Summary
Vi presenterar en RT-LAMP-analys för detektering av TiLV i tilapiafisk med enkla instrument under en relativt kort tidsperiod jämfört med konventionella RT-PCR-tekniker. Detta protokoll kan bidra till att kontrollera den epidemiska spridningen av TiLVD, särskilt i utvecklingsländerna.
Abstract
Tilapia lake virussjukdom (TiLVD), en framväxande virussjukdom i tilapia orsakas av tilapia sjövirus (TiLV), är en ihållande utmaning inom vattenbruksindustrin som har resulterat i massa sjuklighet och dödlighet tilapia i många delar av världen. En effektiv, snabb och noggrann diagnostisk analys för TiLV-infektion är därför nödvändig för att upptäcka den första infektionen och för att förhindra spridning av sjukdomen i vattenbruksodling. I denna studie presenteras en mycket känslig och praktisk omvänd transkription loop-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP) metod för att upptäcka tilapia sjövirus i fiskvävnad. En jämförelse av RT-qPCR- och RT-LAMP-analyserna från infekterade prover visade positiva resultat i 63 (100%) och 51 (80,95%) prover. Dessutom visade en analys av icke-infekterade prover att alla 63 oinfekterade vävnader gav negativa resultat för både RT-qPCR- och RT-LAMP-analyserna. Korsreaktivitet med fem patogener i tilapia utvärderades med RT-LAMP och alla tester visade negativa resultat. Både lever- och slemproverna från infekterad fisk visade jämförbara resultat med RT-LAMP-metoden, vilket tyder på att slem kan användas i RT-LAMP som en nonlethal-analys för att undvika att fisk avlivas. Sammanfattningsvis visade resultaten att den presenterade RT-LAMP-analysen ger en effektiv metod för TiLV-detektion i tilapiavävnad inom 1 h. Metoden rekommenderas därför som ett screeningverktyg på gårdar för snabb diagnos av TiLV.
Introduction
Tilapia lake virussjukdom (TiLVD) är en virussjukdom i tilapia(Oreochromis spp.) som enligt uppgift orsakar tilapia dödsfall i många regioner i världen, inklusive Asien1,2, Afrika och Amerika. Sjukdomen erkändes först under massdödligheten av tilapia under 2009 i Israel, där antalet vilda tilapia i Lake Kinneret rasade dramatiskt från 257 till 8 ton per år2. Sjukdomen orsakas av tilapia sjövirus (TiLV), som har tilldelats familjen Amnoonviridae som ett nytt släkte Tilapinevirus och en ny art Tilapia tilapinevirus3. Genetisk karakterisering av TiLV visade att viruset är en ny insvept, negativ känsla, enkelsträngat RNA-virus som har 10 segment kodning 10 proteiner1,2,4. Olika arter av tilapia i släktet Sarotherodon, Oreochromis, och Tilapine och andra varmt vatten fisk (t.ex. jätte gourami (Osphronemus goramy)) har visat sig vara mottagliga för TiLV2,5. För närvarande fortsätter detta virus att sprida sig globalt, eventuellt genom förflyttning av infekterad levande fisk6,7, medan risken för virusöverföring via fryst tilapia eller dess produkt är begränsad8. Betydande dödlighet på grund av TiLV-infektion har potential att ha en betydande negativ ekonomisk inverkan på tilapiaindustrin. Till exempel beräknades de ekonomiska effekterna av sommardödlighet syndrom i Egypten i samband med TiLV infektion vara US $ 100 miljoner9. Därför är det viktigt att utveckla en snabb och korrekt diagnostisk metod för att underlätta bekämpningen av denna sjukdom i fiskodlingar.
Hittills har diagnosen TiLVD baserats på molekylära analyser, virusisolering och histopatologi. Olika PCR-protokoll och primers har utvecklats för TiLV diagnos10,11. Till exempel har en SYBR grön-baserad omvänd transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) metod med känslighet för att upptäcka så få som två kopior /μL av viruset har utvecklats och validerats för TiLV detektion10. Andra PCR-metoder för TiLV-detektering inkluderar TaqMan kvantitativ PCR11, RT-PCR2, kapslade RT-PCR12och semi-kapslade RT-PCR13. Dessa metoder kräver dock sofistikerad laboratorieutrustning och relativt längre tidsperioder för att ge resultat på grund av reaktionernas komplexitet, vilket gör dem olämpliga för fältapplicering.
