Summary
Geleneksel RT-PCR tekniklerine göre nispeten kısa bir süre boyunca basit aletler kullanarak tilapia balıklarında TiLV tespiti için bir RT-LAMP tayini salıyoruz. Bu protokol, özellikle gelişmekte olan ülkelerde TiLVD'nin salgınının kontrol altına alabiliyor.
Abstract
Tilapia lake virus (TiLV) tarafından ortaya çıkan tilapia viral hastalığı olan Tilapia lake virus hastalığı (TiLVD), dünyanın birçok yerinde tilapia'nın kitlesel morbidite ve mortalitelerine yol açan kültür balıkçılığı endüstrisinde kalıcı bir sorundur. Bu nedenle tilv enfeksiyonu için etkili, hızlı ve doğru bir tanı testi ilk enfeksiyonu tespit etmek ve kültür balıkçılığı tarımında hastalığın yayılmasını önlemek için gereklidir. Bu çalışmada balık dokusunda tilapia göl virüsünü saptamak için son derece hassas ve pratik ters transkripsiyon döngü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) yöntemi sunulmuştur. Enfekte örneklerin RT-qPCR ve RT-LAMP testlerinin karşılaştırılmasında 63 (%100) pozitif sonuç saptandı. ve 51 (%80,95) örnekleri, sırasıyla. Ayrıca, enfekte edilmemiş örneklerin analizi, 63 enfekte olmayan mendilin hem RT-qPCR hem de RT-LAMP tahlilleri için olumsuz sonuçlar verdiğini göstermiştir. Tilapia beş patojenile çapraz reaktivite RT-LAMP kullanılarak değerlendirildi ve tüm testler de negatif sonuçlar gösterdi. Enfekte balıklardan alınan karaciğer ve mukus örnekleri RT-LAMP yöntemi kullanılarak karşılaştırılabilir sonuçlar göstererek, mukusların rt-LAMP'de balık öldürmemek için öldürücü olmayan bir tahkikat olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Sonuç olarak, sunulan RT-LAMP tahsinin tilapia dokusunda TiLV tespiti için etkili bir yöntem sağladığını göstermiştir. Bu nedenle bu yöntem, TiLV'nin hızlı tanısı için çiftliklerde bir tarama aracı olarak önerilir.
Introduction
Tilapia lake virus disease (TiLVD) tilapia viral bir hastalıktır(Oreochromis spp.) bildirildiğine göre Asya1dahil olmak üzere dünyanın birçok bölgesinde tilapia ölümlerine nedenolan,Dahil Asya 1 ,2,Afrika, ve Amerika. Hastalık ilk olarak 2009 yılında İsrail'de tilapia'nın kitlesel mortalitesi sırasında tanındı ve Kinneret Gölü'ndeki yabani tilapia sayısıyılda257'den 8 tona düştü. Hastalık tilapia göl virüsü neden olur (TiLV), hangi aile Amnoonviridae yeni bir cins Tilapinevirus ve yeni bir tür Tilapia tilapinevirusolarak atanmıştır3. TiLV genetik karakterizasyonu virüs 10 proteinler1,2,,4kodlama 10 segmentleri olan yeni bir zarflı, negatif-sense, tek iplikli RNA virüsü olduğunu gösterdi. Sarotherodoncinsi tilapia çeşitli türler , Oreochromis, ve Tilapine ve diğer sıcak su balıkları (örneğin, dev gourami(Osphronemus goramy)) TiLV duyarlı olduğu gösterilmiştir2,5. Şu anda, bu virüs küresel yayılmaya devam ediyor, muhtemelen enfekte canlı balık hareketi ile6,7, dondurulmuş tilapia veya ürün yoluyla viral iletim riski sınırlı iken8. TiLV enfeksiyonuna bağlı önemli mortalite, tilapia endüstrisi üzerinde önemli ölçüde zararlı bir ekonomik etkiye sahip olabilir. Örneğin, Mısır'da TiLV enfeksiyonu ile ilişkili yaz mortalite sendromunun ekonomik etkisi 100milyon9 ABD Doları olarak hesaplanmıştır. Bu nedenle balık çiftliklerinde bu hastalığın kontrolünü kolaylaştırmak için hızlı ve uygun bir tanı yöntemi geliştirmek önemlidir.
