Summary
Vi beskriver en intracisternal injektion som använder en nål böjd vid spetsen som kan stabiliseras på skallen, vilket eliminerar risken för skador på den underliggande parenkym. Metoden kan användas för genetisk öde kartläggning och manipulationer av leptomeningeal celler och för att spåra ryggmärgsvätskan rörelse.
Abstract
Det protokoll som beskrivs här beskriver hur man säkert och manuellt injicera lösningar genom cisterna magna samtidigt som risken för skador på den underliggande parenkym. Tidigare publicerade protokoll rekommenderar att du använder raka nålar som ska sänkas till maximalt 1-2 mm från hamburgytan. Den plötsliga minskningen av motståndet när hamburgmembranet har punkterats gör det svårt att hålla nålen i en stadig position. Vår metod använder istället en nål böjd vid spetsen som kan stabiliseras mot skallens occipitalben, vilket förhindrar att sprutan tränger in i vävnaden efter perforering av hamburgmembranet. Förfarandet är enkelt, reproducerbart och orsakar inte långvarigt obehag hos de opererade djuren. Vi beskriver intracisternal injektion strategi i samband med genetiska öde kartläggning av vaskulära leptomeningeal celler. Samma teknik kan dessutom användas för att ta itu med ett brett spektrum av forskningsfrågor, såsom sondering av rollen som leptomeninges i neuroutveckling och spridning av bakteriell hjärnhinneinflammation, genom genetisk ablation av gener som är förmodat inblandade i dessa fenomen. Dessutom kan proceduren kombineras med ett automatiserat infusionssystem för en konstant leverans och användas för att spåra cerebrospinalvätska rörelse via injektion av fluorescerande märkta molekyler.
Introduction
Leptomeningeal celler är en fibroblast-liknande population av celler organiserade i ett tunt lager överlagring hjärnan och uttrycka gener inblandade i kollagen crosslinking (t.ex., Dcn och Lum), och i inrättandet av en hjärna-meningeal barriär (t.ex., Cldn11)1,2. Leptomeningeal celler är inblandade i ett brett spektrum av fysiologiska funktioner, från strikt kontroll över ryggmärgsvätskan dränering3 till vägledning av neurala förfäder i den utvecklande hjärnan4,5. En färsk studie har också föreslagit att leptomeninges hos nyfödda kan hysa radiella glia-liknande celler som migrerar in i hjärnan parenkym och utvecklas till funktionella när nervceller6.
Leptomeningeal celler ligger i närheten av ytan astrocyter och dela med dem, liksom andra parenkymala astroglia, uttryck för connexin-30 (Cx30)7. Det kirurgiska ingrepp som beskrivs nedan tillåter utbredd och specifik märkning av dessa meningeal celler via en engångsleverans av endoxifen i cisterna magna av transgena möss villkorligt uttrycker tdTomato i Cx30+ celler (dvs. med hjälp av en CreER-loxP system för öde kartläggning). Endoxifen är en aktiv metabolit av Tamoxifen och inducerar rekombination av CreER-uttrycksceller på samma sätt som Tamoxifen gör. Det är dock den rekommenderade lösningen för lokal applicering eftersom det löser sig i 5-10% DMSO, i stället för höga koncentrationer av etanol. Dessutom korsar endoxifen inte hjärnhinnebarriären, vilket möjliggör specifik rekombination av leptomeningeal celler, utan märkning av den underliggande Cx30+ astroglial befolkningen (se Representativa resultat).
Den teknik som presenteras här syftar till att manuellt och säkert injicera föreningen i ryggmärgsvätskan, via direkt tillgång till cisterna magna. Till skillnad från andra, mer invasiva förfaranden som kräver craniotomy, detta tillvägagångssätt gör det möjligt att ingjuta föreningar utan att orsaka skador på skallen eller hjärnan parenkym. Således är det inte förknippat med induktion av inflammatoriska reaktioner som utlöses av aktivering av parenkymala gliaceller. I likhet med andra injektion strategier som beskrivs före8,9,10, förlitar sig den nuvarande metoden på kirurgisk exponering av atlanto-occipital hamburg membranet som täcker cisterna magna, efter trubbig dissekering av överliggande hals muskler. Men till skillnad från andra förfaranden rekommenderar vi användning av en nål böjd vid spetsen, som kan stabiliseras mot occipitalbenet under administrering. Detta förhindrar risken för att nålen tränger in för djupt och skadar det underliggande lillhjärnan och medulla.