Den loopmedierade isotermiska amplifieringsanalysen (LAMP) är en snabb, enkel och praktisk förfältsapplicering14,15. Tekniken använder principen om en sträng förskjutning reaktion, medan förstärkning reaktionen körs under isotermiska förhållanden utan en sofistikerad och dyr termisk cycler14,15. Följaktligen analyseras förstärkta LAMP-produkter eller RT-LAMP-produkter i stegliknande band med agaros gelelektrofores med en lysrörsfläck för antingen säker visualisering av DNA eller RNA14 eller observation med blotta ögat för närvaron av grumlighet eller en vit fällning16,17,18. Av dessa skäl har denna teknik använts för påvisande på plats av olika fiskpatogener17,,18,,19,,20,,21,,22,23, 24,,24,25,26,27. Syftet med denna studie var att upprätta en snabb, känslig och noggrann RT-LAMP-analys för TiLV-detektering. RT-LAMP-analysen erbjuder screening för TiLV i fiskprover inom 30 min. Tekniken kan tillämpas för diagnos och övervakning av TiLVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta experiment, som omfattade användning av djurvävnad, godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee of Kasetsart University, Bangkok, Thailand (protokollnummer ACKU61-VET-009).
1. Vävnadsinsamling
- Avliva tilapiafisk med en överdos av kryddnejlika olja (dvs. mer än 3 ml/L). Tricaine metansulfonat kan användas som ett alternativ till kryddnejlika olja.
- Använd steril majonnässax och pincett för att skära upp buken i postmortem tilapia och punktskatt ca 30-50 mg levervävnad, eller med hjälp av ett mikroskop täcka glas, samla 100 μL slem genom att skrapa fisk hudskiktet längsgående (från främre till bakre) i en 1,5 mL mikrorifugrör.
- Fortsätt omedelbart till RNA-extraktionssteget eller förvara det insamlade provet vid −80 °C tills experimentet. Eftersom intakt RNA är känsligare än DNA, använd RNase-fria material och reagenser under RNA-extraktionen.
2. RNA-extraktion
- För att extrahera RNA från levervävnaden, tillsätt 30–50 mg av tilapiavävnaden till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 600–1 000 μl guanidinium-syra-fenolextraktion (Tabell över material) och pulverisera provet tills det är homogent med hjälp av en handhållen vävnadhomogenisator. Vävnadsproverna kräver cirka 10% av guanidinium-acid-phenol extraktion reagens. För slemproverna, använd endast 300 μL av guanidinium-acid-phenol extraktionsreagens (3:1).
VARNING: Guanidinium-acid-phenol extraktion reagens är giftigt; därför måste hanteringen ske med försiktighet. Skyddsutrustning, såsom skyddsglasögon, en laboratorieklänning och skyddshandskar, måste bäras. - Centrifugera det homogeniserade provet vid 10 000 x g i 30 s vid rumstemperatur och överför supernatanten till ett nytt sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt en lika stor volym på 95% etanol till röret och blanda väl.
- Överför lösningen till en spinnkolonn(Tabell över material)placerad i ett uppsamlingsrör och centrifug på 10 000 x g för 30 s vid rumstemperatur. Kasta flödet och överför spinnkolumnen till ett nytt uppsamlingsrör.
- Tillsätt 400 μl RNA Pre-Wash reagens(Tabell över material)till kolonnen och centrifugen vid 10.000 x g för 30 s vid rumstemperatur innan du kasserar flödet. Upprepa det här steget en gång till.
OBS: För att förbereda RNA Pre-Wash, tillsätt 10 ml 95% etanol till 40 ml RNA Pre-Wash koncentrat. - Tillsätt 700 μl RNA-tvättbuffert(Tabell över material)i kolonnen och centrifugen vid 10 000 x g i 2 min vid rumstemperatur. Överför kolonnen till ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: För att förbereda RNA-tvättbufferten, tillsätt 52 ml 95 % etanol till 12 ml RNA-tvättbuffertkoncentrat. - Lak ut RNA-provet som fångas i spinnkolumnmatrisen med 100 μL nukleasfritt vatten och centrifug vid 10 000 x g i 30 sekunder vid rumstemperatur.
- Mät koncentrationen av det extraherade RNA med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer och späd RNA till önskad koncentration med nukleasfritt vatten.
OBS: Det kvalificerade absorbansvärdet för OD260/OD280 varierar från 1,6 till 1,9, vilket indikerar den godtagbara RNA-renhetsgraden för RT-LAMP-analysen. - Fortsätt till nästa steg omedelbart, eller förvara provet vid −80 °C tills det används.
