Summary
Мы представляем RT-LAMP анализ для обнаружения TiLV в тилапии рыбы с использованием простых инструментов в течение относительно короткого периода времени по сравнению с обычными методами RT-PCR. Этот протокол может помочь в борьбе с эпидемическим распространением TiLVD, особенно в развивающихся странах.
Abstract
Болезнь озерного озера Тилапия (TiLVD), зарождающееся вирусное заболевание в тилапии, вызванное вирусом озера тилапия (TiLV), является постоянной проблемой в аквакультуре, которая привела к массовой заболеваемости и смертности тилапии во многих частях мира. Таким образом, для выявления первоначальной инфекции и предотвращения распространения заболевания в аквакультурном сельском хозяйстве необходим эффективный, быстрый и точный диагностический тест на инфекцию TiLV. В этом исследовании, очень чувствительныи и практические обратной транскрипции цикл опосредованного изотермального усиления (RT-LAMP) метод представлен для обнаружения вируса озера тилапии в рыбной ткани. Сравнение анализов RT-qPCR и RT-LAMP инфицированных образцов показало положительные результаты в 63 (100%) и 51 (80.95%) образцы, соответственно. Кроме того, анализ неинфицированных образцов показал, что все 63 неинфицированных тканей дали отрицательные результаты как для анализов РТ-кПЦР, так и для RT-LAMP. Перекрестная реактивность с пятью патогенами в тилапии оценивалась с помощью RT-LAMP, и все тесты показали отрицательные результаты. Оба печени и слизи образцов, полученных из инфицированных рыб показали сопоставимые результаты с помощью метода RT-LAMP, предполагая, что слизь может быть использована в RT-LAMP как нелетальный ассс, чтобы избежать убийства рыбы. В заключение, результаты показали, что представленный анализ RT-LAMP обеспечивает эффективный метод для обнаружения TiLV в ткани тилапии в течение 1 ч. Поэтому метод рекомендуется в качестве скринингового инструмента на фермах для быстрой диагностики TiLV.
Introduction
Болезнь озера Tilapia (TiLVD) является вирусным заболеванием в тилапии(Oreochromis spp.), которая, как сообщается, вызывает смерть от тилапии во многих регионах мира, включая Азию1,2, Африку и Америку. Болезнь была впервые признана во время массовой смертности тилапии в 2009 году в Израиле, где количество диких тилапий в озере Киннерет резко упало с 257 до 8 тонн в год2. Болезнь вызвана вирусом озера Тилапия (TiLV), который был назначен семье Amnoonviridae как новый род Tilapinevirus и новый вид Tilapia tilapinevirus3. Генетическая характеристика TiLV показала, что вирус является новым окутанным, отрицательным смыслом, одноцепочечным РНК-вирусом, который имеет 10 сегментов, кодирующих 10 белков1,,2,,4. Различные виды тилапии в роду Sarotherodon, Oreochromis, и Тилапин и другие теплые рыбы воды (например, гигантские гурами (Osphronemus goramy)) было показано, чтобы быть восприимчивыми к TiLV2,5. В настоящее время этот вирус продолжает распространяться по всему миру, возможно, через движение инфицированных живой рыбы6,7, в то время как риск вирусной передачи через замороженные тилапии или его продукт ограничен8. Существенная смертность от инфекции TiLV может оказать значительно пагубное экономическое воздействие на индустрию тилапии. Например, экономический эффект от летнего синдрома смертности в Египте, связанный с инфекцией TiLV, был рассчитан на US$100 млн9. Соответственно, важно разработать быстрый и надлежащий метод диагностики для облегчения борьбы с этим заболеванием в рыбоводных хозяйствах.
До сих пор диагноз TiLVD был основан на молекулярных анализах, вирусной изоляции и гистопатологии. Для диагностики TiLV10,,11были разработаны различные протоколы ПЦР и грунтовки. Например, sYBR зеленый основе обратной транскрипции количественного ПЦР (RT-qPCR) метод с чувствительностью для обнаружения всего лишь две копии / КЛ вируса была разработана и проверена для обнаружения TiLV10. Другие методы ПЦР для обнаружения TiLV включают TaqMan количественные PCR11, RT-PCR2, вложенный RT-PCR12, и полу-гнездо RT-PCR13. Однако эти методы требуют сложного лабораторного оборудования и относительно длительных периодов времени для получения результатов из-за сложности реакций, что делает их непригодными для применения на местах.
