Summary
We presenteren een RT-LAMP test voor de detectie van TiLV in tilapia vissen met behulp van eenvoudige instrumenten over een relatief korte periode van tijd in vergelijking met conventionele RT-PCR technieken. Dit protocol kan helpen bij de bestrijding van de epidemische verspreiding van TiLVD, vooral in ontwikkelingslanden.
Abstract
Tilapia lake virus disease (TiLVD), een opkomende virale ziekte in tilapia veroorzaakt door het tilapia meer virus (TiLV), is een aanhoudende uitdaging in de aquacultuur-industrie die heeft geresulteerd in de massale morbiditeit en mortaliteit van tilapia in vele delen van de wereld. Een effectieve, snelle en nauwkeurige diagnostische test voor TiLV-infectie is daarom noodzakelijk om de eerste infectie op te sporen en de verspreiding van de ziekte in de aquacultuurlandbouw te voorkomen. In deze studie wordt een zeer gevoelige en praktische reverse transcription loop-gemedieerde isothermale versterking (RT-LAMP) methode gepresenteerd om tilapia lake virus in visweefsel op te sporen. Een vergelijking van de RT-qPCR en RT-LAMP testen van geïnfecteerde monsters bleek positieve resultaten in 63 (100%) en 51 (80,95%) respectievelijk monsters. Bovendien bleek uit een analyse van niet-geïnfecteerde monsters dat alle 63 niet-geïnfecteerde weefsels negatieve resultaten opleverden voor zowel de RT-qPCR als de RT-LAMP-test. De kruisreactiviteit met vijf ziekteverwekkers in tilapia werd geëvalueerd met behulp van RT-LAMP, en alle tests toonden negatieve resultaten. Zowel de lever en slijm monsters verkregen van besmette vissen toonde vergelijkbare resultaten met behulp van de RT-LAMP methode, wat suggereert dat slijm kan worden gebruikt in RT-LAMP als een niet-dodelijke test om te voorkomen dat het doden van vis. Tot slot toonden de resultaten aan dat de gepresenteerde RT-LAMP-test een effectieve methode biedt voor TiLV-detectie in tilapiaweefsel binnen 1 uur. De methode wordt daarom aanbevolen als een screening instrument op boerderijen voor de snelle diagnose van TiLV.
Introduction
Tilapia lake virus disease (TiLVD) is een virale ziekte in tilapia(Oreochromis spp.) die naar verluidt tilapia sterfgevallen veroorzaakt in veel regio's van de wereld, waaronder Azië1,,2, Afrika en Amerika. De ziekte werd voor het eerst erkend tijdens de massale sterfte van tilapia in 2009 in Israël, waar het aantal wilde tilapia in het Kinneretmeer drastisch kelderde van 257 tot 8 ton per jaar2. De ziekte wordt veroorzaakt door het tilapiameervirus (TiLV), dat aan de familie Amnoonviridae is toegewezen als een nieuw geslacht Tilapinevirus en een nieuwe soort Tilapia tilapinevirus3. Genetische karakterisering van TiLV toonde aan dat het virus is een nieuwe omhuld, negatief-zin, single-stranded RNA virus dat 10 segmenten codering 10 eiwitten1,2,4. Verschillende soorten tilapia in het geslacht Sarotherodon, Oreochromis, en Tilapine en andere warmwatervissen (bijvoorbeeld reuzengourami (Osphronemus goramie))zijn vatbaar gebleken voor TiLV2,5. Momenteel blijft dit virus zich wereldwijd verspreiden, mogelijk door de beweging van besmette levende vissen6,7, terwijl het risico van virale overdracht via bevroren tilapia of het product ervan beperkt is8. Aanzienlijke sterfte als gevolg van TiLV-infectie heeft het potentieel om een aanzienlijk schadelijk economisch effect op de tilapia-industrie hebben. Bijvoorbeeld, de economische impact van de zomer sterfte syndroom in Egypte in verband met TiLV infectie werd berekend op US $ 100 miljoen9. Daarom is het belangrijk om een snelle en goede diagnostische methode te ontwikkelen om de bestrijding van deze ziekte in viskwekerijen te vergemakkelijken.