Detta kirurgiska ingrepp är kompatibelt med härstamningsspårningsundersökningar som syftar till att kartlägga förändringar i cellidentiteter och migreringsvägar genom parenkymala lager. Det kan också anpassas till genetiska ablation studier som avser att undersöka rollen av leptomeningeal celler i hälsa och sjukdom, såsom deras bidrag till kortikal utveckling5 eller spridning av bakteriell hjärnhinneinflammation3,11. Slutligen kan den användas för att spåra cerebrospinalvätska rörelse i kombination med leverans av fluorescerande spårämnen i wildtype djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De kirurgiska ingrepp som presenteras härmed har godkänts av Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd och genomfördes i enlighet med specifikationer från Forskningsinstitutet (Karolinska Institutet).
OBS: Intracisternal injektion kan flexibelt anpassas för flera forskningsändamål. Vi presenterar nedan ett förfarande som utvecklats för att effektivt märka leptomeningeal celler för öde kartläggning baserat på injektion av endoxifen i en transgen muslinje som transporterar R26R-tdTomato12 och CreER, den senare under Cx30 promotorn13. Märkning av denna population av celler kan uppnås genom injektion av viruskonstruktioner med samma förfarande som beskrivs nedan. Slutligen kan detta tillvägagångssätt användas för att spåra ryggmärgsvätskan flöde, genom infusion av fluorescerande spårämnen.
1. Beredning av injektionssystemet
OBS: Vi rekommenderar att du utför proceduren i ett lämpligt operationsrum och under aseptiska förhållanden. Kirurgiska verktyg kan steriliseras med hjälp av värme (autoklav, glas pärla autoklaver) eller saneras med hjälp av en hög nivå kemiskt desinfektionsmedel om de är värmekänsliga. Skölj instrumenten före användning när de använder kemisk desinfektion eller låt dem svalna när de saneras med värme.
- Böj injektionsprutans nål med hjälp av pincett till 30° vid 3 mm från spetsen.
OBS: Använd Hamilton sprutor med en 30 G avfasad nål. - Förbered 1 mg/ml endoxifenlösning, utspädd i 10% DMSO och fyll sprutan med den böjda nålen.
OBS: Administrera 5 μl av föreningen för att säkerställa utbredd exponering av meningealceller hos den vuxna C57Bl/6j-musen (ca 25-30 g), även om pilotexperiment som testar olika koncentrationer och injektionsvolymer kan vara nödvändiga vid behandling av djur i olika åldrar och stammar. - Justera mushuvudhållaren så att munstycket är ungefär 30° från operationsbordets yta.
OBS: En stereotaktisk ram med trepunktsfixering (dvs. öron och mun) kan också användas för detta förfarande. I detta fall kommer dock djuret endast att fixeras med munbiten, medan öronstänger kan förlängas under djurets framben och användas för att stödja djurets kropp under förfarandet.
2. Induktion av anestesi
- För injicerbara anestetika, använd koncentrationer och administreringssätt som rekommenderas av veterinärenheten vid den lokala institutionen.
- För inhalationsanestetika, såsom isofluran, bered administreringsenheten enligt tillverkarens specifikationer.
- Med isofluran, ställ in koncentrationen av föreningen på 4% för induktion av anestesi.
- Leverera luft med en hastighet av 400 ml/min.
- Låt anestesienheten fylla kammaren med bedövningsmedlet i några minuter och placera musen i kammaren efteråt.
OBS: För de nuvarande experimenten har vi använt vuxna (>2 månader gamla och cirka 30 g) han- och hontegena möss som bär Cx30-CreER och R26R-tdTomato, och föds upp på en C57Bl/6j-bakgrund. - Övervaka djuret under induktion av anestesi. Andningsmönstret bör sakta ner när musen är under full anestesi.
- Ta bort djuret från kammaren och kontrollera undertryckandet av tassreflexen genom att försiktigt nypa baktassarna.
OBS: Reflexen kan fortfarande vara närvarande men fördröjd ett par sekunder. Om så är fallet, placera djuret tillbaka i kammaren tills fullständig undertryckande av tassreflexen har uppnåtts. - Administrera smärtstillande medel (t.ex.
3. Placera djuret för förfarandet
- Fäst djurets huvud på huvudhållaren. För att förbättra tillgängligheten till cisterna magna, placera djurets kropp på ca 30 ° från ytan av bordet och huvudet med titeln nedåt, för att fastställa en vinkel på 120 ° med resten av kroppen och förlänga baksidan av halsen för att underlätta tillgången till cisterna magna (figur 1A).
- Lägg pappershanddukar under djuret för att stödja sin kropp under hela förfarandet.
- Säkra anestesitillförseln genom munbiten och minska isoflurankoncentrationen till 2,5 % och lufttillförseln till 200 ml/min.
- Applicera oftalmisk salva.
4. Exponering av Cisterna Magna
- Raka baksidan av djurets hals och sanera området med 70% etanol och Betadin.
- Använd kirurgisk sax, utför ett mittlinjesnitt (ca 7 mm i längd) som börjar på nivån för occipitalbenet och förlänger det posteriort.
- Separera försiktigt ytlig bindväv och nackmuskler som drar åt sidan från mittlinjen med fina spetspincett. Detta kommer att exponera hamburgmembranet som täcker cisterna magna, formad som en inverterad triangel.
- Använd sterila absorptionspjutsar eller bomullspinne för att kontrollera eventuella blödningar som följer av detta.
- Placera en liten kirurgisk separator för att upprätthålla nackmusklerna dras åt sidan och möjliggöra visualisering av cisterna magna under hela förfarandet.
5. Intracisternal Injektion
- För att få tillgång till cisterna magna, identifiera caudal änden av occipital ben och sätt in nålen som tidigare böjdes omedelbart under.
OBS: Det kommer att bli en plötslig minskning av motståndet när hamburgmembranet punkteras. Dock kommer spetsen på nålen bara tränga något under meningeal ytan, tack vare sin krokade form. - När duran har perforerats, låt nålens böjda spets tränga in under hamburgytan genom att försiktigt dra sprutan uppåt och parallellt med djurets kropp, för att "haka" nålen mot skallen (se figur 1B). Detta kommer att säkerställa bättre stabilitet och kommer att förhindra att nålen tränger djupare, vilket undviker risken för att skada den underliggande lillhjärnan eller medulla.
- Injicera föreningen långsamt för att undvika störningar med ryggmärgsvätskan naturliga flöde.
OBS: Beroende på syftet med experimentet kan infusionshastigheten variera. Om långsam och stadig infusionshastighet krävs (t.ex. när du använder proceduren för att spåra cerebrospinalvätskans rörelse) kan det vara lämpligt att använda ett automatiserat mikrofusionssystem i kombination med sprutan. - Efter injektionen, låt nålen vila på plats i 1 min och ta försiktigt bort den. Använd fina spetstångspip för att underlätta tillbakadragningen av nålen från sitt krokade läge.
OBS: Användning av en tunn nål (t.ex. 30 G) leder inte till betydande skador på meningealmembranet och därav följande utflöde av cerebrospinalvätskan. Om större nålstorlekar krävs rekommenderar vi att du stoppar läckage av vätska genom att trycka på injektionsstället med hjälp av en steril bomullsspets.
6.
- Ta bort separatorn och låt musklerna gå tillbaka till sin ursprungliga position överliggande hamburgmembranet.
- Stäng hudsnittet med några droppar cyanoakrylatlim.
OBS: Alternativt kan du använda absorberbara suturer (t.ex. 5-0 vicryl suturer) och stäng hudsnittet med avbrutna stygn. - Applicera lokalbedövning (t.ex. 100 μl 5 % lidokain) vid snittplatsen.
- Ta bort djuret från hållaren och placera i en ren bur placerad på en värmedyna. Övervaka djuret tills det återfår medvetandet.