Цикл опосредованное изотермального усиления (LAMP) анализ является быстрым, простым и практичным для поля применения14,15. Техника использует принцип реакции смещения нити, в то время как реакция усиления проходит в изотермических условиях без сложного и дорогого теплового циклизатора14,15. Следовательно, усиленные продукты LAMP или продукты RT-LAMP анализируются в трапа-подобных полосах с использованием электрофореза геля агарозы с флуоресцентным пятном либо для безопасной визуализации ДНК или РНК14, либо наблюдения невооруженным глазом за наличие мутной или белой осадки16,17,18. По этим причинам данная методика была использована для обнаружения на месте различных рыбных патогенов17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27. Целью данного исследования было создание быстрого, чувствительного и точного исследования RT-LAMP для обнаружения TiLV. Анализ RT-LAMP предлагает скрининг на TiLV в образцах рыбы в течение 30 минут. Методика может быть применена для диагностики и наблюдения TiLVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот эксперимент, который включал в себя использование тканей животных, был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Касетсарта, Бангкок, Таиланд (протокольный номер ACKU61-VET-009).
1. Коллекция тканей
- Эвтанизировать рыбу тилапии с помощью передозировки гвоздики (т.е. более 3 мл/л). Трикаин метанесульфонат может быть использован в качестве альтернативы гвоздики нефти.
- Используйте стерильные ножницы майонеза и щипцы, чтобы разрезать живот посмертной тилапии и акцизпримерно примерно 30-50 мг ткани печени, или с помощью микроскопа крышка стекла, собрать 100 л слизи, соскоб слоя кожи рыбы продольно (от передней до задней) в 1,5 мl microcentrifuge трубки.
- Немедленно приступайте к этапу извлечения РНК или держите собранный образец на уровне 80 градусов по Цельсию до проведения эксперимента. Поскольку нетронутая РНК более чувствительна, чем ДНК, используйте безробляющие материалы и реагенты во время извлечения РНК.
2. Добыча РНК
- Чтобы извлечь РНК из ткани печени, добавьте 30-50 мг ткани тилапии в микроцентрифугную трубку площадью 1,5 мл, содержащую 600–1000 л гванидина-кислотно-фенола,Table of Materialsи распылите образец до однородного с помощью однородного гомогенизатора ткани. Образцы тканей требуют примерно 10% от гуанидиний-кислотно-фенол экстракционного реагента. Для образцов слизи используйте только 300 л из гетанидиний-кислотно-фенол экстрактного реагента (3:1).
ВНИМАНИЕ: гуанидиний-кислотно-фенол экстракционный реагент является токсичным; следовательно, обращение должно осуществляться с осторожностью. Необходимо носить защитное оборудование, такое как защитные очки, лабораторное платье и защитные перчатки. - Центрифугиговый гомогенизированный образец при температуре 10 000 х г при комнатной температуре и перенесите супернатант в новую стерильную микроцентрифугную трубку размером 1,5 мл.
- Добавить равный объем 95% этанола в трубку и хорошо перемешать.
- Перенесите раствор в спин-колонку(Таблица материалов),помещенную в коллекторную трубку и центрифугу при температуре 10 000 х г на 30 с при комнатной температуре. Отбросьте протекаемый поток и перенесите вращаемую колонку в новую трубку сбора.
- Добавьте 400 qL реагента РНК Pre-Wash(Таблица материалов)в колонку и центрифугу при температуре 10 000 х г на 30 с при комнатной температуре, прежде чем отбросить поток через. Повторите этот шаг еще раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подготовить РНК Pre-Wash, добавить 10 мл 95% этанола до 40 мл РНК Pre-Wash концентрата. - Добавьте 700 кЛ буфера ДЛЯ мытья РНК(Таблица материалов)в колонку и центрифугу при температуре 10 000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Перенесите колонку в стерильную микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки РНК мыть буфер, добавить 52 мл 95% этанола до 12 мл РНК мыть буфера концентрата. - Выясните образец РНК, захваченный в матрице вращательной колонки с 100 злителем безнуточной воды и центрифугой при температуре 10 000 х г при комнатной температуре.
- Измерьте концентрацию извлеченной РНК с помощью микротомного спектрофотометра и разбавьте РНК до нужной концентрации с помощью воды без нуклеаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Квалифицированная стоимость абсорбции OD260/OD280 колеблется от 1,6 до 1,9, что указывает на приемлемую чистоту РНК для оценки RT-LAMP. - Немедленно приступайте к следующему шагу или держите образец на уровне 80 градусов по Цельсию до использования.