Tot nu toe was de diagnose van TiLVD gebaseerd op moleculaire testen, virale isolatie en histopathologie. Voor TiLV diagnose10,11zijn verschillende PCR protocollen en primers ontwikkeld. Bijvoorbeeld, een SYBR groen-gebaseerde reverse transcription kwantitatieve PCR (RT-qPCR) methode met de gevoeligheid voor het detecteren van zo weinig als twee kopieën / μL van het virus is ontwikkeld en gevalideerd voor TiLV detectie10. Andere PCR-methoden voor TiLV-detectie zijn TaqMan quantitative PCR11,RT-PCR2,geneste RT-PCR12en semi-geneste RT-PCR13. Deze methoden vereisen echter geavanceerde laboratoriumapparatuur en relatief langere perioden om resultaten op te leveren vanwege de complexiteit van de reacties, waardoor ze ongeschikt zijn voor veldtoepassing.
De lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test is een snelle, eenvoudige en praktische for-field toepassing14,15. De techniek maakt gebruik van het principe van een bundelverplaatsingsreactie, terwijl de versterkingsreactie onder isothermale omstandigheden loopt zonder een geavanceerde en dure thermische cycler14,15. Bijgevolg worden versterkte LAMP-producten of RT-LAMP-producten geanalyseerd in ladderachtige banden met behulp van agarosegelelektroforese met een fluorescerende vlek voor ofwel de veilige visualisatie van DNA of RNA14 of observatie met het blote oog voor de aanwezigheid van troebelheid of een witteneerslaan16,17,18. Om deze redenen is deze techniek gebruikt voor de detectie ter plaatse van verschillende vispathogenen17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Het doel van deze studie was om een snelle, gevoelige en nauwkeurige RT-LAMP test voor TiLV detectie vast te stellen. De RT-LAMP test biedt screening voor TiLV in vismonsters binnen 30 min. De techniek kan worden toegepast voor de diagnose en bewaking van TiLVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit experiment, waarbij dierlijk weefsel werd gebruikt, werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Kasetsart University, Bangkok, Thailand (protocolnummer ACKU61-VET-009).
1. Weefselverzameling
- Euthanaser tilapiavissen met behulp van een overdosis kruidnagelolie (d.w.z. meer dan 3 mL/L). Tricaine methaansulfonaat kan worden gebruikt als alternatief voor kruidnagelolie.
- Gebruik steriele mayoschaar en tangen om de buik van de postmortem tilapia open te snijden en ongeveer 30-50 mg leverweefsel, of met behulp van een microscoopdekselglas, te verwijderen door de vishuidlaag in de lengterichting (van voorste tot achterste) in een microcentrifugebuis van 1,5 mL te schrapen.
- Ga onmiddellijk naar de RNA-extractiestap of bewaar het verzamelde monster op −80 °C tot het experiment. Omdat intact RNA gevoeliger is dan DNA, gebruikt u RNase-vrije materialen en reagentia tijdens de RNA-extractie.
2. RNA-extractie
- Om het RNA uit het leverweefsel te halen, voegt u 30-50 mg tilapiaweefsel toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 mL met 600-1.000 μL guanidiniumzuur-fenolextractiereagens (Materiaaltafel)en verpulver het monster tot homogeen met behulp van een handbediende weefselhomogenisator. De weefselmonsters vereisen ongeveer 10% van het guanidiniumzuur-fenolextractiereagens. Gebruik voor de slijmmonsters slechts 300 μL van het guanidiniumzuur-fenolextractiereagens (3:1).
LET OP: Het guanidiniumzuur-fenolextractiereagenis giftig; daarom moet de behandeling met zorg worden uitgevoerd. Beschermende uitrusting, zoals veiligheidsbrillen, een laboratoriumjurk en veiligheidshandschoenen, moeten worden gedragen. - Centrifugeer het gehomogeniseerde monster bij 10.000 x g bij 30 s bij kamertemperatuur en breng het supernatant over in een nieuwe steriele microcentrifugebuis van 1,5 mL.
- Voeg een gelijk volume van 95% ethanol toe aan de buis en meng goed.