OBS: Förfarandet förväntas inte orsaka långvarig smärta eller ångest hos djuret. Musen bör dock övervakas noga under de första postoperativa dagarna och smärtlindringsåtgärder kan vidtas när det anses nödvändigt, och i enlighet med rekommendationer från veterinärenheten vid din institution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intracisternas injektion av endoxifen hos transgena möss som uttrycker CreER under Cx30-promotorn13 och en inducibel fluorescerande reporter möjliggör specifik rekombination av leptomeningealceller utan att märka den angränsande Cx30-uttrycker ytan och parenkymala astrocyter i cortex (figur 1). För att få tillgång till cisterna magna placeras det sövda djuret med sin kropp och sitt huvud i en vinkel på cirka 120°, vilket gör att nackens baksida kan sträckas ut (figur 1A). Den atlanto-occipital delen av hamburgmembran exponeras sedan genom trubbig dissekering av nackmusklerna, vilket får tillgång till den underliggande cisterna magna. En säker manuell injektion utförs med en nål böjd till ca 30° vid 3 mm från spetsen. Detta gör det möjligt att hålla sprutan mot kraniets occipitalben, vilket förbättrar stabiliteten under administrering (figur 1B). Med hjälp av den fysiologiska rörelsen hos cerebrospinalvätskan distribueras endoxifenlösningen i hela subarachnoidutrymmet för att effektivt kombinera leptomeningealceller som överlägger luktlampor, cortex och lillhjärnan (figur 1C). Som framgår av figur 1passerar lösningen inte hjärnhinnebarriären och kommer inte i kontakt med parenkymans astrogliala celler, i motsats till systemisk administrering genom oral sondmatning (2 mg/ml per dag, fem på varandra följande dagar; Bild 1C-E).
Figur 1: Särskild märkning av leptomeningealceller via intracisternal injektion av endoxifen. Panel A och B illustrerar det förfarande som utvecklats för intracisternal administration. För att få tillgång till cisterna magna, nacken bör sträckas. Det sövda djuret är därför placerat i en ungefärlig vinkel på 120° mellan kroppen och huvudet, som lutas nedåt (A). Den hakade nålen gör det möjligt att fästa sprutan mot skallen och att säkert fortsätta med en manuell administrering av lösningen (B). Panel C visar en sagittal del av hjärnan efter intracisternal administrering av endoxifen i en transgen mus modell som transporterar CreER under Cx30 promotorn och ofrånkomliga uttryck för tdTomato fluorescerande reporter. Asterisken (*) markerar injektionsstället och visar att det inte finns någon avgörande skada efter ingreppet. Endoxifen inducerar selektivt genetisk rekombination och reporter genuttryck i celler i meningealskiktet överliggande luktbulben (Ob), cortex (Ctx) och lillhjärnan (Cb). Endast ett fåtal astrocyter i mellanhjärnet (pilspetsen) blir rekombinerade efter intracisternal leverans av endoxifen. Panelerna D-F är förstoringar av det förpackade området i C hos djur som behandlats med fordonslösning (D),som utsätts för intracisternal injektion av endoxifen (E), eller behandlas systemiskt genom oral sondmatning (F). Medan intracisternal administration specifikt etiketter celler av leptomeninges, systemisk leverans leder också till rekombination av Cx30-uttrycker astrocyter i hela när skikt (L1 till L6). Panel G illustrerar rekombination av leptomeningeal celler (asterisk), identifieras genom Pdgfra reaktivitet, efter intracisternal injektion. Däremot förblir ytan (pilspetsen) och parenkymala (pil) astrocyter som uttrycker Gfap intemärkt. Skalstänger = 1 000 μm (C), 150 μm (D-F) och 40 μm (G). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här presenterar en enkel och reproducerbar procedur för att märka leptomeningeal celler för öde kartläggning. Vi använder intracisternal injektion av endoxifen, en aktiv metabolit av Tamoxifen, för att inducera uttryck av tdTomato fluorescerande reporter i Cx30-CreER; R26R-tdTomato möss12,13.
Jämfört med andra protokoll som används för att få tillgång till ryggmärgsvätskan genom cisterna magna9,säkerställer vår metod en säker manuell administrering tack vare användning av en böjd nål som kan stabiliseras till skallens occipitalben. När cisternas magnas hamburgmembran är perforerat minskar motståndet plötsligt. Vid denna punkt rekommenderar andra protokoll att nålsänkningen sänks till högst 1-2 mm från hamburgytan och håller den manuellt i ett stabilt läge under hela proceduren9. I motsats till en rak nål, den krokade nålen är säkrad i skallen och kan inte tränga djupare i vävnaden, vilket eliminerar risken för att skada den underliggande lillhjärnan eller medulla. Vårt anslutna system möjliggör en säkrare administrering av lösningen, särskilt när du använder en långsam infusionshastighet.