3. Primer design
- Använd Primer Explorer version 4 för att designa de specifika grundfärgerna för RT-LAMP. Gå till webbplatsen, https://primerexplorer.jp/e/, och klicka på PrimerExplorer V4-knappen.
- Markera filen som innehåller sekvenserna i segment 3 i TiLV i FAST-format och klicka sedan på knappen Primer Design.
OBS: Hämta sekvenserna i FASTA-format från GenBank anslutningsnummer KX631923, som representerar tilapia lake virus TV1 segment 31. - För att utforma primers, mata in följande grundläggande parametrar:
- En GC-halt på 40%–60%
- En amplicon på ≥280 baspar (bp)
- En liknande smälttemperatur (Tm) bland grundfärger med en maximal skillnad på 5 °C
OBS: Grundfärgerna får inte komplettera varandra- Undvik sekvensområden som är benägna att bilda sekundära strukturer.
- Välj dimerprimeranalysen med minst −3,5 för optimal design för den största ΔG-ändarna och välj ändarna på grundfärgerna med maximalt −4 för en optimal design för den mindre ΔG.
- Klicka på knappen Generera.
OBS: När programvaran har bearbetats klart visas grundresultaten(bild 1).
4. RT-LAMP-analys
- Förbered en RT-LAMP-huvudblandning som innehåller 2,5 μL 1x SD II-reaktionsbuffert, 3 μl 6 mM MgSO4,1,4 μL dNTP-set på 1,4 mM, 4 μl 0,8 M betain, 1,3 μl 0,052 mM calceinblandning, 1 μL 1,6 μM TiLV-F3 primer, 1 μL 1,6 μM TiLV-B3 primer, 1 μL 0,2 μM TiLV-BIP primer, 1 μL av 0,2 μM TiLV-FIP primer, 1 μL 0,3 U BST DNA-polymeras, 1 μL 0,1 U AMV omvänd transkriptas och 3,8 μl nukleafritt vatten per reaktion.
OBS: Förbered överflödig huvudblandning som omfattar minst 10 % av den totala reaktionsvolymen. - Fördela 22 μL av RT-LAMP-masterblandningen i ett sterilt 1,5 mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 3 μl av det extraherade RNA till reaktionsröret och blanda provet genom att virvla. För den negativa kontrollen, använd destillerat vatten istället för RNA-material.
- Inkubera reaktionen vid 65 °C i 60 min, följt av 80 °C i 10 min för att avsluta reaktionen.
- Efter inkubation, visuellt observera de kolorimetriska förändringarna med blotta ögat. Ett positivt resultat visas som en fluorescerande grön färg.
5. Agarose gel elektrofores
- Förbered en 1,5% w /v agaros gel genom att hänga 0,6 g agaros pulver i 40 ml 1x TAE buffert. Smält blandningen genom att värma den i en mikrovågsugn i 3-5 min tills agaroset är helt upplöst och snurra för att blanda.
- Låt agarose att svalna tills temperaturen når 65 °C. Häll 40 ml av agaroslösningen på en gelbricka och tillsätt en kam till gelformen.
- Låt agarosgeln ställas in i rumstemperatur i 20–30 minuter tills den är helt stelnad. Ta sedan bort kammen och placera gelen i geltanken.
- Tillsätt en löpbuffert för att täcka gelens yta i geltanken.
- Tillsätt 10 μl av RT-LAMP-provet och 2 μL 6x gelbelastningsbuffert till varje brunn. Tillsätt 5 μL av en 1 kb DNA-stege till referensfilen.
- Anslut locket som är fäst vid katoden och anoden som är ansluten till en strömförsörjning. Slå på strömförsörjningen, ställ in den på en konstant 100 V, och kör i 40 min.
- Efter avslutad gelseparation, ta bort gelen från gelbrickan. Sedan färga den avrunna gelen med ethidiumbromid (EtBr) vid en koncentration av 10 mg/ml i 7 min och återbehålla den i destillerat vatten i 5 min.
VARNING: EtBr är giftigt och betraktas som cancerframkallande. var därför försiktig när du använder detta medel. - Exponera gelen för UV-ljus med hjälp av ett geldokumentationssystem där band visas och ta en bild av gelen.