Şimdiye kadar TiLVD tanısı moleküler tahliller, viral izolasyon ve histopatolojiye dayanıyordu. TiLV tanısı için farklı PCR protokolleri ve astarları geliştirilmiştir10,11. Örneğin, bir SYBR yeşil tabanlı ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) yöntemi gibi az iki kopya / μL virüsün algılama duyarlılığı ile geliştirilmişve TiLV algılama için doğrulanmıştır10. TiLV tespiti için diğer PCR yöntemleri TaqMan kantitatif PCR11, RT-PCR2, iç içe RT-PCR12, ve yarı iç içe RT-PCR13içerir. Ancak, bu yöntemler, reaksiyonların karmaşıklığı nedeniyle sonuç vermek için gelişmiş laboratuvar ekipmanı ve nispeten uzun süreler gerektirir, bu da onları saha uygulaması için uygun hale getirir.
Döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) testi hızlı, basit ve pratik alan uygulaması14,15. Teknik bir iplikçik yer değiştirme reaksiyonu prensibini kullanır, amplifikasyon reaksiyonu gelişmiş ve pahalı termal döngücü14olmadan izotermal koşullar altında çalışır iken,15. Sonuç olarak, güçlendirilmiş LAMP ürünleri veya RT-LAMP ürünleri, DNA veya RNA14'ün güvenli görüntülenmesi için floresan leke li agarose jel elektroforezi kullanılarak merdiven benzeri bantlarda veya bulanıklık veya beyaz çökelti 16,17,18varlığı için çıplak gözle gözlem de analiz edilir.18 Bu nedenlerden dolayı, bu teknik farklı balık patojenlerinin yerinde tespiti için kullanılmıştır17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Bu çalışmanın amacı TiLV tespiti için hızlı, hassas ve doğru bir RT-LAMP testi oluşturmaktır. RT-LAMP tne30 dakika içinde balık örneklerinde TiLV için tarama sunuyor. TiLVD tanı ve gözetimi için teknik uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan dokusu kullanımını içeren bu deney, Bangkok, Tayland'daki Kasetsart Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numarası ACKU61-VET-009).
1. Doku toplama
- Aşırı dozda karanfil yağı (yani 3 mL/L'den fazla) kullanarak tilapia balığı namına ötenazi. Triain metansülfonat karanfil yağı alternatif olarak kullanılabilir.
- Postmortem tilapia'nın karnını açmak ve yaklaşık 30-50 mg karaciğer dokusu çıkarmak veya mikroskop kapak camı kullanmak için steril mayo makası ve forceps kullanın, balık derisi tabakasını uzunlamasına kazıyarak (anteriordan posterior'a kadar) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 100 μL mukus toplayın.
- RNA çıkarma adımına hemen devam edin veya toplanan numuneyi deneye kadar −80 °C'de tutun. Bozulmamış RNA DNA'dan daha hassas olduğundan, RNA ekstraksiyonu sırasında RNa içermeyen malzemeler ve reaktifler kullanın.
2. RNA çıkarma
- Karaciğer dokusundan RNA ayıklamak için, 600-1.000 μL guanidinium-acid-phenol ekstraksiyon reaktifi içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüneTable of Materialstilapia dokusunun 30-50 mg ekleyin ve bir el dokusu homogenizer kullanarak homojen kadar örnek pulverize. Doku örnekleri guanidinium-asit-fenol ekstraksiyon reaktifinin yaklaşık %10'una ihtiyaç duyar. Mukus örnekleri için guanidinium-acid-phenol ekstraksiyon reaktifinin sadece 300 μL'sini kullanın (3:1).
DİkKAT: Guanidinium-asit-fenol ekstraksiyon reaktifi toksiktir; bu nedenle, işleme özenle yapılmalıdır. Güvenlik gözlükleri, laboratuvar elbisesi ve güvenlik eldivenleri gibi koruyucu ekipmanlar giyilmelidir. - Homojenize numuneyi oda sıcaklığında 30 s'de 10.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Tüpe %95 eşit hacim ekleyin ve iyice karıştırın.
- Çözeltiyi bir toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa(Malzeme Tablosu)aktarın ve oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'de santrifüj koyun. Akış tan atın ve dönüş sütununu yeni bir toplama tüpüne aktarın.