3. Дизайн Праймера
- Используйте версию Primer Explorer 4 для разработки конкретных праймеров для RT-LAMP. Перейдите на веб-сайт, https://primerexplorer.jp/e/ и нажмите на кнопку PrimerExplorer V4.
- Выберите файл, содержащий последовательности сегмента 3 TiLV в формате FASTA, а затем нажмите кнопку Primer Design.
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлекать последовательности в формате FASTA от номера присоединения GenBank KX631923, который представляет вирус озера Tilapia TV1 сегмент 31. - Для проектирования грунтовок ввешай следующие основные параметры:
- Содержание GC 40%-60%
- Ампликон из 280 базовых пар (bp)
- Аналогичная температура плавления (ТМ) среди грунтовок с максимальной разницей в 5 градусов по Цельсию
ПРИМЕЧАНИЕ: грунтовки не должны дополнять друг друга- Избегайте последовательности регионов, склонных к формированию вторичных структур.
- Выберите анализ димера грунтовки с минимумом 3,5 евро для оптимального дизайна для самого большого G, и выберите концы грунтовок с максимумом 4 евро для оптимального дизайна для меньшего ЗГ.
- Нажмите кнопку «Создание».
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как программное обеспечение закончит обработку входных данных, будут показаны результаты праймера(рисунок 1).
4. RT-LAMP асссеи
- Подготовьте мастер-микс RT-LAMP, содержащий 2,5 л 1x SD II реакционного буфера, 3 л 6 мМ MgSO4, 1,4 мМ dNTP набор, 4 зл 0,8 М бетаин, 1,3 л 0,052 мМ кальцина смеси, 1 л 1,6 мкм TiLV-F3 1 кЛ 1,6 мКм TiLV-B3 грунтовка, 1 л 0,2 мкм TiLV-BIP грунтовка, 1 л 0,2 мкм TiLV-FIP грунтовка, 1 Л л 0,3 U Bst ДНК полимеразы, 1 Л 0,1 U AMV транскриптазы, и 3,8 л безреакции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка избыточной мастер-микс, состоящая не менее 10% от общего объема реакции. - Распределить 22 зл и мастер-микс RT-LAMP в стерильную 1,5 микроцентрифуговую трубку.
- Добавьте в реакционную трубку 3 зЛ извлеченной РНК и смешайте образец путем вихря. Для отрицательного контроля используйте дистиллированную воду вместо РНК-материалов.
- Инкубировать реакцию при 65 градусах по Цельсию в течение 60 минут, а затем 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы прекратить реакцию.
- После инкубации визуально наблюдайте за колористыми изменениями невооруженным глазом. Положительный результат будет отображаться как флуоресцентный зеленый цвет.
5. Электрофораз геля Агарозе
- Подготовьте 1,5% w/v агарозный гель, приостановив 0,6 г порошка агарозы в 40 мл 1x буфера TAE. Растопить смесь, нагревая ее в микроволновой печи в течение 3-5 минут, пока агароза полностью растворяется, и вихрь, чтобы смешать.
- Дайте агарозе остыть до тех пор, пока температура не достигнет 65 градусов по Цельсию. Налейте 40 мл раствора агарозы на лоток геля и добавьте гребень в форму геля.
- Разрешить гель агарозы установить при комнатной температуре в течение 20-30 минут, пока он полностью затвердел. Затем снимите гребень и поместите гель в гель бак.
- Добавьте бегущий буфер, чтобы покрыть поверхность геля в гелевом баке.
- Добавьте 10 злител к каждой скважине 10 злиц образца RT-LAMP и 2 л 6-х гель-буфера для загрузки геля. Добавьте 5 кЛ 1 кБ ДНК лестницы к справочной полосе.
- Подключите крышку, прикрепленную к катоду и аноду, подключенному к источнику питания. Включите блок питания, установите его на постоянную 100 В, и запустить в течение 40 минут.
- После завершения разделения геля, удалить гель из лотка геля. Затем пятно осушенных гель с помощью бромистого этидия (EtBr) в концентрации 10 мг/мл в течение 7 мин и отдохнуть его в дистиллированной воде в течение 5 мин.
ВНИМАНИЕ: EtBr является токсичным и считается канцерогеном; поэтому будьте осторожны при использовании этого агента. - Выставить гель на ультрафиолетовый свет с помощью системы документации геля, где появляются полосы, и сфотографировать гель.