6. Kompletterande DNA-syntes (cDNA)
- Förbered en cDNA-syntesbänd blandning som innehåller 2 μL 5x RT-buffert, 0,5 μl primerblandning, 0,5 μl RT-enzym och 2 μl nukleafritt vatten per reaktion.
OBS: Förbered överflödig huvudblandning bestående av 1x reaktionen på grund av potentiell förlust under pipettering. - Fördela 5 μL av masterblandningen i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 100 ng av det utspädda extraherade RNA (som erhålls från steg 2.8) till reaktionsröret, blanda och snurra ner för att flytta all blandningen till kärlets botten.
- Inkubera reaktionerna vid 42 °C i 60 min, följt av 98 °C i 5 min i en PCR-maskin. Förvara cDNA vid −20 °C tills den används.
7. RT-qPCR
- Förbered en TiLV qPCR-mästerblandning som innehåller 0,3 μL 10 μM omvänd primer, 0,3 μL 10 μM framåtprimer, 5 μL 2x SYBR Grön DNA-polymeras och 0,4 μl nukleasfritt vatten per reaktion. Använd följande grundfärger och kontroller:
Framåt primer (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3'
Omvänd primer (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3' - Fördela 6 μL av TiLV qPCR-mästerblandningen i varje brunn i qPCR-remsan som är kompatibel med den termiska cykelning i realtid som används.
- Tillsätt 4 μl av cDNA-mallen, negativ kontroll (nukleasfritt vatten), positiv kontroll (10 pg/μL) och pTiLV (plasmid)10 eller seriellt utspädd TiLV-plasmid till brunnen och blanda varje prov genom att snärta. Utför varje prov i tre exemplar.
- Placera qPCR-reaktionerna i den programmerade termiska cykeln i realtid. Ställ in qPCR-programmet så att inkubationen utförs vid 95 °C i 3 min, följt av 40 cykler av 95 °C för 10 s och 60 °C i 30 s före smältkurvan steg där temperaturen måste öka från 65 °C till 95 °C vid 0,5 °C /5 s steg.
- Utför dataanalysen genom att utvärdera förstärknings- och smältkurvorna och beräkna sedan antalet TiLV-kopior med hjälp av standardkurvan som erhålls från data med hjälp av de seriellt utspädda plasmiderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie utvecklades en RT-LAMP-analys för att upptäcka TiLV-infektion i tilapia. De testade proverna samlades in från 14 gårdar i olika delar av Thailand mellan 2015 och 2016. Den infekterade och oinfekterade fisken grupperades främst baserat på fysiska diagnoser och uppkomsten av symtomatiska TiLVD. TiLV infektion bekräftades därefter med HJÄLP AV RT-PCR efter insamlingsprocessen. Agaros gel elektrofores och detektion av en självlysande grön färg valdes som utvärderingsmetoder för LAMP-amplicons (figur 2). Levern och slem av infekterade och oinfekterade tilapia fisk kännetecknades av det kliniska utseendet på TiLV sjukdom symtom, inklusive huderosion, hud rodnad, exophthalmos och buken svullnad. Tidigare rapporter har visat att man använt leverprover i molekylärdiagnostiska analyser för att fastställa förekomsten av TiLV35. Alternativt kan slem vara fördelaktigt i analysen eftersom det kan bidra till att undvika att döda djuren. Resultaten visade en stege-liknande DNA-band mönster och en fluorescerande grön färg i den infekterade levern och slem prover av infekterad fisk (figur 2), medan ingen DNA-band och den gula färgen på calcein observerades i RT-LAMP blandningar i oinfekterade djurvävnader (figur 2). Intressant nog, en TiLV-infekterade tilapia prov som samlats in från en gård i Malaysia har också diagnostiserats som positivt med hjälp av denna RT-LAMP analys; Variationer i PCR-produktens storlek jämfört med de prover som samlats in från lokala thailändska gårdar observerades dock (figur 2).
