Summary
हम एक इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन का वर्णन करते हैं जो खोपड़ी को स्थिर किए जा सकने वाले टिप पर सुई तुला को नियोजित करता है, इस प्रकार अंतर्निहित परान्चिमा को नुकसान के जोखिम को नष्ट करता है। दृष्टिकोण आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण और लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं के जोड़तोड़ और सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में अंतर्निहित परान्चिमा को नुकसान के जोखिम को नष्ट करते हुए सिस्टर्ना मैग्ना के माध्यम से समाधानों को सुरक्षित रूप से और मैन्युअल रूप से इंजेक्ट करने का वर्णन किया गया है। पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल सीधे सुइयों का उपयोग करने की सलाह देते हैं जिन्हें ड्यूरल सतह से अधिकतम 1-2 मिमी तक कम किया जाना चाहिए। ड्यूरल झिल्ली पंचर होने के बाद प्रतिरोध में अचानक गिरावट से सुई को स्थिर स्थिति में बनाए रखना मुश्किल हो जाता है। हमारी विधि, बजाय, टिप पर एक सुई तुला को रोजगार देता है जिसे खोपड़ी की ऑक्सीपिटल हड्डी के खिलाफ स्थिर किया जा सकता है, इस प्रकार ड्यूरल झिल्ली के छिद्र के बाद सिरिंज को ऊतक में प्रवेश करने से रोकता है। प्रक्रिया सीधी, प्रजनन योग्य है, और संचालित जानवरों में लंबे समय तक चलने वाली असुविधा का कारण नहीं बनती है। हम संवहनी लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं के आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण के संदर्भ में इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन रणनीति का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, इसी तकनीक का उपयोग अनुसंधान प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि न्यूरोडेवलपमेंट में लेप्टोमेनिंग्स की भूमिका की जांच करना और इन घटनाओं में चित्रित जीन के आनुवंशिक एब्लेशन के माध्यम से बैक्टीरियल दिमागी पहचान पत्र के प्रसार की जांच करना । इसके अतिरिक्त, प्रक्रिया को निरंतर वितरण के लिए एक स्वचालित जलसेक प्रणाली के साथ जोड़ा जा सकता है और फ्लोरोसेंटी लेबल वाले अणुओं के इंजेक्शन के माध्यम से सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
लेप्टोमेनिंगल कोशिकाएं मस्तिष्क को ओवरलेइंग करने वाली पतली परत में आयोजित कोशिकाओं की फाइब्रोब्लास्ट जैसी आबादी हैं और कोलेजन क्रॉसलिंकिंग (जैसे, डीसीएन और लम)में फंसाए गए जीन को व्यक्त करती हैं, और मस्तिष्क-मेनिंगल बैरियर (जैसे, Cldn11)1,,2की स्थापना में। लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं को शारीरिक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया जाता है, सेरेब्रोस्पाइनल द्रव जल निकासी3 पर सख्त नियंत्रण से विकासशील मस्तिष्क4,,5में तंत्रिका जनकों के मार्गदर्शन तक। हाल के एक अध्ययन में यह भी प्रस्ताव किया गया है कि नवजात शिशु में लेप्टोमेनिंग रेडियल ग्लिया जैसी कोशिकाओं को आश्रय दे सकते हैं जो मस्तिष्क परेंचिमा में स्थानांतरित हो जाते हैं और कार्यात्मक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स6में विकसित होते हैं।
