Summary
Presentamos un ensayo RT-LAMP para la detección de TiLV en peces de tilapia utilizando instrumentos simples durante un período de tiempo relativamente corto en comparación con las técnicas convencionales rt-PCR. Este protocolo puede ayudar a controlar la propagación epidémica de TiLVD, especialmente en los países en desarrollo.
Abstract
La enfermedad por el virus del lago Tilapia (TiLVD), una enfermedad viral emergente en la tilapia causada por el virus del lago tilapia (TiLV), es un desafío persistente en la industria de la acuicultura que ha dado lugar a la morbilidad masiva y mortalidad de tilapia en muchas partes del mundo. Por lo tanto, es necesario un ensayo diagnóstico eficaz, rápido y preciso para la infección por TiLV para detectar la infección inicial y prevenir la propagación de la enfermedad en la acuicultura. En este estudio, se presenta un método de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) altamente sensible y práctico para detectar el virus del lago tilapia en el tejido de los peces. Una comparación de los ensayos RT-qPCR y RT-LAMP de muestras infectadas reveló resultados positivos en 63 (100%) y 51 (80,95%) muestras, respectivamente. Además, un análisis de muestras no infectadas mostró que los 63 tejidos no infectados arrojaron resultados negativos tanto para los ensayos RT-qPCR como para RT-LAMP. La reactividad cruzada con cinco patógenos en la tilapia se evaluó utilizando RT-LAMP, y todas las pruebas mostraron resultados negativos. Tanto las muestras de hígado como de moco obtenidas de peces infectados mostraron resultados comparables utilizando el método RT-LAMP, lo que sugiere que la mucosidad se puede utilizar en RT-LAMP como un ensayo no letal para evitar la matanza de peces. En conclusión, los resultados demostraron que el ensayo RT-LAMP presentado proporciona un método eficaz para la detección de TiLV en el tejido tilapia dentro de 1 h. Por lo tanto, se recomienda el método como herramienta de cribado en granjas para el diagnóstico rápido de TiLV.
Introduction
La enfermedad por el virus del lago Tilapia (TiLVD) es una enfermedad viral en la tilapia (Oreochromis spp.) que al parecer causa muertes por tilapia en muchas regiones del mundo, incluyendo Asia1,2, Africa, y América. La enfermedad fue reconocida por primera vez durante la mortalidad masiva de tilapia en 2009 en Israel, donde el número de tilapia silvestre en el lago Kinneret se desplomó dramáticamente de 257 a 8 toneladas por año2. La enfermedad es causada por el virus del lago tilapia (TiLV), que ha sido asignado a la familia Amnoonviridae como un nuevo género Tilapinevirus y una nueva especie Tilapia tilapinevirus3. La caracterización genética de TiLV mostró que el virus es un virus de ARN envuelto, de sentido negativo y de una sola cadena que tiene 10 segmentos que codifican 10 proteínas1,2,4. Varias especies de tilapia en el género Sarotherodon, Oreochromis,y Tilapine y otros peces de agua caliente (por ejemplo, gourami gigante (Osphronemus goramy)) han demostrado ser susceptibles a TiLV2,5. Actualmente, este virus continúa propagó globalmente, posiblemente a través del movimiento de peces vivos infectados6,7, mientras que el riesgo de transmisión viral a través de tilapia congelada o su producto es limitado8. La mortalidad sustancial debida a la infección por TiLV tiene el potencial de tener un impacto económico significativamente perjudicial en la industria de la tilapia. Por ejemplo, el impacto económico del síndrome de mortalidad de verano en Egipto asociado con la infección por TiLV se calculó en US$100 millones9. En consecuencia, es importante desarrollar un método de diagnóstico rápido y adecuado para facilitar el control de esta enfermedad en las piscifactorías.
Hasta ahora, el diagnóstico de TiLVD se ha basado en ensayos moleculares, aislamiento viral e histopatología. Se han desarrollado diferentes protocolos e imprimaciones pcR para el diagnóstico TiLV10,,11. Por ejemplo, se ha desarrollado y validado un método de PCR cuantitativo de transcripción inversa basado en verde SYBR (RT-qPCR) con la sensibilidad de detectar tan solo dos copias/L del virus para la deteccióntiLV 10. Otros métodos de PCR para la detección de TiLV incluyen TaqMan cuantitativoPCR 11, RT-PCR2, RT-PCR12anidado y RT-PCR13semianidado. Sin embargo, estos métodos requieren equipos de laboratorio sofisticados y períodos de tiempo relativamente prolongados para producir resultados debido a la complejidad de las reacciones, lo que los hace inadecuados para la aplicación en campo.
El ensayo de amplificación isotérmica (LAMP) mediado por bucle es una aplicación for-field rápida, sencilla y práctica14,15. La técnica emplea el principio de una reacción de desplazamiento de la hebra, mientras que la reacción de amplificación se ejecuta en condiciones isotérmicas sin un sofisticado y costoso ciclor térmico14,,15. En consecuencia, los productos LAMP amplificados o RT-LAMP se analizan en bandas tipo escalera utilizando electroforesis de gel de agarosa con una mancha fluorescente para la visualización segura del ADN o del ARN14 u observación a simple vista para la presencia de turbidez o un precipitado blanco16,,17,,18. Por estas razones, esta técnica se ha utilizado para la detección in situ de diferentes patógenos de peces17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27. El propósito de este estudio fue establecer un ensayo RT-LAMP rápido, sensible y preciso para la detección de TiLV. El ensayo RT-LAMP ofrece cribado para TiLV en muestras de peces en un plazo de 30 minutos. La técnica se puede aplicar para el diagnóstico y la vigilancia de TiLVD.
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Protocol
Este experimento, que implicó el uso de tejido animal, fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Kasetsart, Bangkok, Tailandia (número de protocolo ACKU61-VET-009).
1. Recolección de tejidos
- Euthanizar pescado de tilapia utilizando una sobredosis de aceite de clavo de olor (es decir, más de 3 ml/L). El metanosulfonato de tricaína se puede utilizar como alternativa al aceite de clavo de olor.
- Utilice tijeras y fórceps de mayonesa estériles para abrir el abdomen de la tilapia postmortem e exbotee aproximadamente 30–50 mg de tejido hepático, o utilizando un vidrio de cubierta de microscopio, recoja 100 ml de moco raspando la capa de piel de pescado longitudinalmente (de anterior a posterior) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Proceda al paso de extracción de ARN inmediatamente o mantenga la muestra recogida a 80 oC hasta el experimento. Como el ARN intacto es más sensible que el ADN, utilice materiales y reactivos libres de RNase durante la extracción del ARN.
2. Extracción de ARN
- Para extraer el ARN del tejido hepático, agregue 30–50 mg del tejido de tilapia a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 600–1.000 ml de reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol(Tabla de materiales),y pulver la muestra hasta que sea homogénea utilizando un homogeneizador de tejido de mano. Las muestras de tejido requieren aproximadamente el 10% del reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol. Para las muestras de moco, utilice sólo 300 ml del reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol (3:1).
ADVERTENCIA: El reactivo de extracción de guanidinio-ácido-fenol es tóxico; por lo tanto, la manipulación debe llevarse a cabo con cuidado. Se debe usar equipo de protección, como gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes de seguridad. - Centrifugar la muestra homogeneizada a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente, y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
- Añadir un volumen igual de etanol 95% al tubo y mezclar bien.
- Transfiera la solución a una columna de centrifugado(Tabla de materiales)colocada en un tubo de recogida y centrífuga a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente. Deseche el flujo y transfiera la columna de giro a un nuevo tubo de recogida.
- Añadir 400 l de reactivo de ARN Prelavado(Tabla de Materiales)a la columna y centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente antes de desechar el flujo. Repita este paso una vez más.
NOTA: Para preparar el ARN Pre-Wash, agregue 10 ml de etanol al 95% a 40 ml de concentrado de ARN Pre-Wash. - Añadir 700 l de búfer de lavado de ARN(Tabla de materiales)a la columna y centrifugar a 10.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
NOTA: Para preparar el tampón de lavado de ARN, añada 52 ml de etanol al 95% a 12 ml de concentrado de RNA Wash Buffer. - Eluir la muestra de ARN capturada en la matriz de columna de espín con 100 l de agua libre de nucleasas y centrífuga a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente.
- Mida la concentración del ARN extraído utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes y diluya el ARN a la concentración deseada utilizando agua libre de nucleasas.
NOTA: El valor de absorbancia calificado de OD260/OD280 oscila entre 1,6 y 1,9, lo que indica la pureza aceptable del ARN para el ensayo RT-LAMP. - Continúe con el siguiente paso inmediatamente, o mantenga la muestra a 80 oC hasta su uso.
3. Diseño de imprimación
- Utilice Primer Explorer versión 4 para diseñar las imprimaciones específicas para el RT-LAMP. Vaya al sitio web, https://primerexplorer.jp/e/, y haga clic en el botón PrimerExplorer V4.
- Seleccione el archivo que contiene las secuencias del segmento 3 de TiLV en formato FASTA y, a continuación, haga clic en el botón Primer Diseño.
NOTA: Recuperar las secuencias en formato FASTA del número de adhesión de GenBank KX631923, que representa el virus del lago tilapia TV1 segmento 31. - Para diseñar las imprimaciones, introduzca los siguientes parámetros básicos:
- Un contenido de GC de 40%–60%
- Un amplicon de 280 pares de bases (bp)
- Una temperatura de fusión similar (Tm) entre las imprimaciones con una diferencia máxima de 5 oC
NOTA: Las imprimaciones no deben complementarse entre sí- Evite las regiones de secuencia propensas a formar estructuras secundarias.
- Seleccione el análisis de imprimación de dimer con un mínimo de 3,5 euros para un diseño óptimo para el G más grande, y seleccione los extremos de las imprimaciones con un máximo de 4 euros para un diseño óptimo para el G más pequeño.
- Haga clic en el botón Generar.
NOTA: Una vez que el software termine de procesar los datos de entrada, se mostrarán los resultados de la imprimación(Figura 1).
4. Ensayo RT-LAMP
- Preparar una mezcla maestra RT-LAMP que contenga 2,5 l de búfer de reacción SD II 1, 3 ml de 6 mM MgSO4, 1,4 ml de conjunto dNTP de 1,4 mM, 4 ml de betaína de 0,8 M, 1,3 ml de mezcla de calceína de 0,052 mM, 1 l de 1,6 m de imprimación TiLV-F3, 1 l de imprimación TiLV-B3 de 1,6 M, 1 l de imprimación TiLV-BIP de 0,2 M, 1 l de imprimación TiLV-FIP de 0,2 m, 1 l de polimerasa de ADN Bst de 0,3 U, 1 l de transcriptasa inversa de 0,1 U AMV y 3,8 ml de agua libre de nucleasas por reacción.
NOTA: Prepare el exceso de mezcla maestra que comprende al menos el 10% del volumen total de reacción. - Dispensar 22 l de la mezcla maestra RT-LAMP en un tubo estéril de 1,5 microcentrífugas.
- Añadir 3 l del ARN extraído al tubo de reacción y mezclar la muestra mediante vórtice. Para el control negativo, utilice agua destilada en lugar de materiales de ARN.
- Incubar la reacción a 65 oC durante 60 min, seguido de 80 oC durante 10 min para finalizar la reacción.
- Después de la incubación, observe visualmente los cambios colorimétricos a simple vista. Un resultado positivo aparecerá como un color verde fluorescente.
5. Electroforesis de gel de agarosa
- Preparar un gel de agarosa de 1,5% p/v suspendiendo 0,6 g de polvo de agarosa en 40 ml de 1 tampón TAE. Derretir la mezcla calentándola en un microondas durante 3-5 min hasta que la agarosa se disuelva por completo, y gire para mezclar.
- Deje que la agarosa se enfríe hasta que la temperatura alcance los 65 oC. Vierta 40 ml de la solución de agarosa en una bandeja de gel y agregue un peine al molde de gel.
- Deje que el gel de agarosa se ajuste a temperatura ambiente durante 20-30 min hasta que se haya solidificado por completo. A continuación, retire el peine y coloque el gel en el tanque de gel.
- Añadir un tampón de carrera para cubrir la superficie del gel en el tanque de gel.
- Añadir 10 l de la muestra RT-LAMP y 2 l de tampón de carga de gel de 6x a cada poca. Añadir 5 l de una escalera de ADN de 1 kb al carril de referencia.
- Enchufe la tapa conectada al cátodo y al ánodo conectado a una fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación, establézquela en una constante de 100 V y funcione durante 40 minutos.
- Después de completar la separación del gel, retire el gel de la bandeja de gel. A continuación, manchar el gel escurrido con bromuro de etidio (EtBr) a una concentración de 10 mg/ml durante 7 min y restain hacerlo en agua destilada durante 5 min.
ADVERTENCIA: EtBr es tóxico y se considera carcinógeno; por lo tanto, tenga cuidado al usar este agente. - Exponer el gel a la luz UV utilizando un sistema de documentación de gel donde aparecen las bandas, y tomar una foto del gel.
6. Síntesis complementaria de ADN (ADNc)
- Preparar una mezcla maestra de síntesis de ADNc que contenga 2 ml de tampón RT de 5x, 0,5 ml de mezcla de imprimación, 0,5 ml de enzima RT y 2 ml de agua libre de nucleasas por reacción.
NOTA: Prepare el exceso de mezcla maestra que comprende 1 veces la reacción debido a la pérdida potencial durante el pipeteo. - Dispensar 5 l de la mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
- Añadir 100 ng del ARN extraído diluido (obtenido del paso 2.8) al tubo de reacción, mezclar y girar hacia abajo para mover toda la mezcla a la parte inferior del recipiente.
- Incubar las reacciones a 42 oC durante 60 min, seguido de 98 oC durante 5 min en una máquina pcR. Almacene el ADNc a 20 oC hasta su uso.
7. RT-qPCR
- Preparar una mezcla maestra TiLV qPCR que contenga 0,3 l de imprimación inversa de 10 m, 0,3 ml de imprimación hacia delante de 10 m, 5 ml de 2x de polimerasa de ADN verde SYBR y 0,4 ml de agua libre de nucleasas por reacción. Utilice las siguientes imprimaciones y controles:
Imprimación delantera (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATGGATT-3'
Imprimación inversa (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAAGTTCT-3' - Dispensar 6 l de la mezcla maestra TiLV qPCR en cada pocel de la tira qPCR compatible con el ciclor térmico en tiempo real utilizado.
- Añadir 4 l de la plantilla de ADNc, control negativo (agua libre de nucleasas), control positivo (10 pg/L) y pTiLV (plásmido)10 o plásmido en serie de TiLV plásmido al pozo, y mezclar cada muestra parpadeando. Lleve a cabo cada muestra en triplicado.
- Coloque las reacciones qPCR en el ciclor térmico en tiempo real programado. Establezca el programa qPCR para realizar la incubación a 95 oC durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 95 oC para 10 s y 60 oC para 30 s antes del paso de la curva de fusión en el que la temperatura debe aumentar de 65 oC a 95 oC a incrementos de 0,5 oC/5 s.
- Realice el análisis de datos evaluando las curvas de amplificación y fusión y, a continuación, calcule el número de copias de TiLV utilizando la curva estándar obtenida de los datos utilizando los plásmidos diluidos en serie.
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Representative Results
En este estudio, se desarrolló un ensayo RT-LAMP para detectar la infección por TiLV en la tilapia. Las muestras analizadas se recogieron en 14 granjas ubicadas en diferentes partes de Tailandia entre 2015 y 2016. Los peces infectados y no infectados se agruparon principalmente en función de los diagnósticos físicos y la aparición de TiLVD sintomático. La infección por TiLV se confirmó posteriormente utilizando RT-PCR después del proceso de recolección. La electroforesis de gel de agarosa y la detección de un color verde luminiscente se seleccionaron como métodos de evaluación de los amplicons LAMP(Figura 2). El hígado y la mucosidad de los peces de tilapia infectados y no infectados se caracterizaron por la aparición clínica de los síntomas de la enfermedad de TiLV, incluyendo erosión de la piel, enrojecimiento de la piel, exoftalmos e hinchazón abdominal. Informes anteriores han demostrado el uso de muestras hepáticas en ensayos de diagnóstico molecular para determinar la presencia de TiLV35. Alternativamente, la mucosidad puede ser beneficiosa en el ensayo, ya que puede ayudar a evitar matar a los animales. Los resultados mostraron un patrón de banda de ADN similar a una escalera y un color verde fluorescente en el hígado infectado y muestras de moco de peces infectados(Figura 2),mientras que no se observó ninguna banda de ADN y el color amarillo de la calceína en las mezclas RT-LAMP en tejidos animales no infectados (Figura 2). Curiosamente, una muestra de tilapia infectada por TiLV recolectada de una granja en Malasia también fue diagnosticada como positiva utilizando este ensayo RT-LAMP; sin embargo, se observaron variaciones en el tamaño del producto PCR en comparación con las muestras recogidas de granjas tailandesas locales (Figura 2).
Para verificar la sensibilidad y especificidad del ensayo RT-LAMP, se analizaron un total de 63 tejidos infectados por TiLV y 63 tejidos no infectados utilizando los ensayos RT-LAMP y RT-qPCR (Tabla 1). Una comparación de los ensayos RT-qPCR y RT-LAMP de las muestras infectadas reveló un resultado positivo en 63 (100%) y 51 (80,95%) de las muestras, respectivamente. Además, un análisis de las muestras no infectadas mostró que los 63 tejidos no infectados produjeron resultados negativos utilizando los ensayos RT-qPCR y RT-LAMP (Tabla 1). Este análisis demostró la fiabilidad del ensayo RT-LAMP para la detección primaria de TiLV. Para probar la especificidad del ensayo RT-LAMP, se utilizaron como plantillas para los análisis RT-LAMP y RT-qPCR tejido de peces infectados con otras bacterias y virus patógenos, incluyendo Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilae Iridovirus. Tanto las imprimaciones RT-LAMP como RT-qPCR dieron resultados negativos sin cambios colorimétricos ni señales fluorescentes en ninguna de las muestras analizadas(Tabla 2). Además, la sensibilidad del ensayo RT-LAMP se evaluó utilizando una dilución serial de 10 veces las plantillas de ARN extraídas de peces infectados por TiLV. Comparativamente, el ensayo RT-qPCR fue más sensible que el ensayo RT-LAMP, ya que el ensayo RT-qPCR tenía un límite de detección de 10-8, mientras que el método RT-LAMP requería una dilución de 10-7veces para detectar el genoma de TiLV(Tabla 2).
Figura 1. Las secuencias de nucleótidos de los seis imprimadores RT-LAMP utilizados en este estudio que eran específicos para la detección de TiLV. La posición de cada imprimación se alineó en el segmento 3 del genoma de TiLV (número de adhesión KX631923). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de los amplicons de RT-LAMP obtenidos a partir de las muestras infectadas por TiLV y no infectadas (A) en electroforesis de gel de agarosa al 1,5% y (B) por visualización fluorescente. ( M - Escalera de ADN de 1 kb, 1–2 - ARN de los hígados de los peces infectados por TiLV, 3–4o el ADNc de los peces infectados por TiLV, 5–6o ARN de la mucosidad de los peces infectados por TiLV, 7–8 - líneas celulares de peces infectados por TiLV, ARN 9 de los hígados de peces infectados por TiLV (Malasia), 10 - ARN de los hígados de peces no infectados por tiLV, 11 - el ADNc de peces no infectados por TiLV, 12 - ARN de la mucosidad de los peces no infectados por TiLV, 13 s ningún control de plantilla Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
| Tipos de muestras | Número de muestras | Validez de detección (%) | |
| RT-qPCR | RT-LAMP | ||
| Muestras infectadas | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Muestras no infectadas | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tabla 1. Verificación de RT-LAMP para la detección de TiLV en muestras de peces infectados y no infectados utilizando RT-qPCR y RT-LAMP
| Especificidad | S.a. | F.n. | F.c. | A.h. | I.v. | |||||
| Qpcr | Lámpara | Qpcr | Lámpara | Qpcr | Lámpara | Qpcr | Lámpara | Qpcr | Lámpara | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Sensibilidad | método/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Dilución | ||||||||||
| Qpcr | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lámpara | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Cuadro 2. Especificidad y sensibilidad del ensayo RT-LAMP en comparación con RT-qPCR. Para la evaluación de la especificidad, el ARN obtenido a partir de tejido pesquero infectado con otras bacterias o virus, incluyendo Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.), e Iridovirus (I.v.), se utilizó como plantillas para RT-qPCR y RT-Q-. Para la evaluación de la sensibilidad, el ARN obtenido de peces infectados por TiLV se diluyó en serie 10 veces de 100 ng a 1 fg y se utilizó como plantillas para RT-qPCR y RT-LAMP. Los signos + y – significan resultados positivos y negativos, respectivamente.
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Discussion
La industria acuícola está continuamente amenazada por infecciones virales que causan pérdidas económicas sustanciales99,23,,28. Por ejemplo, el emergente TiLV representa una amenaza importante para los países productores de tilapia en muchas partes del mundo1,6,9. Hasta ahora, no ha habido terapias específicas disponibles para prevenir el TiLVD. Mientras el desarrollo de una vacuna está en curso, una vacuna eficiente requerirá un tiempo sustancial antes de que esté disponible para fines comerciales. Dadas estas circunstancias, son necesarias estrictas mediciones de bioseguridad, como la aplicación de desinfectantes, en las piscifactorías para evitar la propagación de TiLVD29,30. Actualmente, una de las medidas de control más eficientes para reducir la transmisión de TiLV es el cribado de peces juveniles y adultos para la presencia o ausencia de TiLV31. A efectos de cribado, la herramienta de diagnóstico debe ser rápida, sensible y específica para que pueda ayudar a eliminar las poblaciones infectadas y prevenir la propagación de la enfermedad. Sin embargo, los ensayos moleculares actuales para TiLV son difíciles de implementar in situ. En primera instancia, requieren investigadores hábiles y equipos caros. En segundo lugar, puede tomar varios días para obtener los resultados de laboratorio, lo que hace difícil controlar y prevenir la propagación de la enfermedad rápidamente15,16.
Para superar estos problemas, Notomi et al.14 establecieron un nuevo ensayo de amplificación basado en ácido nucleico llamado amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) en 2000. La reacción LAMP se ha aplicado con éxito para detectar varios virus de peces16,,17,,18,,19,,20,21,22,23,24,25,26,32,33,34. En este estudio, desarrollamos un protocolo RT-LAMP para detectar TiLV en muestras de peces tilapia. Aunque la sensibilidad del método RT-LAMP es 10 veces menos eficiente que la del RT-qPCR, el ensayo RT-LAMP puede detectar la presencia de un genoma de ARN TiLV de tan solo 100 fg, lo que es suficiente para la detección de TiLV en peces clínicamente enfermos34. En particular, el ensayo RT-LAMP produce un resultado dentro de 60 minutos y requiere sólo un simple baño de agua o instrumentos de bloque de calor34,mientras que el ensayo RT-qPCR toma más tiempo y requiere equipos de PCR en tiempo real más caros para el análisis15,34. Además, el producto final de la RT-LAMP se observó a través de un cambio de color del tinte fluorescente de amarillo claro a verde fluorescente, haciéndolo visible a simple vista sin ningún requisito para equipos sofisticados34. Estas ventajas hacen que RT-LAMP sea adecuado para el diagnóstico de campo. Además, los resultados del estudio sugirieron que tanto el hígado como la mucosidad se pueden utilizar para la detección de TiLV utilizando RT-LAMP. Al igual que en estudios anteriores, una muestra no letal con moco permitió el diagnóstico de TiLV sin matar peces o valiosos reproductores35. Recientemente, se desarrolló un ensayo RT-LAMP para detectar aislados chinos y tailandeses de secuencias de nucleótidos TiLV en el segmento 1 (región S1) utilizando un conjunto de seis imprimaciones36. El presente estudio demostró que el ensayo desarrollado de RT-LAMP diagnosticó una señal falsa negativa de infección por TiLV en un 27,78% en comparación con RT-PCR cuando se utiliza el mismo conjunto de imprimación. En comparación con la comparación posterior, el resultado falso negativo fue relativamente menor en el 19,05% al detectar el segmento 3 de TiLV en comparación con el RT-PCR. Al comparar la eficiencia del método de detección viral con otros informes, pudimos detectar la infección por TiLV en el 80,95%, mientras que otros trabajos detectaron el virus en 72,22%36 y 82,89%37. En conjunto, puede presumirse que los diferentes componentes del ensayo RT-LAMP, por ejemplo, los diferentes conjuntos de imprimación y los diferentes segmentos específicos del genoma de TiLV son factores importantes que influyen en la validez del ensayo.
Aunque el ensayo RT-LAMP es una poderosa herramienta para la detección de enfermedades y tiene varios beneficios demostrables, este estudio no estuvo sin limitaciones. Uno de los puntos críticos para el ensayo RT-LAMP fue el diseño de un conjunto de imprimación apropiado que comprende de cuatro a seis imprimaciones. Para promover la formación de las estructuras de bucle de tallo de los productos PCR, las longitudes apropiadas de los genes dirigidos o secuencias de nucleótidos debían ser más largas que 500 bp, mientras que los genes específicos del ensayo RT-PCR debían ser relativamente cortos, en el rango de 50-150 bp14,,38,,39.
En conclusión, el ensayo RT-LAMP desarrollado es rápido, rentable, sensible y específico para la detección de TiLV. El análisis se puede completar dentro de 1 h en comparación con 4-5 h para el ensayo RT-qPCR. En particular, el ensayo RT-LAMP es práctico para las condiciones de campo, ya que los resultados positivos se pueden observar a simple vista sin necesidad de utilizar equipos sofisticados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El proyecto está financiado financieramente por el número de subvención del Fondo de Investigación de Tailandia (TRF) RDG6050078 y el Centro de Estudios Avanzados para la Agricultura y la Alimentación, Instituto de Estudios Avanzados, Universidad Kasetsart, Bangkok, Tailandia en el marco del Proyecto de Promoción de la Investigación de Educación Superior y La Universidad Nacional de Investigación de Tailandia, Oficina de la Comisión de Educación Superior, Ministerio de Educación, Tailandia. La investigación es apoyada en parte por la Beca del Programa de Posgrado de la Escuela de Posgrado de la Universidad de Kasetsart. Los autores quieren agradecer al Dr. Kwanrawee Sirikanchana por la narración que habla del video y a Piyawatchara Sikarin por editar el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
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