- Breng de oplossing over in een spinkolom (Table of Materials) geplaatst in een verzamelbuis en centrifugeer op 10.000 x g voor 30 s bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom weg en breng de draaikolom over naar een nieuwe inzamelbuis.
- Voeg 400 μL RNA Pre-Wash reagens (Tabel van materialen) toe aan de kolom en centrifugeer bij 10.000 x g voor 30 s bij kamertemperatuur voordat u de doorstroom weggooit. Herhaal deze stap nog een keer.
LET OP: Om de RNA Pre-Wash voor te bereiden, voeg 10 mL van 95% ethanol toe aan 40 mL RNA Pre-Wash concentraat. - Voeg 700 μL RNA Wash Buffer(Tabel van materialen)toe aan de kolom en centrifugeer op 10.000 x g voor 2 min bij kamertemperatuur. Breng de kolom over op een steriele microcentrifugebuis van 1,5 mL.
OPMERKING: Om RNA Wash Buffer voor te bereiden, voeg je 52 mL van 95% ethanol toe aan 12 mL RNA Wash Buffer concentraat. - Maak het RNA-monster dat in de matrix van de rotatiekolom wordt gevangen, los met 100 μL nucleasevrij water en centrifugeer bij 10.000 x g bij kamertemperatuur.
- Meet de concentratie van het geëxtraheerde RNA met behulp van een microvolume spectrofotometer en verdun het RNA tot een gewenste concentratie met nucleasevrij water.
OPMERKING: De gekwalificeerde absorptiewaarde van OD260/OD280 varieert van 1,6 tot 1,9, wat de aanvaardbare RNA-zuiverheid voor de RT-LAMP-test aangeeft. - Ga onmiddellijk naar de volgende stap of bewaar het monster bij −80 °C tot het gebruik.
3. Primer ontwerp
- Gebruik Primer Explorer versie 4 om de specifieke primers voor de RT-LAMP te ontwerpen. Ga naar de website, https://primerexplorer.jp/e/ en klik op de PrimerExplorer V4-knop.
- Selecteer het bestand met de sequenties van segment 3 van TiLV in FASTA-indeling en klik op de knop Primerontwerp.
OPMERKING: Haal de sequenties in FASTA-formaat terug van GenBank-toetredingsnummer KX631923, dat het tilapiameervirus TV1-segment 31vertegenwoordigt. - Als u de primers wilt ontwerpen, voert u de volgende basisparameters in:
- Een GC-gehalte van 40%–60%
- Een amplicon van ≥280 basisparen (bp)
- Een vergelijkbare smelttemperatuur (Tm) onder primers met een maximaal verschil van 5 °C
LET OP: De primers mogen elkaar niet aanvullen- Vermijd sequentiegebieden die gevoelig zijn voor het vormen van secundaire structuren.
- Selecteer de dimer primer analyse met een minimum van −3,5 voor een optimaal ontwerp voor de grootste ΔG, en selecteer de uiteinden van de primers met een maximum van −4 voor een optimaal ontwerp voor de kleinere ΔG.
- Klik op de knop Genereren.
OPMERKING: Nadat de software klaar is met het verwerken van de invoergegevens, worden de primerresultaten weergegeven (figuur 1).
4. RT-LAMP-test
- Bereid een RT-LAMP master mix met 2,5 μL van 1x SD II reactiebuffer, 3 μL van 6 mM MgSO4, 1,4 μL van 1,4 mM dNTP set, 4 μL van 0,8 M betaïne, 1,3 μL van 0,052 mM calceïnemengsel, 1 μL van 1,6 μM TiLV-F3 primer, 1 μL van 1,6 μM TiLV-B3 primer, 1 μL of 0.2 μM TiLV-BIP primer, 1 μL of 0.2 μM TiLV-FIP primer, 1 μL of 0.3 U Bst DNA polymerase, 1 μL of 0.1 U AMV reverse transcriptase, en 3.8 μL nuclease-vrij water per reactie.
OPMERKING: Bereid overtollige master mix bestaande uit ten minste 10% van het totale reactievolume. - Deel 22 μL van de RT-LAMP master mix in een steriele 1,5 microcentrifuge buis.