लेप्टोमेनिंगल कोशिकाएं सतह एस्ट्रोसाइट्स के निकट निकटता में स्थित हैं और उनके साथ साझा करते हैं, साथ ही अन्य पैरान्चिमल एस्ट्रोग्लिया, कॉनक्सिन-30 (Cx30)7की अभिव्यक्ति। नीचे उल्लिखित शल्य चिकित्सा प्रक्रिया ट्रांसजेनिक चूहों के सिस्टर्ना मैग्ना में एंडोस्सेफेन के एक बार वितरण के माध्यम से इन मेनिंगल कोशिकाओं की व्यापक और विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति देती है, जो Cx30+ कोशिकाओं में टीडीटमाटर को सशर्त व्यक्त करता है (यानी, भाग्य मानचित्रण के लिए क्रेयर-लोक्सपी प्रणाली का उपयोग करना)। एंडोक्सिफेन टैमोक्सिफेन का एक सक्रिय मेटाबोलाइट है और टैमोक्सिफेन के समान क्रेयर-व्यक्त कोशिकाओं के पुनर्संयोजन को प्रेरित करता है। हालांकि, यह सामयिक आवेदन के लिए अनुशंसित समाधान है क्योंकि यह इथेनॉल की उच्च सांद्रता के बजाय 5-10% डीएमएसओ में घुल जाता है। इसके अतिरिक्त, एंडोक्सिफेन मस्तिष्क-मेनिंगल बाधा को पार नहीं करता है, जिससे अंतर्निहित Cx30+ खगोलीय आबादी (प्रतिनिधि परिणामदेखें) की लेबलिंग के बिना लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं के विशिष्ट पुनर्संयोजन को सक्षम करता है।
यहां प्रस्तुत तकनीक का उद्देश्य सिस्टर्ना मैग्ना तक सीधी पहुंच के माध्यम से सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ में यौगिक को मैन्युअल और सुरक्षित रूप से इंजेक्ट करना है। अन्य, अधिक आक्रामक प्रक्रियाओं के विपरीत, क्रैनिओटॉमी की आवश्यकता होती है, यह दृष्टिकोण खोपड़ी या मस्तिष्क पैरान्चिमा को नुकसान पहुंचाए बिना यौगिकों को बढ़ावा देने की अनुमति देता है। इस प्रकार, यह पैरान्चिमल ग्लिया कोशिकाओं की सक्रियता से शुरू हुई भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को शामिल करने से जुड़ा नहीं है। 8,,9,,10से पहले वर्णित अन्य इंजेक्शन रणनीतियों के समान, वर्तमान दृष्टिकोण ओवरलेलिंग गर्दन की मांसपेशियों के कुंद विच्छेदन के बाद, सिस्टर्ना मैग्ना को कवर करने वाली अटलांटो-ऑक्सीपिटल ड्यूरल झिल्ली के सर्जिकल एक्सपोजर पर निर्भर करता है। हालांकि, अन्य प्रक्रियाओं के विपरीत, हम टिप पर झुका सुई के उपयोग की सलाह देते हैं, जिसे प्रशासन के दौरान ऑक्सीपिटल हड्डी के खिलाफ स्थिर किया जा सकता है। यह सुई के बहुत गहरे मर्मज्ञ और अंतर्निहित सेरिबैलम और मेडुला को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को रोक देगा।
यह शल्य प्रक्रिया वंश ट्रेसिंग जांच के साथ संगत है जिसका उद्देश्य परन्चिमल परतों के माध्यम से सेल पहचान और माइग्रेशन मार्गों में परिवर्तन ों का मानचित्रण करना है। इसे आनुवंशिक एब्लेशन अध्ययनों के अनुकूल भी माना जा सकता है जो स्वास्थ्य और रोग में लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने का इरादा रखते हैं, जैसे कॉर्टिकल विकास5 में उनका योगदान या बैक्टीरियल दिमागी दिमागीतालीम3,11का प्रसार। अंत में, इसका उपयोग जंगली प्रकार के जानवरों में फ्लोरोसेंट ट्रेसर के वितरण के साथ संयुक्त होने पर सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
इसके द्वारा प्रस्तुत की गई सर्जिकल प्रक्रियाओं को स्टॉकहोमननोरा Djurförsöksetiska Nämnd द्वारा अनुमोदित किया गया था और अनुसंधान संस्थान (कारोलिंस्का संस्थान, स्वीडन) द्वारा प्रदान किए गए विनिर्देशों के साथ समझौते में किया गया था।
नोट: इंट्रास्टर्नल इंजेक्शन को कई शोध उद्देश्यों के लिए लचीले ढंग से अनुकूलित किया जा सकता है। हम एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन में एंडोक्सिफेन के इंजेक्शन के आधार पर भाग्य मानचित्रण के लिए लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक लेबल करने के लिए विकसित एक प्रक्रिया के नीचे मौजूद हैं, जिसमें Rx30 प्रमोटर13के तहत बाद में R26R-tdTomato12 और क्रेयर को ले जाया गया है। कोशिकाओं की इस आबादी की लेबलिंग नीचे उल्लिखित एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर वायरल निर्माण के इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । अंत में, फ्लोरोसेंट ट्रेसर के अर्क द्वारा, सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ प्रवाह को ट्रैक करने के लिए इस दृष्टिकोण को नियोजित किया जा सकता है।
1. इंजेक्शन सिस्टम की तैयारी
नोट: हम एक उपयुक्त शल्य चिकित्सा कक्ष में प्रक्रिया को पूरा करने की सलाह देते हैं, और असेप्टिक स्थितियों में। सर्जिकल उपकरण गर्मी (ऑटोक्लेव, ग्लास बीड स्टरलाइजर) का उपयोग करके निष्फल किया जा सकता है या यदि वे गर्मी के प्रति संवेदनशील होते हैं तो उच्च स्तरीय रासायनिक कीटाणुनाशक का उपयोग करके साफ किया जा सकता है। रासायनिक संक्रमण को नियोजित करते समय उपयोग से पहले उपकरणों को कुल्ला करें या गर्मी के साथ साफ होने पर उन्हें ठंडा होने दें।
- संदंश का उपयोग करके, इंजेक्शन सिरिंज की सुई को टिप से 3 मिमी पर 30 डिग्री तक मोड़ें।
नोट: एक 30 जी beveled सुई के साथ हैमिल्टन सिरिंज का प्रयोग करें। - एंडोक्सिफेन समाधान के 1 मिलीग्राम/mL तैयार करें, 10% DMSO में पतला और तुला सुई के साथ सिरिंज बैकफिल।
नोट: वयस्क C57Bl/6j माउस (ca. 25-30 ग्राम) में मेनिंगल कोशिकाओं के व्यापक प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए यौगिक के 5 μL प्रशासन, हालांकि पायलट प्रयोग ों कि विभिन्न सांद्रता और इंजेक्शन की मात्रा का परीक्षण आवश्यक हो सकता है जब विभिन्न उंर और उपभेदों के जानवरों का इलाज । - माउस हेड होल्डर को एडजस्ट करें ताकि मुंह का टुकड़ा सर्जिकल टेबल की सतह से लगभग 30 डिग्री पर हो।
नोट: इस प्रक्रिया के लिए तीन सूत्री निर्धारण (यानी कान और मुंह) के साथ एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम का भी उपयोग किया जा सकता है। इस मामले में, हालांकि, जानवर को केवल मुंह के टुकड़े के साथ तय किया जाएगा, जबकि कान की सलाखों को जानवर के अग्रअंगों के नीचे बढ़ाया जा सकता है और प्रक्रिया के दौरान जानवर के शरीर का समर्थन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
2. एनेस्थीसिया का शामिल
- इंजेक्शन एनेस्थेटिक्स के लिए, स्थानीय संस्था में पशु चिकित्सा इकाई द्वारा अनुशंसित सांद्रता और प्रशासन के तरीकों का उपयोग करें।
- इनहेलेशनल एनेस्थेटिक्स के लिए, जैसे आइसोफ्लोरीन, निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार प्रशासन इकाई तैयार करते हैं।
- आइसोफ्लोरीन के साथ, संज्ञाहरण के शामिल होने के लिए यौगिक की एकाग्रता 4% पर सेट करें।
- 400 मीटर/मिन की दर से हवा वितरित करें।
- संज्ञाहरण इकाई को कुछ मिनटों के लिए एनेस्थेटिक के साथ कक्ष को भरने और माउस को बाद में कक्ष में रखने की अनुमति दें।
नोट: वर्तमान प्रयोगों के लिए, हमने वयस्क (>2 महीने पुराने और लगभग 30 ग्राम) पुरुष और महिला ट्रांसजेनिक चूहों का इस्तेमाल किया है जो Cx30-क्रेER और R26R-tdTomato ले जारहे हैं, और C57Bl/6j पृष्ठभूमि पर पैदा हुए हैं । - संज्ञाहरण के शामिल होने के दौरान जानवर की निगरानी करें। जब माउस पूर्ण संज्ञाहरण के तहत होता है तो श्वास पैटर्न धीमा होना चाहिए।
- जानवर को कक्ष से निकालें और हिंद पंजे को नाजुक रूप से चुटकी देकर पंजा पलटा के दमन की जांच करें।
नोट: पलटा अभी भी मौजूद हो सकता है लेकिन सेकंड के एक जोड़े में देरी । यदि ऐसा है, तो पशु को वापस कक्ष में रखें जब तक कि पंजा पलटा का पूर्ण दमन प्राप्त नहीं हो जाता है। - प्रसवपूर्व दर्द प्रबंधन में सहायता के लिए एनाल्जेसिक (उदाहरण के लिए, कार्प्रोफेन, 5 मिलीग्राम/किलोग्राम के माध्यम से चमड़े के नीचे इंजेक्शन) का प्रबंध करें।
3. प्रक्रिया के लिए पशु की स्थिति
- जानवर के सिर को सिर धारक पर ठीक करें। सिस्टर्ना मैग्ना तक पहुंच में सुधार करने के लिए, जानवर के शरीर को मेज की सतह से लगभग 30 डिग्री पर रखें और नीचे की ओर शीर्षक वाले सिर, शरीर के बाकी हिस्सों के साथ 120 डिग्री का कोण स्थापित करने और सिस्टर्ना मैग्ना तक पहुंच की सुविधा के लिए गर्दन के पीछे का विस्तार करें(चित्रा 1ए)।
- प्रक्रिया के दौरान अपने शरीर का समर्थन करने के लिए जानवर के नीचे कागज तौलिए जोड़ें।
- मुंह के टुकड़े के माध्यम से सुरक्षित संज्ञाहरण वितरण और २.५% और २०० मिलीलीटर/मिन के लिए हवा वितरण करने के लिए isoflurane एकाग्रता को कम ।
- नेत्र मलम लागू करें।
4. सिस्टर्ना मैग्ना का एक्सपोजर
- जानवर की गर्दन के पीछे दाढ़ी और 70% इथेनॉल और बीटाडीन के साथ क्षेत्र को साफ करें।
- सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, ऑक्सीपिटल हड्डी के स्तर से शुरू होने वाले मिडलाइन चीरा (लंबाई में 7 मिमी) का प्रदर्शन करें और इसे पीछे से बढ़ाएं।
- धीरे-धीरे सतही संयोजी ऊतक और गर्दन की मांसपेशियों को ठीक टिप चिमटी के साथ मिडलाइन से साइडवाइज खींचना अलग करें। यह एक उल्टे त्रिकोण के रूप में आकार के सिस्टर्ना मैग्ना को ओवरले करने वाली ड्यूरल झिल्ली को बेनकाब करेगा।
- किसी भी परिणामी रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए बाँझ अवशोषण भाले या कपास झाड़ू का उपयोग करें।
- गर्दन की मांसपेशियों को बनाए रखने के लिए एक छोटे से सर्जिकल विभाजक की स्थिति को अलग खींच लिया और प्रक्रिया के दौरान सिस्टर्ना मैग्ना के दृश्य को सक्षम करें।
5. इंट्रास्टर्नल इंजेक्शन
- सिस्टर्ना मैग्ना तक पहुंच प्राप्त करने के लिए, ऑक्सीपिटल हड्डी के कौडल अंत की पहचान करें और सुई डालें जो पहले तुरंत नीचे झुक ी थी।
नोट: ड्यूरल झिल्ली पंचर होने के साथ ही प्रतिरोध में अचानक गिरावट आएगी। हालांकि, सुई की नोक केवल दिमागी सतह के नीचे थोड़ा घुसना होगा, इसके कांटे की शकल आकृति के लिए धन्यवाद। - एक बार ड्यूरा छिद्रित हो जाने के बाद, सुई के तुला टिप को धीरे से सिरिंज को ऊपर की ओर खींचकर और जानवर के शरीर के समानांतर, खोपड़ी के लिए सुई को "हुक" करने के लिए ड्यूरल सतह के नीचे घुसना की अनुमति दें (चित्रा 1बीदेखें)। यह बेहतर स्थिरता सुनिश्चित करेगा और सुई को गहरे मर्मज्ञ होने से रोकेगा, इस प्रकार अंतर्निहित सेरिबैलम या मेडुला को नुकसान पहुंचाने के जोखिम से बच जाएगा।
- सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के प्राकृतिक प्रवाह के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए यौगिक को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें।
नोट: प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, जलसेक दर भिन्न हो सकती है। यदि धीमी और स्थिर जलसेक दर की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन का पता लगाने की प्रक्रिया का उपयोग करते समय), सिरिंज के संयोजन में एक स्वचालित माइक्रोइन्फ्यूजन सिस्टम का उपयोग करने की सलाह दी जा सकती है। - इंजेक्शन के बाद सुई को 1 मिनट के लिए साइट में आराम करने दें और सावधानी से इसे हटा दें। अपनी कांटे की शकल स्थिति से सुई के पीछे हटने में सहायता करने के लिए ठीक टिप संदंश का उपयोग करें।
नोट: एक पतली सुई (जैसे, 30 ग्राम) के उपयोग से मेनिंगल झिल्ली का पर्याप्त नुकसान नहीं होता है, और इसके परिणामस्वरूप सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ का बहिर्गमन होता है। यदि बड़े सुई आकार की आवश्यकता होती है, तो हम बाँझ कपास टिप का उपयोग करके इंजेक्शन साइट पर दबाव डालकर तरल पदार्थ के लीक होने को रोकने की सलाह देते हैं।
6. प्रक्रिया और पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल का समापन
- विभाजक को हटा दें और मांसपेशियों को ड्यूरल झिल्ली को ओवरले करने वाली अपनी मूल स्थिति में वापस जाने की अनुमति दें।
- साइनोक्रिलेट चिपकने वाले की कुछ बूंदों का उपयोग करके त्वचा चीरा बंद करें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, अवशोषित टांके (जैसे, 5-0 विरिल टांके) का उपयोग करें और बाधित टांके के साथ त्वचा चीरा बंद करें। - चीरा साइट पर स्थानीय संवेदनाकारक (जैसे, 5% लिडोकेन के 100 माइक्रोन) लागू करें।
- धारक से जानवर को निकालें और एक हीटिंग पैड पर तैनात एक साफ पिंजरे में रखें। जानवर की निगरानी तब तक करें जब तक कि वह होश में न आ जाए।
नोट: प्रक्रिया से जानवर में लंबे समय तक चलने वाले दर्द या संकट की उम्मीद नहीं है। फिर भी, माउस को पहले पश्चात दिनों के लिए बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए और जब भी आवश्यक समझा जाता है, और आपकी संस्था में पशु चिकित्सा इकाई द्वारा प्रदान की गई सिफारिशों के अनुसार दर्द से राहत के उपाय किए जा सकते हैं।
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Representative Results
Cx30 प्रमोटर13 और एक प्रेरक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के तहत क्रेयर व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों में एंडोक्सिफेन का इंट्राक्लिचइंजेक्शन पड़ोसी Cx30-व्यक्त सतह और प्रांतस्था में पैरानचिमल एस्ट्रोसाइट्स(चित्रा 1)लेबलिंग के बिना लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं के विशिष्ट पुनर्संयोजन के लिए अनुमति देता है । सिस्टर्ना मैग्ना तक पहुंच प्राप्त करने के लिए, एनेस्थेटाइज्ड जानवर लगभग 120 डिग्री के कोण पर अपने शरीर और उसके सिर के साथ तैनात होता है, इस प्रकार, इसकी गर्दन के पीछे फैला हुआ होने की अनुमति देता है(चित्रा 1ए)। ड्यूरल झिल्ली का अटलांटो-ऑक्सीपिटल हिस्सा तब गर्दन की मांसपेशियों के कुंद विच्छेदन के माध्यम से उजागर होता है, इस प्रकार अंतर्निहित सिस्टर्ना मैग्ना तक पहुंच प्राप्त करता है। एक सुरक्षित मैनुअल इंजेक्शन टिप से 3 मिमी पर लगभग 30 डिग्री तक झुका हुआ सुई के साथ किया जाता है। यह सिरिंज को कपाल की ऑक्सीपिटल हड्डी के खिलाफ आयोजित करने की अनुमति देता है, इस प्रकार प्रशासन के दौरान स्थिरता में सुधार(चित्रा 1बी)। सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ के शारीरिक आंदोलन का लाभ उठाते हुए, एंडोक्सिफेन समाधान को पूरे सुबारराक्नोइड अंतरिक्ष में वितरित किया जाता है ताकि ओल्फैक्टरी बल्ब, कॉर्टेक्स और सेरिबैलम(चित्रा 1सी)को ओवरलेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक फिर से जोड़ दिया जा सके। जैसा कि चित्र 1में प्रदर्शित किया गया है, समाधान मस्तिष्क-मेनिंगल बाधा को पार नहीं करता है और परेंचिमा की खगोलीय कोशिकाओं के संपर्क में नहीं आता है, जैसा कि मौखिक गावज (2 मिलीग्राम/प्रति दिन, लगातार पांच दिनों में प्रणालीगत प्रशासन के विपरीत है; चित्रा 1सी-ई)।
चित्रा 1: एंडोक्सिफेन के इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन के माध्यम से लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं की विशिष्ट लेबलिंग। पैनल ए और बी इंट्रास्टर्नल प्रशासन के लिए विकसित प्रक्रिया को दर्शाते हैं। सिस्टर्ना मैग्ना तक पहुंच प्राप्त करने के लिए, गर्दन के पीछे फैला होना चाहिए। इसलिए एनेस्थेटाइज्ड जानवर शरीर और सिर के बीच 120 डिग्री के अनुमानित कोण पर तैनात होता है, जो नीचेकीओर झुका हुआ होता है । कांटे की शकल सुई खोपड़ी के लिए सिरिंज सुरक्षित करने के लिए और सुरक्षित रूप से समाधान(बी)के एक मैनुअल प्रशासन के साथ आगे बढ़ने के लिए अनुमति देता है । पैनल सी Cx30 प्रमोटर और tdTomato फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की प्रेरक अभिव्यक्ति के तहत क्रेयर ले जाने वाले ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में एंडोक्सिफेन के इंट्रासिस्टर्नल प्रशासन के बाद मस्तिष्क के एक sagittal अनुभाग को प्रदर्शित करता है। तारक (*) इंजेक्शन साइट को चिह्नित करता है और प्रक्रिया के बाद ऑपरेटिव क्षति के अभाव को दर्शाता है। एंडोक्सिफेन चुनिंदा रूप से घ्राण बल्ब (ओबी), कॉर्टेक्स (सीटीएक्स), और सेरिबैलम (सीबी) को ओवरले करने वाली मेनिंगल लेयर में कोशिकाओं में आनुवंशिक पुनर्संयोजन और रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। मिडब्रेन (एरोहेड) में केवल कुछ एस्ट्रोसाइट्स एंडोक्सिफेन के इंट्रासिस्टर्नल डिलीवरी के बाद फिर से जोड़ दिए जाते हैं। पैनल डी-एफ जानवरों में सी में बॉक्स्ड क्षेत्र के आवर्धन हैं जिन्हें वाहन समाधान(डी)के साथ इलाज किया गया था, जो एंडोक्सिफेन(ई)के इंट्राकिस्टर्नल इंजेक्शन के अधीन थे, या मौखिक गावज(एफ)के माध्यम से व्यवस्थित रूप से इलाज किया जाता है। जबकि इंट्रास्टर्नल प्रशासन विशेष रूप से लेप्टोमेनिंग्स की कोशिकाओं को लेबल करता है, प्रणालीगत वितरण भी कॉर्टिकल परतों (L1 से L6) भर में Cx30-व्यक्त एस्ट्रोसाइट्स का पुनर्संयोजन होता है। पैनल जी इंट्रापिस्टर्नल इंजेक्शन के बाद, Pdgfra प्रतिक्रियाशीलता के माध्यम से पहचाने गए लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं (तारक) के पुनर्संयोजन को दिखाता है। इसके विपरीत, सतह (तीरसिर) और पैरान्चिमल (तीर) एफएफएपी व्यक्त करने वाले एस्ट्रोसाइट्स अवेलेबल रहते हैं। स्केल बार = 1,000 माइक्रोन(सी),150 माइक्रोन (डी-एफ),और 40 माइक्रोन(जी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल भाग्य मानचित्रण के लिए लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं को लेबल करने के लिए एक सीधी और प्रजनन प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। हम Cx30-क्रेयर में टीडीमैटो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, टैमोक्सिफेन के सक्रिय मेटाबोलाइट, एंडोक्सिफेन के इंट्राक्लिस्टर्न इंजेक्शन का उपयोग करते हैं; R26R-tdTomato चूहों12,,13।
सिस्टर्ना मैग्ना9के माध्यम से सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ तक पहुंच प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में, हमारा दृष्टिकोण एक तुला सुई के उपयोग के लिए एक सुरक्षित मैनुअल प्रशासन को धन्यवाद सुनिश्चित करता है जिसे खोपड़ी की ऑक्सीपिटल हड्डी में स्थिर किया जा सकता है। एक बार सिस्टर्ना मैग्ना की ड्यूरल झिल्ली छिद्रित हो जाती है, तो प्रतिरोध में अचानक गिरावट आती है। इस बिंदु पर, अन्य प्रोटोकॉल ड्यूरल सतह से सुई को अधिकतम 1-2 मिमी तक कम करने और मैन्युअल रूप से प्रक्रिया9में स्थिर स्थिति में रखने की सलाह देते हैं। एक सीधी सुई के विपरीत, कांटे की शकल सुई खोपड़ी के लिए सुरक्षित है और ऊतक में गहरी घुसना नहीं कर सकती है, इस प्रकार अंतर्निहित सेरिबैलम या मेडुला को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को नष्ट कर सकती है। हमारी कांटे की शकल प्रणाली समाधान के एक सुरक्षित प्रशासन के लिए अनुमति देता है, खासकर जब जलसेक की एक धीमी दर का उपयोग कर ।
यहां उल्लिखित प्रक्रिया से संचालित जानवर को लंबे समय तक चलने वाली असुविधा होने की उम्मीद नहीं है । हालांकि, बड़ी मात्रा में समाधान का प्रशासन करते समय देखभाल की जानी चाहिए। एक तेज डिलीवरी दर इंट्राक्रैनियल दबाव और माउस में न्यूरोलॉजिकल लक्षणों के विकास में परिवर्तन का कारण बन सकती है। हम इस जोखिम से बचने के लिए 5-10 माइक्रोन तक वॉल्यूम इंजेक्ट करने या सिरिंज को माइक्रोजोड़क पर इकट्ठा करने का सुझाव देते हैं जिसका वितरण दर पर नियंत्रण है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन के अध्ययन के लिए इस प्रक्रिया को अनुकूलित। शारीरिक प्रवाह के अत्यधिक पर्ट्रबंस को रोकने के लिए मैन्युअल इंजेक्शन से बचने और जलसेक (जैसे, 1 μL/min) की धीमी दर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल को एक इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो कुशलता पूर्वक लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं को लेबल करता है। हम नैतिक विनिर्देशों पर विचार करने की सलाह देते हैं, साथ ही जानवर की कई शल्य प्रक्रियाओं का सामना करने की क्षमता, अध्ययन यौगिकों के दोहराया प्रशासन की आवश्यकता होनी चाहिए ।
एंडोक्सिफेन प्रशासन के अलावा, यहां उल्लिखित तकनीक को लेप्टोमेनिंगियल सेल-विशिष्ट प्रमोटर के तहत रिपोर्टर जीन ले जाने वाले वायरस के वितरण के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, वर्तमान वितरण प्रणाली का उपयोग सेरेब्रोस्पाइनल द्रव प्रवाह10के तीव्र ट्रेसिंग के लिए किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, सेल ट्रैकर (सीए 700 डीए) या ड्वेटन फ्लोरेस्किन (सीए 3000 डीए) जैसे फ्लोरोसेंट ट्रेसर को सिस्टर्न मैग्ना के माध्यम से वितरित किया जा सकता है, और सिरिंज को यौगिक के जलसेक की दर पर नियंत्रण करने के लिए माइक्रोजोड़क पर रखा जा सकता है। प्रयोगों का पता लगाने में प्राकृतिक सेरेब्रोस्पाइनल द्रव आंदोलन की अत्यधिक अशांति से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण हो सकता है।
लेप्टोमेनिंगल कोशिकाएं क्लाउडिन-11 और टाइट जंक्शनों से जुड़े अन्य प्रोटीन ों को व्यक्त करती हैं, जो सबराक्नोइड अंतरिक्ष में रक्त-सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड बाधा की स्थापना और तरल पदार्थ और पोषक तत्वपरिसंन3के होमोस्टैटिक नियंत्रण में योगदान देती हैं। यहां उल्लिखित दृष्टिकोण को सख्ती से विनियमित सेरेब्रोस्पाइनल द्रव संरचना को बनाए रखने में उनकी ख्यात भूमिका की जांच करने के लिए बाधा के जंक्शनीय नियंत्रण में फंसाए गए जीन के सशर्त एब्लेशन के साथ जोड़ा जा सकता है । इसके अतिरिक्त, लेप्टोमेनिंग्स की कोशिकाएं विकास में भूमिका निभाती हैं, जहां वे बाह्य संकेत प्रदान करते हैं जो कॉर्टिकल न्यूरॉन्स5 की पीढ़ी में योगदान देते हैं और कैलसल कनेक्शन4के गठन में योगदान देते हैं। हमारी विधि को सही कॉर्टिकल विकास और अक्षीय पथखोज में लेप्टोमेनिंग्स की भूमिका में आगे की अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, नेसेरिया दिमागी बीमारियों जैसे बैक्टीरिया को मानव लेप्टोमेनिंगियल कोशिकाओं14से जुड़ने के लिए दिखाया गया है, और इस बीमारी के लिए पशु मॉडल बैक्टीरियल आक्रमण का अध्ययन करने के लिए विकसित किए गए हैं और परिणामस्वरूप न्यूरोलॉजिकल क्षति15,,16,हालांकि संक्रमण के लिए जिम्मेदार सतह लिगांड अभी पूरी तरह से निर्धारित किए गए हैं। हमारी तकनीक के साथ प्राप्त लेप्टोमेनिंगल कोशिकाओं का चयनात्मक पुनर्संयोजन बैक्टीरिया द्वारा उपयोग की जाने वाली आसंजन साइटों की पहचान में सहायता कर सकता है ताकि सबराक्नोइड अंतरिक्ष को संक्रमित किया जा सके। ध्यान दें, इसके द्वारा प्रस्तुत प्रोटोकॉल अतिरिक्त नैतिक और सुरक्षा प्रक्रियाओं है कि बैक्टीरियल संक्रमण आवश्यक बाहर ले जाने के लिए आवश्यक आवश्यकताओं के लिए खाते में संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है ।
निष्कर्ष में, यहां वर्णित इंट्रासिस्टर्नल इंजेक्शन एक सरल और अच्छी तरह से सहन किए गए सर्जिकल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जो जीन-संपादन दृष्टिकोणों या लेबल वाले अणुओं के जलसेक के साथ संयुक्त होने पर लेप्टोमेनिंगल और सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने का अवसर प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
इस अध्ययन स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्वीडिश कैंसर सोसायटी, सामरिक अनुसंधान के लिए स्वीडिश फाउंडेशन, Knut och ऐलिस Wallenbergs Stiftelse और स्टेम सेल और कारोलिंस्का संस्थान (StratRegen) में पुनर्योजी चिकित्सा में रणनीतिक अनुसंधान कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30 G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
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