med den vanliga 4C-tekniken är den omvända PCR krävs, som förstärker olika stora fragment, gynnar små produkter och partiska kvantifiering efter hög genomströmning sekvensering. Nyligen, UMI-4C, en ny variant av 4C-tekniken med hjälp av unika molekylära identifierare (UMI) har utvecklats för kvantitativa och riktade kromosomal kontakt profilering som kringgår detta problem23. Detta tillvägagångssätt använder täta fräsar, ultraljudsbehandling, och en kapslad-ligation-medierad PCR protokoll, vilket innebär förstärkning av DNA-fragment med relativt enhetlig längdfördelning. Denna homogenitet minskar fördomar i förstärkningsprocessen av PCR-preferenser för kortare sekvenser och möjliggör effektiv återhämtning och korrekt räkning av rumsligt anslutna molekyler/fragment.
Här beskriver vi ett protokoll som anpassar UMI-4C-tekniken för att identifiera och kvantifiera kromatinkontakter mellan initiativtagare och förstärkare av härstamning instructive transkription faktorer under EB differentiering.
Metoden för hängande droppodling behöver inte ytterligare tillväxtfaktorer eller cytokiner och genererar reproducerbart homogena populationer av EBs från ett förutbestämt antal mESC5. Här beskriver vi ett protokoll av kvantitativa 4C anpassas från UMI-4C strategi för att kvantifiera förstärkare-promotor kontakt av härstamning specifika transkription faktorer i EB differentiering modell. Vi identifierade kromatin regioner som kontaktar initiativtagare till Pou5f1 och T gener på ett dynamiskt sätt under EB differentiering. Pou5f1 var nedreglerad under EB differentiering och kontaktfrekvensen mellan Pou5f1 promotorn och dess distala förstärkare minskade. Omvänt var T uppreglerad under EB differentiering och vi identifierade tre förstärkare för vilka kontaktfrekvenser med deras promotor minskar (figur 3). För att bekräfta identifieringen kan en kromatinimmunprecipitation (ChIP) analys av aktiv histon märke H3K27ac utföras24, eftersom detta histon märke har visat sig vara associerad med förstärkare aktivering och förstärkare förlorar detta märke under sin inaktivering11.
En standard 4C-teknik har använts i stor utsträckning för att kartlägga kromatinkontaktprofilen för specifika genomiska platser25. Detta tillvägagångssätt är dock svårt att tolka kvantitativt även efter omfattande normalisering26,27,28 på grund av de fördomar som införts av heterogenitet PCR fragmentstorlek och omöjligheten att skilja PCR dubbletter. Vår kvantitativa 4C-metod är i stort sett identisk med UMI-4C-tekniken som gör det möjligt att kvantifiera enstaka molekyler med ultraljudsbehandling och en kapslad ligering-medierad PCR-steg för att kringgå begränsningen av den klassiska 4C-metoden23. Men till skillnad från UMI-4C som använder unika molekylära identifierare, tillåter vårt kvantitativa 4C-protokoll kvantifiering av enstaka molekyler baserat på den specifika DNA-paus som produceras av ultraljudsbehandlingssteget. Det gör vårt protokoll kompatibelt med kommersiella DNA-biblioteksberedningssatser, vilket undanröjer behovet av primers med unika molekylära identifierare.
Vårt protokoll omfattar flera viktiga steg som bör övervägas. Som i den klassiska 4C-metoden28är kritiska faktorer i vårt protokoll effektiviteten i matsmältningen och ligeringen under beredningen av 3C-molekylerna. Låg matsmältning/ligering effektivitet kan dramatiskt minska komplexiteten i interaktion med ett fragment av intresse, vilket resulterar i en reducerad upplösning. Som tidigare beskrivits23, ett annat kritiskt steg i protokollet är utformningen av primers för biblioteket förstärkning. Den andra PCR reaktion primers bör placeras 5-15 nt från förhörsbegränsning webbplats. I en 75 nt sekvensering läsa, detta möjliggör minst 40 nt vänster om fångstlängden för kartläggning. Den primer som används i den första PCR-reaktionen bör utformas uppströms den andra primern utan överlappning och båda bör vara tillräckligt specifika för att säkerställa effektiv DNA-förstärkning. För multiplexering bör grundfärger utformas oberoende av dem och sikta på en smälttemperatur (Tm)på 60-65 °C. Dessutom bestäms upplösningen av den kvantitativa 4C-metoden av det restriktionsenzym som används i protokoll25. Detta protokoll använder en begränsning enzym med en 4 bp erkännande webbplats, MboI. Den maximala upplösningen med detta enzym är runt 500 bp, men detta är mycket locus beroende och sällan uppnås. En annan begränsning är att interaktioner som uppstår mellan element som finns i samma begränsningsfragment inte kan upptäckas. Dessutom kan interaktioner som sker på ett avstånd av en begränsning webbplats inte skiljas från den osmält bakgrunden. Användning av ett ifyllnadssteg före ligering kan göra det möjligt att upptäcka dessa interaktioner.
Kvantitativa 4C är idealisk för förhör kromatin kontakter riktade lokus. Det specifika PCR-förstärkningssteget begränsar dock antalet loci som kan undersökas samtidigt. Ett sätt att öka antalet riktade loci är att multiplex PCR steg för att samtidigt förstärka flera mål, men detta kräver kompatibilitet av primers används och testa varje primer par före genomförandet. Om globala förändringar av kromatinarkitektur hos initiativtagare önskas, skulle genomomfattande metoder som Hi-C, PC Hi-C eller HiChIP vara lämpligare29,,30,31.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka F. Le Dily, R. Stadhouders och medlemmar av Graf laboratoriet för deras råd och diskussioner. G.S. stöddes av en Marie Sklodowska-Curie-stipendium (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T av en Juan de la Cierva postdoc fellowship (MINECO, FJCI-2014-22946). Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet inom ramenför sjunde ramprogrammet för sjunde ramprogrammet (ERC Synergy Grant 4D-Genome, bidragsavtal 609989 till T.G.), det spanska ministeriet för ekonomi, industri och konkurrenskraft (MEIC) till EMBL-partnerskapet, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013–2017 och CERCA-programmet Generalitat de Catalunya.
0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
BSA | NEB | B9000S | 4C |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
CIP | NEB | M0212 | 4C |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
dNTP | NEB | N0447S | 4C |
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
Knockout DMEM | 10829018 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
MboI | NEB | R0147M | 4C |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |