Summary
Nous décrivons une injection intracisternale qui emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée au crâne, éliminant ainsi le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. L’approche peut être utilisée pour la cartographie du destin génétique et les manipulations des cellules leptoméningeales et pour le suivi du mouvement des fluides phériques.
Abstract
Le protocole décrit ici comment injecter des solutions en toute sécurité et manuellement par le biais de la cisterna magna tout en éliminant le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. Les protocoles précédemment publiés recommandent d’utiliser des aiguilles droites qui devraient être abaissées à un maximum de 1-2 mm de la surface durale. La chute soudaine de résistance une fois que la membrane durale a été perforée rend difficile le maintien de l’aiguille dans une position stable. Notre méthode, au lieu, emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée contre l’os occipital du crâne, empêchant ainsi la seringue de pénétrer dans le tissu après perforation de la membrane durale. La procédure est simple, reproductible, et ne cause pas d’inconfort durable chez les animaux opérés. Nous décrivons la stratégie d’injection intracisternale dans le contexte de la cartographie génétique du destin des cellules leptomeningeal vasculaires. La même technique peut, en outre, être utilisée pour répondre à un large éventail de questions de recherche, telles que l’examen du rôle des leptomeninges dans le neurodéveloppement et la propagation de la méningite bactérienne, par ablation génétique des gènes impliqués dans ces phénomènes. En outre, la procédure peut être combinée avec un système d’infusion automatisé pour une livraison constante et utilisé pour le suivi du mouvement du liquide phébrospin par injection de molécules étiquetées fluorescentes.
Introduction
Les cellules leptoméningéales sont une population fibroblaste-like de cellules organisées dans une fine couche superposant le cerveau et exprimant des gènes impliqués dans le collagène crosslinking (par exemple, Dcn et Lum), et dans l’établissement d’une barrière cerveau-méningeal (par exemple, Cldn11)1,2. Les cellules leptomeningeal sont impliquées dans un large éventail de fonctions physiologiques, du contrôle strict sur le drainage de fluide céphalochental3 à la conduite des progéniteurs neuraux dans le cerveau en développement4,5. Une étude récente a également proposé que les leptomeninges chez le nouveau-né peuvent abriter des cellules radiales ressemblant à des gliax qui migrent dans le parenchyme du cerveau et se développent en neurones corticaux fonctionnels6.
Les cellules leptoméningéales sont situées à proximité des astrocytes de surface et partagent avec eux, ainsi que d’autres astroglias parenchymiques, expression de connexin-30 (Cx30)7. La procédure chirurgicale décrite ci-dessous permet l’étiquetage généralisé et spécifique de ces cellules méningées par l’intermédiaire d’une livraison ponctuelle d’endoxifène dans la cisterna magna des souris transgéniques exprimant conditionnellement tdTomato dans les cellules Cx30 (c.-à-d., en utilisant un système CreER-loxP pour la cartographie du destin).+ Endoxifen est un métabolite actif de Tamoxifen et induit la recombinaison des cellules exprimant creER de la même manière que Tamoxifen. Il est, cependant, la solution recommandée pour l’application topique, car il se dissout dans 5-10% DMSO, au lieu de fortes concentrations d’éthanol. En outre, l’endoxifène ne traverse pas la barrière cerveau-méningeal, permettant ainsi une recombinaison spécifique des cellules leptomeningéales, sans étiquetage de la population cx30 sous-jacenteet astroglial (voir résultats représentatifs).
La technique présentée ici vise à injecter manuellement et en toute sécurité le composé dans le liquide phérépinal, via un accès direct à la cisterna magna. Contrairement à d’autres procédures plus invasives nécessitant la craniotomie, cette approche permet d’infuser des composés sans causer de dommages au crâne ou au parenchyme cérébral. Ainsi, il n’est pas associé à l’induction des réactions inflammatoires déclenchées par l’activation des cellules parenchymales de glia. Semblable à d’autres stratégies d’injection décrites avant8,9,10, l’approche actuelle repose sur l’exposition chirurgicale de la membrane dural atlanto-occipital couvrant la cisterna magna, après dissection émoussée des muscles du cou supergel. Cependant, contrairement à d’autres procédures, nous recommandons l’utilisation d’une aiguille pliée à la pointe, qui peut être stabilisée contre l’os occipital pendant l’administration. Ceci empêchera le risque que l’aiguille pénètre trop profondément et endommage le cervelet et le medulla sous-jacents.