För att kontrollera känsligheten och specificiteten hos RT-LAMP-analysen analyserades totalt 63 TiLV-infekterade vävnader och 63 oinfekterade vävnader med hjälp av både RT-LAMP- och RT-qPCR-analyserna (tabell 1). En jämförelse av RT-qPCR- och RT-LAMP-analyserna av de infekterade proverna visade ett positivt resultat på 63 (100%) och 51 (80,95%) av proverna. Dessutom visade en analys av de oinfekterade proverna att alla 63 oinfekterade vävnader gav negativa resultat med hjälp av både RT-qPCR- och RT-LAMP-analyserna (tabell 1). Denna analys visade tillförlitligheten hos RT-LAMP-analysen för primär TiLV-detektering. För att testa specificiteten hos RT-LAMP-analysen användes vävnad från fisk som är infekterad med andra patogena bakterier och virus, inklusive Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilaoch Iridovirus som mallar för RT-LAMP- och RT-qPCR-analyserna. Både RT-LAMP- och RT-qPCR-grundfärgerna gav negativa resultat utan färgimmetriska förändringar och inga lysrör i något av de testade proverna (tabell 2). Dessutom bedömdes känsligheten hos RT-LAMP-analysen med hjälp av en seriell 10-faldig utspädning av RNA-mallarna som extraherats från TiLV-infekterad fisk. Jämförelsevis var RT-qPCR-analysen känsligare än RT-LAMP-analysen eftersom RT-qPCR-analysen hade en detektionsgräns på10-8 medan RT-LAMP-metoden krävde en 10-7-faldig utspädning för att upptäcka TiLV-genomet (tabell 2).-7
Bild 1. Nukleotidsekvenserna hos de sex RT-LAMP-grundfärger som användes i denna studie och som var specifika för detektion av TiLV. Varje primers ställning var anpassad till segment 3 i TiLV-genomet (anslutningsnummer KX631923). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Analys av RT-LAMP-amplicons som erhållits från tilv-infekterade och oinfekterade prover (A) i 1,5% agaros gel elektrofores och (B) genom fluorescerande visualisering. ( M = 1 kb DNA-stege, 1–2 = RNA från levern av TiLV-infekterad fisk, 3–4 = cDNA av TiLV-infekterad fisk, 5–6 = RNA från slem från TiLV-infekterad fisk, 7–8 = cellinjer för TiLV-infekterad fisk, 9 = RNA från levern av TiLV-infekterad fisk (Malaysia), 10 = RNA från levern av icke-TiLV-infekterad fisk, 11 = cDNA av icke-TiLV-infekterad fisk, 12 = RNA från slem av icke-TiLV-infekterad fisk, 13 = ingen mallkontroll Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Typer av prover | Antal prover | Identifieringsgiltighet (%) | |
| RT-qPCR | RT-LAMPA | ||
| Infekterade prover | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Oinfekterade prover | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tabell 1. Kontroll av RT-LAMP för TiLV-detektion i infekterade och oinfekterade fiskprover med RT-qPCR och RT-LAMP
| Specificitet | S.a. | F.n. | Fc. | A.h. | Iv. | |||||
| qPCR (QPCR) | Lampa | qPCR (QPCR) | Lampa | qPCR (QPCR) | Lampa | qPCR (QPCR) | Lampa | qPCR (QPCR) | Lampa | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Känslighet | metod/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Utspädning | ||||||||||
| qPCR (QPCR) | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lampa | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tabell 2. Specificitet och känslighet för RT-LAMP-analysen jämfört med RT-qPCR. För specificitetsutvärderingen användes RNA från fiskvävnad som är infekterad med andra bakterier eller virus, inklusive Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.), och Iridovirus (I.v.), som mallar för RT-qPCR och RT-LAMP. För känslighetsutvärderingen späddes RNA från TiLV-infekterad fisk 10 gånger seriellt från 100 ng till 1 fg och användes som mallar för RT-qPCR och RT-LAMP. + och – tecken betyder positiva och negativa resultat, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vattenbruksindustrin hotas kontinuerligt av virusinfektioner som orsakar betydande ekonomiska förluster9,23,28. Till exempel utgör den framväxande TiLV ett stort hot mot tilapia-producerande länder i många delar av världen1,6,9. Hittills har det inte funnits några specifika terapier tillgängliga för att förhindra TiLVD. Medan utvecklingen av ett vaccin pågår kommer ett effektivt vaccin att kräva betydande tid innan det är tillgängligt för kommersiella ändamål. Mot dessa omständigheter är stränga mätningar av biosäkerhet, såsom applicering av desinfektionsmedel, nödvändiga i fiskodlingar för att förhindra spridning av TiLVD29,30. För närvarande är en av de mest effektiva kontrollåtgärderna för att minska TiLV överföring screening av ungfisk och vuxna för förekomsten eller frånvaron av TiLV31. För screeningändamål måste diagnosverktyget vara snabbt, känsligt och specifikt så att det kan bidra till att eliminera smittade populationer och förhindra ytterligare spridning av sjukdomar. De nuvarande molekylära analyserna för TiLV är dock svåra att implementera på plats. I första hand kräver de skickliga forskare och dyr utrustning. För det andra kan det ta flera dagar att få laboratorieresultaten, vilket gör det svårt att kontrollera och förhindra spridning av sjukdomen omgående15,16.