- Voeg 3 μL van het geëxtraheerde RNA toe aan de reactiebuis en meng het monster door vortexing. Gebruik voor de negatieve controle gedestilleerd water in plaats van RNA-materialen.
- Incubeer de reactie bij 65 °C gedurende 60 min, gevolgd door 80 °C gedurende 10 min om de reactie te beëindigen.
- Na incubatie, visueel observeren van de colorimetrische veranderingen met het blote oog. Een positief resultaat zal verschijnen als een fluorescerende groene kleur.
5. Agarose gel elektroforese
- Bereid een 1,5% w/v agarose gel door het opschorten van 0,6 g agarosepoeder in 40 mL van 1x TAE buffer. Smelt het mengsel door het te verwarmen in een magnetron voor 3-5 min tot de agarose volledig is opgelost, en wervelen om te mengen.
- Laat de agarose afkoelen tot de temperatuur 65 °C bereikt. Giet 40 mL van de agarose oplossing op een gel lade en voeg een kam aan de gel mal.
- Laat de agarosegel 20-30 min op kamertemperatuur zetten tot deze volledig gestold is. Verwijder vervolgens de kam en plaats de gel in de geltank.
- Voeg een loopbuffer toe om het oppervlak van de gel in de geltank te bedekken.
- Voeg 10 μL van het RT-LAMP monster en 2 μL van 6x gel laadbuffer toe aan elke put. Voeg 5 μL van een DNA-ladder van 1 kb toe aan de referentiebaan.
- Sluit het deksel aan dat aan de kathode is bevestigd en de anode is aangesloten op een voeding. Zet de voeding aan, zet deze in op een constante 100 V en voer 40 min uit.
- Verwijder de gel na het voltooien van de gelscheiding uit de gellade. Bevlek vervolgens de uitgelekte gel met ethidiumbromide (EtBr) bij een concentratie van 10 mg/mL gedurende 7 min en restain in gedestilleerd water gedurende 5 min.
LET OP: EtBr is giftig en wordt beschouwd als kankerverwekkend; wees daarom voorzichtig bij het gebruik van deze agent. - Stel de gel bloot aan UV-licht met behulp van een gel documentatiesysteem waar banden verschijnen, en maak een foto van de gel.
6. Aanvullende DNA(cDNA) synthese
- Bereid een cDNA synthese master mix met 2 μL van 5x RT buffer, 0,5 μL primer mix, 0,5 μL RT enzym, en 2 μL nuclease-vrij water per reactie.
LET OP: Bereid overtollige master mix bestaande uit 1x de reactie als gevolg van potentieel verlies tijdens pipetteren. - Deel 5 μL van de mastermix in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 mL.
- Voeg 100 ng van het verdunde geëxtraheerde geëxtraheerde RNA (verkregen vanaf stap 2.8) toe aan de reactiebuis, meng en spin naar beneden om al het mengsel naar de bodem van het vat te verplaatsen.
- De reacties op 42 °C uitbroeden gedurende 60 min, gevolgd door 98 °C gedurende 5 min in een PCR-machine. Bewaar het cDNA bij −20 °C tot gebruik.
7. RT-qPCR
- Bereid een TiLV qPCR-mastermix voor die 0,3 μL van 10 μM reverse primer, 0,3 μL van 10 μM voorwaartse primer, 5 μL 2x SYBR Green DNA polymerase en 0,4 μL nuclease-vrij water per reactie bevat. Gebruik de volgende primers en besturingselementen:
Voorwaartse primer (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAAGAGGCAATATGGATT-3"
Reverse primer (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3' - Nun 6 μL van de TiLV qPCR master mix in elke put van de qPCR strip compatibel met de real-time thermische cycler gebruikt.
- Voeg 4 μL van de cDNA-sjabloon, negatieve controle (nucleasevrij water), positieve controle (10 pg/μL) en pTiLV (plasmid)10 of serieel verdunde TiLV plasmide toe aan de put en meng elk monster door te flicking. Voer elk monster in drievoud.
- Plaats de qPCR-reacties in de geprogrammeerde real-time thermische cycler. Stel het qPCR-programma in om de incubatie uit te voeren op 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 10 s en 60 °C gedurende 30 s vóór de smeltcurvestap waarin de temperatuur moet stijgen van 65 °C naar 95 °C bij stappen van 0,5 °C/5.