6. Дополнительный синтез ДНК (кДНК)
- Подготовьте мастер-микс синтеза кДНК, содержащий 2 злиц 5-кратного буфера RT, 0,5 л грунтового микса, 0,5 л фермента RT и 2 злитроводы без нуклеазы воды на реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка избыточной мастер смеси, состоящей из 1x реакции из-за потенциальной потери во время пипетки. - Распределить 5 зЛ мастер смеси в стерильной 1,5 мл микроцентрифуговой трубки.
- Добавьте 100 нг разбавленной РНК (полученную со ступени 2.8) в реакционную трубку, перемешайте и закрутите вниз, чтобы переместить всю смесь на дно сосуда.
- Инкубировать реакции при 42 градусах по Цельсию в течение 60 минут, а затем 98 градусов по Цельсию в течение 5 минут в машине ПЦР. Храните кДНК при 20 градусах Цельсия до использования.
7. РТ-кПКР
- Подготовьте мастерскую смесь TiLV qPCR, содержащую 0,3 зл и 10 мкм обратной грунтовки, 0,3 л из 10 мкм вперед грунтовки, 5 qL 2x SYBR Green DNA полимеразы, и 0,4 л безнужной воды в реакции. Используйте следующие грунтовки и элементы управления:
Форвард праймер (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAGAGGCAATGGATT-3'
Обратная грунтовка (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTTCAGTATATAGTTCT-3' - Распределить 6 зл мастер-микс TiLV qPCR в каждую скважину полосы qPCR, совместимую с используемым тепловым циклом в реальном времени.
- Добавьте 4 зликат шаблона кДН, отрицательный контроль (безнужная вода), положительный контроль (10 пг/Зл) и pTiLV (плазмид)10 или последовательно разбавленной плазмидной TiLV к скважине, и смешайте каждый образец, щелкая. Проведите каждый образец в тройном.
- Поместите реакции qPCR в запрограммированный тепловой цикл в реальном времени. Установите программу qPCR для выполнения инкубации при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин, а затем 40 циклов 95 градусов по Цельсию для 10 с и 60 градусов по Цельсию на 30 с до шага плавильной кривой, в котором температура должна увеличиться с 65 градусов по Цельсию до 95 градусов по Цельсию при приращениях 0,5 градуса по Цельсию.
- Проведите анализ данных, оценивая кривые усиления и плавления, а затем вычисляйте количество копий TiLV с помощью стандартной кривой, полученной из данных, используя последовательно разбавленные плазмиды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании, RT-LAMP асссе был разработан для обнаружения инфекции TiLV в тилапии. Испытания были собраны на 14 фермах, расположенных в разных частях Таиланда в период с 2015 по 2016 год. Инфицированные и неинфицированные рыбы были в основном сгруппированы на основе физических диагнозов и появления симптоматических TiLVD. Инфекция TiLV была впоследствии подтверждена с помощью RT-PCR после процесса сбора. Агарозгель электрофорез и обнаружение люминесцентного зеленого цвета были выбраны в качестве методов оценки ампликонов LAMP(рисунок 2). Печень и слизь инфицированных и неинфицированных рыб тилапии характеризовались клиническим появлением симптомов болезни TiLV, включая эрозию кожи, покраснение кожи, экзофтальмо и отек живота. Предыдущие доклады продемонстрировали использование образцов печени в молекулярно-диагностических анализов, чтобы определить наличие TiLV35. Кроме того, слизь может быть полезным в ассоже, как это может помочь избежать убийства животных. Результаты показали лестницы, как ДНК-диапазон картины и флуоресцентный зеленый цвет в инфицированных печени и слизи образцов инфицированных рыб(Рисунок 2), в то время как днк-диапазон и желтый цвет кальцина наблюдались в RT-LAMP смеси в неинфицированных тканей животных (Рисунок 2). Интересно, что TiLV-инфицированных тилапии образец, собранный с фермы в Малайзии был также диагностирован как положительный с помощью этого RT-LAMP анализ; однако были отмечены различия в размерах пЦР-продукта по сравнению с образцами, собранными на местных тайских фермах(рисунок 2).