Cette intervention chirurgicale est compatible avec les recherches de traçage de la lignée qui visent à cartographier les changements dans les identités cellulaires et les itinéraires de migration à travers les couches parenchymales. Il peut également être adapté aux études d’ablation génétique qui ont l’intention de sonder le rôle des cellules leptoménageesales dans la santé et la maladie, telles que leur contribution au développement cortical5 ou la propagation de la méningite bactérienne3,11. Enfin, il peut être utilisé pour suivre le mouvement des fluides phégonaux lorsqu’il est combiné avec la livraison de traceurs fluorescents chez les animaux de type sauvage.
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Protocol
Les interventions chirurgicales présentées par la présente ont été approuvées par Stockholms Norra Djurf’rsetiska Nâmnd et réalisées en accord avec les spécifications fournies par l’institut de recherche (Institut Karolinska, Suède).
REMARQUE: L’injection intracisternale peut être adaptée avec souplesse à de multiples fins de recherche. Nous présentons ci-dessous une procédure développée pour étiqueter efficacement les cellules leptomeningeales pour la cartographie du destin basée sur l’injection d’endoxifène dans une lignée de souris transgénique portant R26R-tdTomato12 et CreER, ce dernier sous le promoteur Cx3013. L’étiquetage de cette population de cellules peut être réalisé par injection de constructions virales en utilisant la même procédure décrite ci-dessous. Enfin, cette approche peut être utilisée pour le suivi du flux de liquide phébrospinal, par perfusion de traceurs fluorescents.
1. Préparation du système d’injection
REMARQUE: Nous recommandons d’effectuer la procédure dans une salle chirurgicale appropriée, et dans des conditions aseptiques. Les outils chirurgicaux peuvent être stérilisés à l’aide de chaleur (autoclave, stérilisateur de perles de verre) ou aseptisés à l’aide d’un désinfectant chimique de haut niveau s’ils sont sensibles à la chaleur. Rincer les instruments avant d’utiliser lors de l’utilisation de la désinfection chimique ou leur permettre de refroidir lorsqu’ils sont aseptisés avec de la chaleur.
- À l’aide de forceps, plier l’aiguille de la seringue d’injection à 30 degrés à 3 mm de la pointe.
REMARQUE: Utilisez des seringues Hamilton avec une aiguille biseautée de 30 G. - Préparer 1 mg/mL de solution endoxifène, dilué dans 10% DMSO et remplir la seringue avec l’aiguille pliée.
REMARQUE : Administrer 5 L du composé pour assurer une exposition généralisée des cellules méningées chez la souris adulte C57Bl/6j (vers 25-30 g), bien que des expériences pilotes qui testent différentes concentrations et volumes d’injection puissent être nécessaires pour traiter des animaux d’âges et de souches différents. - Ajuster le porte-tête de la souris de sorte que le morceau de bouche est à environ 30 degrés de la surface de la table chirurgicale.
REMARQUE: Un cadre stéréotaxique avec fixation à trois points (c.-à-d. les oreilles et la bouche) peut également être utilisé pour cette procédure. Dans ce cas, cependant, l’animal ne sera fixé qu’avec le morceau de bouche, tandis que les barres d’oreille peuvent être prolongées sous les membres antérieurs de l’animal et être utilisées pour soutenir le corps de l’animal pendant la procédure.
2. Induction de l’anesthésie
- Pour les anesthésiques injectables, utilisez les concentrations et les modes d’administration recommandés par l’unité vétérinaire de l’établissement local.
- Pour les anesthésiques par inhalation, tels que l’isoflurane, préparer l’unité d’administration selon les spécifications du fabricant.
- Avec l’isoflurane, placez la concentration du composé à 4% pour l’induction de l’anesthésie.
- Livraison de l’air à un taux de 400 ml/min.
- Laissez l’unité d’anesthésie remplir la chambre avec l’anesthésique pendant quelques minutes et placez la souris dans la chambre par la suite.
REMARQUE: Pour les expériences actuelles, nous avons utilisé des souris transgéniques adultes (2 mois et environ 30 g) mâles et femelles portant Cx30-CreER et R26R-tdTomato, et élevés sur un fond C57Bl/6j. - Surveillez l’animal lors de l’induction de l’anesthésie. Le modèle de respiration devrait ralentir lorsque la souris est sous anesthésie complète.
- Retirez l’animal de la chambre et vérifiez la suppression du réflexe de la patte en pinçant délicatement les pattes postérieures.
REMARQUE: Le réflexe peut encore être présent, mais retardé de quelques secondes. Si tel est le cas, placez l’animal dans la chambre jusqu’à ce que la suppression complète du réflexe de patte ait été réalisée. - Administrer l’analgésique (p. ex. Carprofène, 5 mg/kg par injection sous-cutanée) pour faciliter la prise en charge de la douleur postopératoire.
3. Positionnement de l’animal pour la procédure
- Fixer la tête de l’animal sur le porte-tête. Pour améliorer l’accessibilité à la cisterna magna, placez le corps de l’animal à environ 30 degrés de la surface de la table et de la tête intitulée vers le bas, pour établir un angle de 120 degrés avec le reste du corps et étendre l’arrière du cou pour faciliter l’accès à la cisterna magna(figure 1A).
- Ajouter des essuie-tout sous l’animal pour soutenir son corps tout au long de la procédure.
- Fixer l’anesthésie par le morceau de bouche et réduire la concentration d’isoflurane à 2,5 % et la livraison d’air à 200 ml/min.
- Appliquer la pommade ophtalmique.
4. Exposition de la Cisterna Magna
- Raser l’arrière du cou de l’animal et désinfecter la zone avec 70% d’éthanol et de bêtadine.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux, effectuer une incision de ligne médiane (environ 7 mm de longueur) à partir du niveau de l’os occipital et l’étendre postérieurement.
- Séparez doucement les tissus conjonctifs superficiels et les muscles du cou tirant latéralement à partir de la ligne médiane avec de fines pincettes à pointe. Ceci exposera la membrane durale superposant la magna de cisterna, formée comme triangle inversé.
- Utilisez des lances d’absorption stériles ou des cotons-tiges pour contrôler les saignements qui en résultent.
- Placez un petit séparateur chirurgical pour maintenir les muscles du cou mis de côté et permettre la visualisation de la magna cisterna tout au long de la procédure.
5. Injection intracisternale
- Pour accéder à la magna cisterna, identifiez l’extrémité cautale de l’os occipital et insérez l’aiguille qui était auparavant pliée immédiatement en dessous.
REMARQUE: Il y aura une baisse soudaine de la résistance que la membrane durale est perforée. Cependant, la pointe de l’aiguille ne pénétrera que légèrement sous la surface méningée, grâce à sa forme crochetée. - Une fois que la dura a été perforée, laissez la pointe pliée de l’aiguille pénétrer sous la surface durale en tirant doucement la seringue vers le haut et parallèle au corps de l’animal, afin de « crocheter » l’aiguille au crâne (voir la figure 1B). Cela assurera une meilleure stabilité et empêchera l’aiguille de pénétrer plus profondément, évitant ainsi le risque d’endommager le cervelet sous-jacent ou la médulle.
- Injecter le composé lentement pour éviter toute interférence avec le flux naturel du liquide phérépinal.
REMARQUE: Selon le but de l’expérience, le taux d’infusion peut varier. Si un taux d’infusion lent et régulier est nécessaire (p. ex., lors de l’utilisation de la procédure pour retracer le mouvement du liquide phéxique), il peut être conseillé d’utiliser un système automatisé de microinfusion en combinaison avec la seringue. - Après l’injection, laissez l’aiguille reposer sur place pendant 1 min et retirez-la soigneusement. Utilisez des forceps à pointe fine pour faciliter la rétraction de l’aiguille de sa position accrochée.
REMARQUE: L’utilisation d’une aiguille mince (p. ex., 30 G) n’entraîne pas de dommages importants à la membrane méningéale et à l’écoulement du liquide phérépinal qui en résulte. Si de plus grandes tailles d’aiguilles sont nécessaires, nous recommandons d’arrêter la fuite de liquide en appliquant une pression au site d’injection à l’aide d’une pointe de coton stérile.
6. Conclusion de la procédure et des soins postopératoires
- Retirez le séparateur et laissez les muscles revenir à leur position d’origine en superposant la membrane durale.
- Fermez l’incision cutanée à l’aide de quelques gouttes d’adhésif cyanoacrylate.
REMARQUE: Alternativement, utiliser des sutures absorbables (p. ex., 5-0 sutures de vicryl) et fermer l’incision de la peau avec des points interrompus. - Appliquer l’anesthésique local (p. ex., 100 L de 5 % de lidocaïne) sur le site d’incision.
- Retirer l’animal du support et placer dans une cage propre placée sur un coussin chauffant. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne conscience.
REMARQUE: On ne s’attend pas à ce que la procédure cause une douleur ou une détresse de longue durée chez l’animal. Néanmoins, la souris doit être surveillée de près pendant les premiers jours postopératoires et des mesures de soulagement de la douleur peuvent être prises chaque fois que cela est jugé nécessaire, et conformément aux recommandations fournies par l’unité vétérinaire de votre établissement.
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Representative Results
L’injection intracisternale d’endoxifène chez des souris transgéniques exprimant CreER sous le promoteur Cx3013 et un reporter fluorescent inductible permet une recombinaison spécifique des cellules leptoméningéales sans étiqueter la surface voisine Cx30-exprimant surface et astrocytes parenchymal dans le cortex (Figure 1). Afin d’accéder à la cisterna magna, l’animal anesthésié est positionné avec son corps et sa tête à un angle d’environ 120 degrés, permettant ainsi d’étirer l’arrière de son cou(figure 1A). La partie atlanto-occipital de la membrane durale est alors exposée par dissection émoussée des muscles du cou, obtenant ainsi l’accès à la magna cisterna sous-jacente. Une injection manuelle sécuritaire est effectuée avec une aiguille pliée à environ 30 degrés à 3 mm de la pointe. Cela permet de tenir la seringue contre l’os occipital du crâne, améliorant ainsi la stabilité pendant l’administration(figure 1B). Profitant du mouvement physiologique du liquide phérique, la solution endoxifène est distribuée dans tout l’espace sous-arachnoïdien pour recombiner efficacement les cellules leptomeningales superposant les ampoules olfactives, le cortex et le cervelet(figure 1C). Comme le démontre la figure 1, la solution ne traverse pas la barrière méningée du cerveau et n’entre pas en contact avec les cellules astrogliales du parenchyme, par opposition à l’administration systémique par gavage oral (2 mg/mL par jour, cinq jours consécutifs; Figure 1C-E).
Figure 1 : Étiquetage spécifique des cellules leptomeningéales par injection intracisternale d’endoxifène. Le groupe A et B illustrent la procédure développée pour l’administration intracisternale. Afin d’accéder à la magna cisterna, l’arrière du cou doit être étiré. L’animal anesthésié est donc placé à un angle approximatif de 120 degrés entre le corps et la tête, qui est incliné vers le bas (A). L’aiguille accrochée permet de fixer la seringue au crâne et de procéder en toute sécurité à une administration manuelle de la solution (B). Le panneau C affiche une section sagittale du cerveau après administration intracisternale de endoxifen dans un modèle transgénique de souris portant CreER sous le promoteur de Cx30 et expression induible du journaliste fluorescent de tdTomato. L’astérisque (MD) marque le site d’injection et démontre l’absence de dommages opérationnels après la procédure. Endoxifen induit sélectivement la recombinaison génétique et l’expression des gènes reporter dans les cellules de la couche méningée superposant l’ampoule olfactive (Ob), le cortex (Ctx) et le cervelet (Cb). Seuls quelques astrocytes dans le cerveau moyen (tête de flèche) se recombinent après la livraison intracisternale de endoxifen. Les panneaux D-F sont des grossissements de la zone en boîte en C chez les animaux qui ont été traités avec la solution du véhicule (D), soumis à l’injection intracisternale de endoxifen (E), ou traités systématiquement par gavage oral (F). Alors que l’administration intracisternale étiquette spécifiquement les cellules des leptomeninges, la livraison systémique conduit également à la recombinaison des astrocytes Cx30-exprimant dans toutes les couches corticales (L1 à L6). Le panneau G illustre la recombinaison des cellules leptomeningeal (astérisque), identifiées par la réactivité de Pdgfra, après injection intracisternale. En revanche, les astrocytes de surface (pointe de flèche) et parenchymal (flèche) exprimant Gfap restent non étiquetés. Barres d’échelle à 1 000 m(C),150 m(D-F)et 40 m(G). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ici présente une procédure simple et reproductible pour étiqueter les cellules leptomeningeales pour la cartographie du destin. Nous utilisons l’injection intracisternale d’endoxifen, un métabolite actif de Tamoxifen, pour induire l’expression du journaliste fluorescent de tdTomato dans Cx30-CreER ; R26R-tdTomato souris12,13.
Par rapport à d’autres protocoles utilisés pour accéder au liquide phébrospinal par le cisterna magna9, notre approche assure une administration manuelle sûre grâce à l’utilisation d’une aiguille pliée qui peut être stabilisée à l’os occipital du crâne. Une fois que la membrane durale de la cisterna magna est perforée, il y a une baisse soudaine de résistance. À ce stade, d’autres protocoles recommandent d’abaisser l’aiguille à un maximum de 1-2 mm de la surface durale et de le maintenir manuellement dans une position stable tout au long de la procédure9. Contrairement à une aiguille droite, l’aiguille accrochée est fixée au crâne et ne peut pas pénétrer plus profondément dans le tissu, éliminant ainsi le risque d’endommager le cervelet ou la médulle sous-jacente. Notre système crocheté permet une administration plus sûre de la solution, en particulier lors de l’utilisation d’un taux de perfusion lent.
On ne s’attend pas à ce que la procédure décrite ici cause un inconfort durable à l’animal opéré. Il faut toutefois faire attention à l’administration de grands volumes de solution. Un taux d’accouchement rapide peut entraîner des altérations de la pression intracrânienne et le développement de symptômes neurologiques chez la souris. Nous suggérons d’injecter des volumes allant jusqu’à 5-10 ll pour éviter ce risque ou assembler la seringue sur un micromanipulateur qui a le contrôle sur le taux de livraison. Ceci est particulièrement important lors de l’adaptation de cette procédure à l’étude du mouvement de fluide rébrospinal. Il est recommandé d’éviter l’injection manuelle et d’utiliser un taux d’infusion lent (p. ex., 1 l/min) pour prévenir la perturbance excessive du flux physiologique. En outre, le protocole actuel est conçu pour effectuer une seule injection intracisternale, qui étiquette efficacement les cellules leptomeningéales. Nous recommandons d’envisager des spécifications éthiques, ainsi que la capacité de l’animal à résister à de multiples interventions chirurgicales, si l’étude nécessite une administration répétée de composés.
En plus de l’administration endoxifen, la technique décrite ici peut être combinée avec la livraison de virus portant des gènes de journaliste sous un promoteur leptomeningeal cellule spécifique. En outre, le système de livraison actuel peut être utilisé pour le traçage aigu du flux de liquide rébrospinal10. À cette fin, les traceurs fluorescents tels que Cell Tracker (environ 700 Da) ou Dextran Fluorescin (vers 3000 Da) peuvent être livrés par la cisterna magna, et la seringue peut être montée sur un micromanipulateur pour permettre le contrôle sur le taux d’infusion du composé. Ceci peut être important afin d’éviter la perturbation excessive du mouvement naturel de fluide phébrospinal dans les expériences de traçage.
Les cellules leptomeningeal expriment la claudine-11 et d’autres protéines associées aux jonctions serrées, qui contribuent à l’établissement d’une barrière liquide céphalo-céphalo-rachidienne dans l’espace sous-arachnoïdien et au contrôle homéostatique de la circulation des fluides et des nutriments3. L’approche décrite ici peut être combinée avec l’ablation conditionnelle des gènes impliqués dans le contrôle de jonction de la barrière pour sonder leur rôle putatif dans le maintien de la composition strictement réglementée de fluide céphalérienne. En outre, les cellules des leptomeninges jouent un rôle dans le développement, où elles fournissent des signaux extrinsèques qui contribuent à la génération de neurones corticaux5 et à la formation de connexions callosales4. Notre méthode peut également être adaptée pour obtenir un aperçu plus approfondi du rôle des leptomeninges dans le développement cortical correct et le pathfinding axonal. Enfin, des bactéries telles que Neisseria meningitidis ont été montrés à se fixer aux cellules leptomeningeales humaines14, et les modèles animaux pour la maladie ont été développés pour étudier l’invasion bactérienne et les dommages neurologiques résultant15,16, bien que les ligands de surface responsables de l’infection ne sont pas encore entièrement déterminés. La recombinaison sélective des cellules leptomeningéales obtenues avec notre technique pourrait faciliter l’identification des sites d’adhérence utilisés par les bactéries pour infecter l’espace sous-arachnoïdais. Il convient de noter que le protocole présenté par la présente peut nécessiter des modifications pour tenir compte des exigences éthiques et de sécurité supplémentaires nécessaires à l’exécution des procédures qui impliquent des infections bactériennes.
En conclusion, l’injection intracisternale décrite ici représente une approche chirurgicale simple et bien tolérée qui offre la possibilité d’étudier un large éventail de fonctions de fluide leptomeningeal et phérique, lorsqu’elles sont combinées avec des approches d’édition génétique ou l’infusion de molécules étiquetées.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions du Conseil suédois de la recherche, de la Société suédoise du cancer, de la Fondation suédoise pour la recherche stratégique, de Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse et du Programme stratégique de recherche en cellules souches et en médecine régénérative à l’Institut Karolinska (StratRegen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30 G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
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