- Voer de gegevensanalyse uit door de versterkings- en smeltcurven te evalueren en bereken vervolgens het aantal TiLV-kopieën met behulp van de standaardcurve die is verkregen uit de gegevens met behulp van de serieel verdunde plasmiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie werd een RT-LAMP test ontwikkeld om TiLV-infectie in tilapia op te sporen. De geteste monsters werden verzameld van 14 bedrijven in verschillende delen van Thailand tussen 2015 en 2016. De geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde vissen werden voornamelijk gegroepeerd op basis van fysieke diagnoses en de verschijningen van symptomatische TiLVD. TiLV infectie werd vervolgens bevestigd met behulp van RT-PCR na het verzamelen proces. Agarose gel elektroforese en de detectie van een lichtgevende groene kleur werden geselecteerd als de evaluatiemethoden van de LAMP amplicons (Figuur 2). De lever en het slijm van de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde tilapiavissen werden gekenmerkt door het klinische uiterlijk van de symptomen van de Ziekte van TiLV, waaronder huiderosie, roodheid van de huid, exoftalmos en zwelling van de buik. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat het gebruik van levermonsters in moleculaire diagnostische testen om de aanwezigheid van TiLV35te bepalen. Als alternatief, slijm kan nuttig zijn in de test als het kan helpen voorkomen dat het doden van de dieren. De resultaten toonden een ladder-achtige DNA-band patroon en een fluorescerende groene kleur in de geïnfecteerde lever en slijm monsters van geïnfecteerde vissen (Figuur 2), terwijl er geen DNA-band en de gele kleur van calcein werden waargenomen in de RT-LAMP mengsels in niet-geïnfecteerde dierlijke weefsels (Figuur 2). Interessant is dat een Met TiLV geïnfecteerde tilapia-monster verzameld van een boerderij in Maleisië ook als positief werd gediagnosticeerd met behulp van deze RT-LAMP test; er werden echter verschillen in de grootte van het PCR-product waargenomen in vergelijking met de monsters die van lokale Thaise bedrijven werden verzameld (figuur 2).
Om de gevoeligheid en specificiteit van de RT-LAMP-test te verifiëren, werden in totaal 63 met TiLV geïnfecteerde weefsels en 63 niet-geïnfecteerde weefsels geanalyseerd met behulp van zowel de RT-LAMP als de RT-qPCR-test (Tabel 1). Een vergelijking van de RT-qPCR en RT-LAMP testen van de geïnfecteerde monsters bleek een positief resultaat in 63 (100%) en 51 (80,95%) van de monsters, respectievelijk. Bovendien bleek uit een analyse van de niet-geïnfecteerde monsters dat alle 63 niet-geïnfecteerde weefsels negatieve resultaten opleverden met behulp van zowel de RT-qPCR- als de RT-LAMP-test (tabel 1). Deze analyse toonde de betrouwbaarheid aan van de RT-LAMP test voor primaire TiLV detectie. Om de specificiteit van de RT-LAMP-test te testen, werden weefsel van vissen die besmet zijn met andere pathogene bacteriën en virussen, waaronder Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophila, en Iridovirus gebruikt als sjablonen voor de RT-LAMP en RT-qPCR-analyses. Zowel de RT-LAMP als de RT-qPCR primers leverden negatieve resultaten op zonder colorimetrische veranderingen en geen fluorescerende signalen in een van de geteste monsters(tabel 2). Bovendien werd de gevoeligheid van de RT-LAMP-test beoordeeld aan de hand van een seriële 10-voudige verdunning van de RNA-sjablonen uit met TiLV geïnfecteerde vissen. Relatief, de RT-qPCR test was gevoeliger dan de RT-LAMP test als de RT-qPCR test had een detectie limiet van 10-8, terwijl de RT-LAMP methode vereist een 10-7-voudigeverdunning om de TiLV genoom (Tabel 2) detecteren.