Для проверки чувствительности и специфичности анализа RT-LAMP было проанализировано в общей сложности 63 тальв-инфицированных тканях и 63 неинфицированных тканях с помощью анализов RT-LAMP и RT-qPCR(таблица 1). Сравнение анализов RT-qPCR и RT-LAMP инфицированных образцов показало положительный результат в 63 (100%) и 51 (80.95%) образцов, соответственно. Кроме того, анализ неинфицированных образцов показал, что все 63 неинфицированных тканей дали отрицательные результаты, используя как RT-qPCR и RT-LAMP анализы (Таблица 1). Этот анализ продемонстрировал надежность анализа RT-LAMP для первичного обнаружения TiLV. Чтобы проверить специфику RT-LAMP анализа, ткани из рыб, инфицированных другими патогенными бактериями и вирусами, в том числе Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas гидрофилы, и Ирисовирус были использованы в качестве шаблонов для RT-LAMP и RT-qPCR анализы. Оба RT-LAMP и RT-qPCR праймеры дали отрицательные результаты без колористельных изменений и без флуоресцентных сигналов в любом из проверенных образцов (Таблица 2). Кроме того, чувствительность анализа RT-LAMP была оценена с помощью последовательного 10-кратного разбавления шаблонов РНК, извлеченных из зараженной TiLV рыбы. Сравнительно, rt-qPCR анализ был более чувствительным, чем RT-LAMP анализ, как RT-qPCR анализ был предел обнаружения 10-8 в то время как метод RT-LAMP требуется 10 -7-разбавления для обнаружения генома TiLV (-7Таблица 2).
Рисунок 1. Нуклеотидные последовательности шести праймеров RT-LAMP, используемых в данном исследовании, которые были характерны для обнаружения TiLV. Положение каждой грунтовки было выровнено на 3-м сегменте генома TiLV (номер присоединения KX631923). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Анализ ампликонов RT-LAMP, полученных из инфицированных TiLV и неинфицированных образцов (А) в 1,5% электрофорезе геля агарозы и (B) путем флуоресцентной визуализации. ( M й 1 кБ ДНК лестница, 1-2 РНК из печени TiLV-инфицированных рыб, 3-4 - кДНК TiLV-инфицированных рыб, 5-6 РНК из слизи TiLV-инфицированных рыб, 7-8 - клеточные линии TiLV-инфицированных рыб, 9 - РНК из печени TiLV-инфицированных рыб (Малайзия), 10 - РНК из печени не-TiLV-инфицированных рыб, 11 - кДНК не-TiLV-инфицированных рыб, 12 РНК от слизи не-TiLV-инфицированных рыб, 13 - нет шаблона управления Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой фигуры.
| Типы образцов | Количество образцов | Достоверность обнаружения (%) | |
| RT-qPCR | RT-ЛАМПА | ||
| Зараженные образцы | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Неинфицированные образцы | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Таблица 1. Проверка RT-LAMP для обнаружения TiLV в образцах инфицированных и неинфицированных рыб с использованием RT-qPCR и RT-LAMP
| Специфика | S.a. | Ф.Н. | Фк | А.х. | I.v. | |||||
| qPCR | Лампы | qPCR | Лампы | qPCR | Лампы | qPCR | Лампы | qPCR | Лампы | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Чувствительность | метод/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Разбавления | ||||||||||
| qPCR | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Лампы | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Таблица 2. Специфика и чувствительность анализrt-LAMP по сравнению с RT-qPCR. Для оценки специфичности, РНК, полученная из рыбной ткани, зараженной другими бактериями или вирусами, в том числе Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.), и Irido-virus (I.v.) Для оценки чувствительности, РНК, полученная из TiLV-инфицированной рыбы была в 10 раз последовательно разбавленной от 100 нг до 1 Fg и используется в качестве шаблонов для RT-qPCR и RT-LAMP. Знаки означает положительные и отрицательные результаты, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Аквакультура промышленности постоянно находится под угрозой вирусных инфекций, которые вызывают значительные экономические потери9,23,28. Например, возникающие TiLV представляет собой серьезную угрозу для тилапии-производителей во многих частях мира1,6,9. До сих пор не было никаких конкретных терапевтических препаратов для предотвращения TiLVD. В то время как разработка вакцины продолжается, эффективная вакцина потребует значительного времени, прежде чем она будет доступна для коммерческих целей. Учитывая эти обстоятельства, строгие измерения биобезопасности, такие как применение дезинфицирующих средств, необходимы в рыбных хозяйствах, чтобы предотвратить распространение TiLVD29,30. В настоящее время одной из наиболее эффективных мер контроля для снижения передачи TiLV является скрининг несовершеннолетних рыб и взрослых на наличие или отсутствие TiLV31. Для целей скрининга диагностический инструмент должен быть быстрым, чувствительным и конкретным, с тем чтобы он мог помочь в ликвидации инфицированных групп населения и предотвращении дальнейшего распространения болезни. Тем не менее, текущие молекулярные анализы для TiLV трудно реализовать на месте. В первую очередь им нужны умелые исследователи и дорогостоящее оборудование. Во-вторых, это может занять несколько дней, чтобы получить лабораторные результаты, что затрудняет контроль и предотвращение распространения болезни быстро15,16.