Det förfarande som beskrivs här förväntas inte orsaka långvarigt obehag för det opererade djuret. Var dock försiktig när man administrerar stora mängder lösning. En snabb leveranshastighet kan leda till förändringar i intrakraniellt tryck och utveckling av neurologiska symtom i musen. Vi föreslår att du injicerar volymer upp till 5-10 μL för att undvika denna risk eller montera sprutan på en mikromanipulator som har kontroll över leveranshastigheten. Detta är särskilt viktigt när man anpassar detta förfarande till studiet av ryggmärgsvätskan rörelse. Det rekommenderas att du undviker manuell injektion och använder en långsam infusionshastighet (t.ex. 1 μl/min) för att förhindra överdriven störning av det fysiologiska flödet. Dessutom är det nuvarande protokollet utformat för att utföra en enda intracisternal injektion, som effektivt etiketter leptomeningeal celler. Vi rekommenderar att överväga etiska specifikationer, liksom djurets förmåga att motstå flera kirurgiska ingrepp, bör studien kräver upprepad administrering av föreningar.
Förutom endoxifen administration, den teknik som beskrivs här kan kombineras med leverans av virus som transporterar reporter gener under en leptomeningeal cell-specifik promotor. Dessutom kan det nuvarande leveranssystemet användas för akut spårning av ryggmärgsvätskanflöde 10. För detta ändamål kan fluorescerande spårämnen som Cell Tracker (ca. 700 Da) eller Dextran Fluorescin (ca 3000 Da) levereras genom cisterna magna, och sprutan kan monteras på en mikromanipulator för att möjliggöra kontroll över infusionshastigheten av föreningen. Detta kan vara viktigt för att undvika överdriven störning av den naturliga ryggmärgsvätskan rörelse i spårning experiment.
Leptomeningeal celler express claudin-11 och andra proteiner i samband med snäva korsningar, som bidrar till inrättandet av en blod-cerebrospinal vätska barriär i subarachnoid utrymme och till homeostatisk kontroll av vätska och näringsämnen cirkulation3. Den metod som beskrivs här kan kombineras med villkorade ablation av gener inblandade i junctional kontroll av barriären för att sond deras förmodade roll i att upprätthålla strikt reglerade ryggmärgsvätskan sammansättning. Dessutom, celler från leptomeninges spelar en roll i utvecklingen, där de ger intrinsikala signaler som bidrar till uppkomsten av när nervceller5 och bildandet av callosal anslutningar4. Vår metod kan också anpassas för att få ytterligare insikt i leptomeninges roll i korrekt kortikal utveckling och axonal patobildning. Slutligen, bakterier som Neisseria meningitidis har visat sig fästa på mänskliga leptomeningeal celler14, och djurmodeller för sjukdomen har utvecklats för att studera bakteriell invasion och resulterande neurologiska skador15,16, även om ytan ligander som ansvarar för infektionen är ännu inte helt bestämd. Selektiv rekombination av leptomeningeal celler uppnås med vår teknik kan stöd identifiering av vidhäftning platser som används av bakterier för att infektera subarachnoid utrymme. Observera att det protokoll som presenteras härmed kan kräva ändringar för att ta hänsyn till ytterligare etiska krav och säkerhetskrav som är nödvändiga för att genomföra förfaranden som medför bakteriella infektioner.
Sammanfattningsvis utgör intracisternal injektion häri beskrivs en enkel och väl tolererad kirurgisk metod som ger möjlighet att undersöka ett brett spektrum av leptomeningeal och ryggmärgsvätska funktioner, i kombination med gen-redigering metoder eller infusion av märkta molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Studien har fått stöd av anslag från Vetenskapsrådet, Cancerfonden, Stiftelsen för strategisk forskning, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse och det strategiska forskningsprogrammet för stamceller och regenerativ medicin vid Karolinska Institutet (StratRegen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30 G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins? FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