- Akış tan önce oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'de kolona 400 μL RNA Ön Yıkama reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
NOT: RNA Ön Yıkama'yı hazırlamak için 40 mL RNA Pre-Wash konsantresine 10 mL %95 etanol ekleyin. - Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 10.000 x g'de kolona 700 μL RNA Yıkama Tamponu(Malzeme Tablosu)ekleyin. Kolonu steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
NOT: RNA Yıkama Tamponu hazırlamak için, 12 mL RNA Yıkama Tampon konsantresine 52 mL %95 etanol ekleyin. - Oda sıcaklığında 30 s için 10.000 x g'de 100°L nükleaz içermeyen su ve santrifüj ile spin kolon matrisinde yakalanan RNA örneğini eute.
- Mikro hacimsi spektrofotometre kullanarak çıkarılan RNA'nın konsantrasyonunu ölçün ve çekirdeksiz su kullanarak RNA'yı istenilen konsantrasyona seyreltin.
NOT: OD260/OD280'in nitelikli emici değeri 1,6 ile 1,9 arasında değişmekte dir ve RT-LAMP tsayı için kabul edilebilir RNA saflığını gösterir. - Hemen bir sonraki adıma geçin veya numuneyi kullanıma kadar −80 °C'de tutun.
3. Astar tasarımı
- RT-LAMP için özel astarları tasarlamak için Primer Explorer sürüm 4'nü kullanın. Web sitesine gidin, https://primerexplorer.jp/e/ ve PrimerExplorer V4 düğmesine tıklayın.
- FASTA formatında TiLV'nin 3. Primer Design
NOT: Tilapia lake virus TV1 segment 31'itemsil eden GenBank katılım numarası KX631923'ten FASTA formatında dizileri alın. - Astarları tasarlamak için aşağıdaki temel parametreleri girdi:
- %40-60 GC içeriği
- ≥280 baz çifti (bp) bir amplicon
- Maksimum 5 °C'lik farka sahip astarlar arasında benzer bir erime sıcaklığı (Tm)
NOT: Astarlar birbirini tamamlamamalıdır- Sekonder yapılar oluşturmaya yatkın sıralı bölgelerden kaçının.
- En büyük ΔG için en uygun tasarım için en az −3,5 ile dimer astar analizini seçin ve daha küçük ΔG için en uygun tasarım için en fazla −4 olan astarların uçlarını seçin.
- Oluştur düğmesini tıklatın.
NOT: Yazılım giriş verilerini işlemeyi bitirdikten sonra astar sonuçları gösterilir (Şekil 1).
4. RT-LAMP teşp
- 2.5 μL 1x SD II reaksiyon tamponu, 3 μL 6 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP set, 0.8 M betain, 0.052 mM kalsin karışımının 1.3 l'si, 1.6μM TiLV-F3 asal 1 000 000 000 calcein karışımı, 1 μL'lik 1.6 mM MgSO reaksiyon tamponu içeren bir RT-LAMP ana karışımı hazırlayın, 1 μL 1,6 μM TiLV-B3 astar, 1 μL 0,2 μM TiLV-BIP astar, 0,2 μM TiLV-FIP astar, 1 μL 0,3 Bst DNA polimeraz, 1 μL 0,1 U AMV ters transkripsiyonu ve reaksiyon başına 3,8 μL nükleazsız su.
NOT: Toplam reaksiyon hacminin en az %10'unu oluşturan fazla ana karışımı hazırlayın. - RT-LAMP ana karışımının 22 μL'sini steril 1,5 mikrosantrifüj tüpe dağıtın.
- Çıkarılan RNA'nın 3 μL'sini reaksiyon tüpüne ekleyin ve girdap yaparak numuneyi karıştırın. Negatif kontrol için RNA malzemeleri yerine distile su kullanın.
- Reaksiyonu 65 °C'de 60 dk, ardından reaksiyonu sona erdirmek için 10 dk için 80 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, kolorimetrik değişiklikleri çıplak gözle görsel olarak gözlemleyin. Olumlu bir sonuç floresan yeşil renk olarak görünür.
5. Agarose jel elektroforez
- 1x TAE tamponunun 40 mL'inde 0,6 g agarose tozu askıya alarak %1,5 w/v agarose jel hazırlayın. Agarose tamamen çözülene kadar 3-5 dakika mikrodalga da ısıtarak karışımı eritin ve karıştırmak için girdap.
- Sıcaklık 65 °C'ye ulaşana kadar agarose'un soğumasını bekleyin. Bir jel tepsiüzerine agarose çözeltisi 40 mL dökün ve jel kalıbına bir tarak ekleyin.
- Agarose jel tamamen katılaşmış kadar 20-30 dakika oda sıcaklığında ayarlamak için izin verin. Sonra tarak çıkarın ve jel tankına yerleştirin.
- Jel tankıjel yüzeyini kapsayacak şekilde çalışan bir tampon ekleyin.
- Her kuyuya 10 μL RT-LAMP numunesi ve 2 μL 6x jel yükleme tamponu ekleyin. Referans şeridine 5 μL 1 kb DNA merdiveni ekleyin.
- Katota bağlı kapağı ve güç kaynağına bağlı anod'u takın. Güç kaynağını açın, sabit 100 V'e ayarlayın ve 40 dakika çalıştırın.
- Jel ayrımını tamamladıktan sonra jel tepsisinden çıkarın. Daha sonra 7 dk için 10 mg/mL konsantrasyonda ethidium bromür (EtBr) kullanarak süzülmüş jelleke ve 5 dakika distile suda restain.
DİkKAT: EtBr toksiktir ve karsinojen olarak kabul edilir; bu nedenle, bu aracıyı kullanırken dikkatli olun. - Bantların göründüğü bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak jeli UV ışığına maruz bırakın ve jelin fotoğrafını çekin.
6. Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi
- Reaksiyon başına 2 μL 5x RT tamponu, 0,5 μL astar karışımı, 0,5 μL RT enzimi ve reaksiyon başına 2 μL çekirdeksiz su içeren bir cDNA sentezi ana karışımı hazırlayın.
NOT: Pipetleme sırasında ki potansiyel kayıp nedeniyle reaksiyonun 1x'inden oluşan fazla ana karışımı hazırlayın. - Ana karışımın 5 μL'sini steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dağıtın.
- Reaksiyon tüpüne seyreltilmiş çıkarılan RNA'nın (adım 2.8'den elde edilen) 100 ng'sini ekleyin, tüm karışımı geminin dibine taşımak için karıştırın ve aşağı doğru döndürün.
- Reaksiyonları 42 °C'de 60 dakika, ardından pcr makinede 5 dk için 98 °C'de kuluçkaya yatırın. CDNA'yı kullanıma kadar −20 °C'de saklayın.
7. RT-qPCR
- 0,3 μL 10 μM ters astar, 0,3 μL 10 μM ileri astar, 5 μL 2x SYBR Yeşil DNA polimeraz ve reaksiyon başına 0,4 μL nükleaz içermeyen su içeren bir TiLV qPCR ana karışımı hazırlayın. Aşağıdaki astarları ve denetimleri kullanın:
İleri astar (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATGGATT-3'
Ters astar (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3' - TiLV qPCR ana karışımının 6 μL'sini kullanılan gerçek zamanlı termal döngüile uyumlu qPCR şeridinin her kuyuya dağıtın.
- CDNA şablonunun 4 μL'sini, negatif kontrolü (nükleaziçermeyen su), pozitif kontrol (10 pg/μL) ve pTiLV (plazmid)10 veya seri olarak seyreltilmiş TiLV plazmidini kuyuya ekleyin ve her numuneyi hareket ettirerek karıştırın. Her örneği triplicate olarak iletin.
- QPCR reaksiyonlarını programlanmış gerçek zamanlı termal döngüye yerleştirin. 3 dakika boyunca 95 °C'de kuluçka yı yapmak için qPCR programını ayarlayın, ardından 10 s için 95 °C'lik 40 devir ve 30 s için 60 °C'lik 40 döngü, sıcaklığın 0,5 °C/5 s artık larla 65 °C'den 95 °C'ye yükselmesi gereken erime eğrisi adımından önce 30 s'ye ayarlayın.