För att övervinna dessa problem etablerade Notomi et al.14 en ny nukleinsyrabaserad amplifieringsanalys som kallas loopmedierad isotermisk förstärkning (LAMP) år 2000. Lamp-reaktionen har sedan dess tillämpats för att upptäcka olika fiskvirus16,,17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,32,,33,,34. I denna studie utvecklade vi ett RT-LAMP-protokoll för att upptäcka TiLV i tilapia fiskprover. Även om RT-LAMP-metodens känslighet är 10 gånger mindre effektiv än RT-qPCR, kan RT-LAMP-analysen detektera förekomsten av ett TiLV RNA-genom så lågt som 100 fg, vilket är tillräckligt för tilv-detektion i kliniskt sjuk fisk34. Noterbart är att RT-LAMP-analysen ger ett resultat inom 60 min och kräver endast ett enkelt vattenbad eller värmeblockinstrument34, medan RT-qPCR-analysen tar längre tid och kräver dyrare PCR-utrustning i realtid för analysen15,,34. Dessutom observerades slutprodukten av RT-LAMP genom en förändring i färg på lysröret färgämnet från ljusgult till fluorescerande grönt, vilket gör den synlig för blotta ögat utan krav på sofistikerad utrustning34. Dessa fördelar gör RT-LAMP lämplig för fältdiagnos. Dessutom föreslog studieresultaten att både lever och slem kan användas för TiLV-detektering med RT-LAMP. I likhet med tidigare studier, ett nonlethal prov med slem får diagnos av TiLV utan att döda fisk eller värdefull avelsdjur35. Nyligen utvecklades en RT-LAMP-analys för att upptäcka kinesiska och thailändska isolat av TiLV nukleotid sekvenser i segment 1 (S1 region) med hjälp av en uppsättning av sex primers36. Den aktuella studien visade att den utvecklade RT-LAMP-analysen diagnostiserade en falsknegat signal av TiLV-infektion vid 27,78% jämfört med RT-PCR vid användning av samma primer-set. Vid ytterligare jämförelse var det falskt negativa resultatet relativt mindre på 19,05 % vid upptäckt av segment 3 av TiLV jämfört med RT-PCR. När vi jämförde effektiviteten hos virusdetekteringsmetoden med andra rapporter kunde vi upptäcka TiLV-infektion vid 80,95 %, medan andra verk upptäckte viruset vid 72,22 %36 och 82,89 %37. Sammantaget kan det vara en hypotes om att de olika komponenterna i RT-LAMP-analysen, till exempel de olika grundfärgsuppsättningarna och de olika riktade segmenten av TiLV-genomet, är viktiga faktorer som påverkar analysens giltighet.
Även om RT-LAMP-analysen är ett kraftfullt verktyg för sjukdomsscreening och har flera påvisbara fördelar, var denna studie inte utan begränsningar. En av de kritiska punkterna för RT-LAMP-analysen var utformningen av en lämplig primeruppsättning bestående av fyra till sex grundfärger. För att främja bildandet av pcr-produkternas stamslingasstrukturer måste lämpliga längder av de riktade generna eller nukleotidsekvenserna vara längre än ca 500 bp, medan de riktade generna i RT-PCR-analysen måste vara relativt korta, i intervallet 50–150 bp14,38,39.
Sammanfattningsvis är den utvecklade RT-LAMP-analysen snabb, kostnadseffektiv, känslig och specifik för TiLV-detektering. Analysen kan slutföras inom 1 h jämfört med 4–5 h för RT-qPCR-analysen. Rt-LAMP-analysen är särskilt praktisk för fältförhållanden, eftersom positiva resultat kan observeras med blotta ögat utan att behöva använda sofistikerad utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Projektet finansieras ekonomiskt av Thailand Research Fund (TRF) bidrag nummer RDG6050078 och Centrum för avancerade studier för jordbruk och livsmedel, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under Higher Education Research Promotion och National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. Forskningen stöds delvis av Graduate Program Stipendium från Graduate School, Kasetsart University. Författarna vill tacka Dr Kwanrawee Sirikanchana för berättelsen talar om videon och Piyawatchara Sikarin för att redigera videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