Figuur 1. De nucleotidensequenties van de zes RT-LAMP primers die in deze studie werden gebruikt en die specifiek waren voor de detectie van TiLV. De positie van elke primer werd uitgelijnd op segment 3 van het TiLV genoom (toetredingsnummer KX631923). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Analyse van de RT-LAMP amplicenen verkregen uit de TiLV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde monsters (A) in 1,5% agarose gel elektroforese en (B) door fluorescerende visualisatie. ( M = 1 kb DNA-ladder, 1–2 = RNA uit de levers van met TiLV geïnfecteerde vissen, 3-4 = het cDNA van met TiLV geïnfecteerde vissen, 5-6 = RNA uit het slijm van met TiLV geïnfecteerde vissen, 7–8 = cellijnen van met TiLV geïnfecteerde vissen, 9 = RNA uit de levers van met TiLV geïnfecteerde vissen (Maleisië), 10 = RNA uit de levers van niet-TiLV-geïnfecteerde vissen, 11 = het cDNA van niet-TiLV-geïnfecteerde vissen, 12 = RNA uit het slijm van niet-TiLV-geïnfecteerde vis, 13 = geen sjablooncontrole Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Soorten monsters | Aantal monsters | Detectiegeldigheid (%) | |
| RT-qPCR | RT-LAMP | ||
| Geïnfecteerde monsters | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Niet-geïnfecteerde monsters | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tabel 1. Verificatie van RT-LAMP voor TiLV-detectie in geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde vismonsters met RT-qPCR en RT-LAMP
| Specificiteit | S.a. | F.n. | Fc. | Ah. | Iv. | |||||
| qPCR | Lamp | qPCR | Lamp | qPCR | Lamp | qPCR | Lamp | qPCR | Lamp | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Gevoeligheid | methode/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Verdunning | ||||||||||
| qPCR | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lamp | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tabel 2. Specificiteit en gevoeligheid van de RT-LAMP test in vergelijking met RT-qPCR. Voor de specificiteitsbeoordeling werd RNA verkregen uit visweefsel dat is geïnfecteerd met andere bacteriën of virussen, waaronder Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.), en Iridovirus (I.v.), gebruikt als sjablonen voor RT-qPCR en RT-LAMP. Voor de gevoeligheidsevaluatie werd RNA verkregen uit met TiLV geïnfecteerde vissen 10-voudig seriële verdund van 100 ng tot 1 fg en gebruikt als sjablonen voor RT-qPCR en RT-LAMP. De + en – tekenen betekenen positieve en negatieve resultaten, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De aquacultuursector wordt voortdurend bedreigd door virale infecties die aanzienlijke economische verliezen veroorzaken9,23,28. Zo vormt de opkomende TiLV een grote bedreiging voor de landen die zich in vele delen van dewereld1,6,9. Tot nu toe zijn er geen specifieke therapieën beschikbaar om TiLVD te voorkomen. Terwijl de ontwikkeling van een vaccin aan de gang is, zal een efficiënt vaccin aanzienlijke tijd vergen voordat het beschikbaar is voor commerciële doeleinden. Onder deze omstandigheden zijn strenge bioveiligheidsmetingen, zoals de toepassing van ontsmettingsmiddelen, noodzakelijk in viskwekerijen om de verspreiding van TiLVD29,30te voorkomen . Momenteel is een van de meest efficiënte controlemaatregelen om de overdracht van TiLV te verminderen de screening van jonge vissen en volwassenen op de aanwezigheid of afwezigheid van TiLV31. Voor screeningsdoeleinden moet het diagnostische instrument snel, gevoelig en specifiek zijn, zodat het kan helpen bij het elimineren van geïnfecteerde populaties en het voorkomen van verdere verspreiding van ziekten. De huidige moleculaire testen voor TiLV zijn echter moeilijk ter plaatse te implementeren. In eerste instantie vereisen ze bekwame onderzoekers en dure apparatuur. Ten tweede kan het enkele dagen duren om de laboratoriumresultaten te verkrijgen, waardoor het moeilijk is om de verspreiding van de ziekte onmiddellijk te beheersen en te voorkomen15,16.