Чтобы преодолеть эти проблемы, Notomi et al.14 в 2000 году учредила новый амплификации на основе нуклеиновой кислоты, называемый петля-опосредованным изотермальным усилением (LAMP). Реакция LAMP с тех пор успешно применяется для обнаружения различных вирусов рыбы16,,17,,18,,19,,20,21,,22,,23,24,25,26,32,33,34. В этом исследовании мы разработали протокол RT-LAMP для обнаружения TiLV в образцах рыбы тилапии. Хотя чувствительность метода RT-LAMP в 10 раз менее эффективна, чем у RT-qPCR, анализ RT-LAMP может обнаружить наличие генома РНК TiLV всего 100 Fg, что достаточно для обнаружения TiLV у клинически больной рыбы34. Примечательно, что анализ RT-LAMP дает результат в течение 60 минут и требует только простой водяной бани или теплоблока инструментов34, в то время как RT-qPCR анализ занимает больше времени и требует более дорогих в режиме реального времени ПЦР оборудования для анализа15,34. Кроме того, конечный продукт RT-LAMP наблюдался через изменение цвета флуоресцентного красителя от светло-желтого до флуоресцентного зеленого, что делает его видимым невооруженным глазом без каких-либо требований для сложного оборудования34. Эти преимущества делают RT-LAMP пригодным для полевой диагностики. Кроме того, результаты исследования показали, что как печень, так и слизь могут быть использованы для обнаружения TiLV с помощью RT-LAMP. Как и в предыдущих исследованиях, нелетальный образец с использованием слизи позволил диагноз TiLV без убийства рыбы или ценного broodstock35. Недавно, RT-LAMP асссея была разработана для обнаружения китайских и тайских изолятов tiLV нуклеотидных последовательностей в сегменте 1 (S1 региона) с использованием набора из шести грунтов36. Настоящее исследование показало, что разработанный RT-LAMP анализ диагностируется ложно-отрицательный сигнал инфекции TiLV на 27,78% по сравнению с RT-PCR при использовании того же набора грунтовки. При дальнейшем сравнении ложноотрицательный результат был относительно менее отрицательным на уровне 19,05% при обнаружении сегмента 3 TiLV по сравнению с RT-PCR. Сравнивая эффективность метода вирусного обнаружения с другими отчетами, мы смогли обнаружить инфекцию TiLV на уровне 80,95%, в то время как другие работы обнаружили вирус на 72,22%36 и 82,89%37. В целом, можно предположить, что различные компоненты rt-LAMP анализ, например, различные наборы грунтовки и различные целевые сегменты генома TiLV являются важными факторами, влияющими на достоверность проверки.
Хотя анализ RT-LAMP является мощным инструментом для скрининга заболеваний и имеет ряд очевидных преимуществ, это исследование не было без ограничений. Одной из важнейших моментов для rt-LAMP была разработка соответствующего грунтового набора, состоящего из четырех-шести грунтовок. Для содействия формированию стволовых петли структур пЦР продуктов, соответствующие длины целевых генов или нуклеотидных последовательностей должны быть длиннее, чем около 500 bp, в то время как целевые гены RT-PCR обзор должен быть относительно коротким, в диапазоне 50-150 bp14,38,39.
В заключение, разработанный RT-LAMP асссеявляется быстрым, экономичным, чувствительным и специфическим для обнаружения TiLV. Анализ может быть завершен в течение 1 ч по сравнению с 4-5 ч для анализа RT-qPCR. Примечательно, что rt-LAMP обзор является практичным для полевых условий, как положительные результаты можно наблюдать невооруженным глазом, не требуя использования сложного оборудования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Проект финансируется финансово Таиланд исследовательский фонд (TRF) грант номер RDG6050078 и Центр передовых исследований в области сельского хозяйства и продовольствия, Институт перспективных исследований, Университет Касетарт, Бангкок, Таиланд в рамках высшего образования научно-исследовательский фонд и Национальный исследовательский университет проекта Таиланда, Управление Высшего образования комиссии, Министерство образования, Таиланд. Исследование частично поддерживается стипендией для выпускников Высшей школы, Университет Касетсарта. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кванрави Сириканчана за рассказ о видео и Piyawatchara Сикарина для редактирования видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