Om deze problemen te overwinnen, vestigden Notomi et.14 in 2000 een nieuwe nucleïnezuurgebaseerde versterkingstest genaamd loop-gemedieerde isothermale versterking (LAMP). De lampreactie is sindsdien met succes toegepast om verschillende visvirussen op te,sporen16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,32,33,34. In deze studie ontwikkelden we een RT-LAMP protocol om TiLV te detecteren in tilapia vismonsters. Hoewel de gevoeligheid van de RT-LAMP-methode 10 keer minder efficiënt is dan die van de RT-qPCR, kan de RT-LAMP-test de aanwezigheid van een TiLV RNA-genoom detecteren tot 100 fg, wat voldoende is voor TiLV-detectie bij klinisch zieke vissen34. Met name de RT-LAMP test levert een resultaat binnen 60 min en vereist slechts een eenvoudige waterbad of warmteblok instrumenten34, terwijl de RT-qPCR test kost meer tijd en vereist duurdere real-time PCR apparatuur voor de analyse15,34. Bovendien werd het eindproduct van de RT-LAMP waargenomen door een kleurverandering van de fluorescerende kleurstof van lichtgeel naar fluorescerend groen, waardoor het met het blote oog zichtbaar werd zonder dat er behoefte was aan geavanceerde apparatuur34. Deze voordelen maken RT-LAMP geschikt voor velddiagnose. Bovendien, de studie bevindingen suggereerde dat zowel lever en slijm kan worden gebruikt voor TiLV detectie met behulp van RT-LAMP. Net als bij eerdere studies, een niet-dodelijke steekproef met behulp van slijm toegestaan de diagnose van TiLV zonder het doden van vis of waardevolle fokvee35. Onlangs is een RT-LAMP test ontwikkeld om Chinese en Thaise isolaten van TiLV nucleotide sequenties in segment 1 (S1 regio) met behulp van een set van zes primers36detecteren . De huidige studie toonde aan dat de ontwikkelde RT-LAMP test gediagnosticeerd een vals-negatief signaal van TiLV infectie op 27,78% in vergelijking met RT-PCR bij het gebruik van dezelfde primer set. Bij verdere vergelijking was het vals-negatieve resultaat relatief minder met 19,05% bij het detecteren van segment 3 van TiLV in vergelijking met RT-PCR. Bij het vergelijken van de efficiëntie van de virale detectiemethode met andere rapporten, konden we TiLV-infectie detecteren op 80,95%, terwijl andere werken het virus detecteerden met 72,22%36 en 82,89%37. Al met al kan worden verondersteld dat de verschillende componenten van de RT-LAMP-test, bijvoorbeeld de verschillende primersets en de verschillende gerichte segmenten van het TiLV-genoom belangrijke factoren zijn die de geldigheid van de test beïnvloeden.
Hoewel de RT-LAMP test is een krachtig instrument voor ziekte screening en heeft een aantal aantoonbare voordelen, deze studie was niet zonder beperkingen. Een van de belangrijkste punten voor de RT-LAMP test was het ontwerp van een geschikte primer set bestaande uit vier tot zes primers. Om de vorming van de stamlusstructuren van de PCR-producten te bevorderen, moesten de juiste lengtes van de beoogde genen of nucleotidesequenties langer zijn dan ongeveer 500 bp, terwijl de beoogde genen van de RT-PCR-test relatief kort moesten zijn, in het bereik van 50-150 bp14,38,39.
Tot slot is de ontwikkelde RT-LAMP-test snel, kosteneffectief, gevoelig en specifiek voor TiLV-detectie. De analyse kan worden voltooid binnen 1 uur in vergelijking met 4-5 uur voor de RT-qPCR test. Met name de RT-LAMP test is praktisch voor veldomstandigheden als positieve resultaten kunnen worden waargenomen met het blote oog zonder het gebruik van geavanceerde apparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het project wordt financieel gefinancierd door Thailand Research Fund (TRF) subsidienummer RDG6050078 en het Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand onder de Higher Education Research Promotion en National Research University Project van Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministerie van Onderwijs, Thailand. Het onderzoek wordt mede ondersteund door de Graduate Program Scholarship van de Graduate School, Kasetsart University. De auteurs willen Dr. Kwanrawee Sirikanchana bedanken voor het verhaal dat over de video spreekt en Piyawatchara Sikarin voor het bewerken van de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