- Amplifikasyon ve erime eğrilerini değerlendirerek veri analizini yapın ve seri olarak seyreltilmiş plazmidleri kullanarak verilerden elde edilen standart eğriyi kullanarak TiLV kopyalarının sayısını hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada tilapia'da TiLV enfeksiyonunu saptamak için rt-LAMP teşbelli geliştirilmiştir. Test edilen numuneler 2015-2016 yılları arasında Tayland'ın farklı bölgelerinde bulunan 14 çiftlikten toplanmıştır. Enfekte ve enfekte olmayan balıklar öncelikle fiziksel tanılara ve semptomatik TiLVD'nin görünüşüne göre gruplandı. TiLV enfeksiyonu daha sonra toplama işleminden sonra RT-PCR kullanılarak doğrulandı. Agarose jel elektroforezi ve Parlak yeşil rengin saptanması LAMP amfikonslarının değerlendirme yöntemleri olarak seçilmiştir (Şekil 2). Enfekte ve enfekte olmamış tilapia balıklarının karaciğeri ve mukusu, deri erozyonu, deri kızarıklığı, eksoftalmos ve karın şişmesi gibi TiLV hastalığı semptomlarının klinik görünümü ile karakterizedir. Önceki raporlar, TiLV35'invarlığını belirlemek için moleküler tanı salalarında karaciğer örneklerinin kullanıldığını göstermiştir. Alternatif olarak, mukus hayvanları öldürmemeye yardımcı olabilir gibi tsay yararlı olabilir. Sonuçlar, enfekte olmuş balıkların karaciğer ve mukus örneklerinde merdiven benzeri BIR DNA bandı deseni ve floresan yeşil renk(Şekil 2),enfekte olmayan hayvan dokularında RT-LAMP karışımlarında DNA bandı ve kalsin sarısı gözlenmezken(Şekil 2). İlginçtir, Malezya'da bir çiftlikten toplanan bir TiLV enfekte tilapia örnek de bu RT-LAMP testi kullanılarak pozitif olarak teşhis edildi; ancak, yerel Tay çiftliklerinden toplanan örneklere göre PCR ürün boyutundaki değişimler gözlenmiştir(Şekil 2).
RT-LAMP tahlillerinin hassasiyetini ve özgüllüğünü doğrulamak için, toplam 63 TiLV enfekte doku ve 63 enfekte olmamış doku rt-LAMP ve RT-qPCR tahlilleri kullanılarak analiz edildi (Tablo 1). Enfekte örneklerin RT-qPCR ve RT-LAMP testlerinin karşılaştırılması nda 63 (%100) pozitif sonuç saptandı. ve 51 (%80,95) örneklerin sırasıyla. Ayrıca, enfekte olmayan örneklerin analizi, 63 enfekte olmayan mendilin hem RT-qPCR hem de RT-LAMP tahlilleri kullanılarak negatif sonuçlar verdiğini göstermiştir(Tablo 1). Bu analiz, birincil TiLV tespiti için RT-LAMP testinin güvenilirliğini göstermiştir. RT-LAMP testinin özgüllüğünü test etmek için, Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilave Iridovirus gibi diğer patojenik bakteri ve virüslerle enfekte olan balıklardan elde edilen doku, RT-LAMP ve RT-qPCR analizleri için şablon olarak kullanılmıştır. Hem RT-LAMP hem de RT-qPCR astarları, test edilen örneklerin hiçbirinde kolorimetrik değişiklik ve floresan sinyal olmadan negatif sonuçlar vermiştir(Tablo 2). Ayrıca, RT-LAMP tsay duyarlılığı TiLV enfekte balık çıkarılan RNA şablonları bir seri 10 kat seyreltme kullanılarak değerlendirildi. Rt-qPCR tayini rt-qPCR tayini 10-8 algılama limitine sahipken, RT-LAMP yöntemi TiLV genomunu saptamak için 10-7kat seyreltme gerektirdiğinden RT-LAMP tayini RT-LAMP tayini daha hassastır(Tablo 2).
Şekil 1. Bu çalışmada kullanılan altı RT-LAMP astarının nükleotit dizileri TiLV tespitine özgüdür. Her astarın konumu TiLV genomunun 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. TiLV ile enfekte olmuş ve enfekte olmamış örneklerden (A) elde edilen RT-LAMP amfikonlarının (%1,5 agarose jel elektroforezve (B) floresan görüntüleme ile analizi. M = 1 kb DNA merdiveni, 1–2 = TiLV enfekte balıkların karaciğerlerinden RNA, 3-4 = TiLV enfekte olmuş balığın cDNA'sı, 5-6 = TiLV enfekte balığın mukusundan RNA, 7-8 = TiLV enfekte balık hücre hatları, 9 = RNA TiLV-enfekte balık karaciğerlerinden (Malezya), 10 = RNA olmayan TiLV-enfekte balık karaciğerlerinden, 11 = Olmayan TiLV-enfekte balık cDNA, 12 = RNA olmayan TiLV enfekte balık mukus, 13 = bu şeklin daha büyük bir sürümünü görmek için buraya tıklayın.
| Örnek türleri | Örnek sayısı | Algılama geçerliliği (%) | |
| RT-qPCR | RT LAMBA | ||
| Enfekte örnekler | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Enfekte olmayan numuneler | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tablo 1. RT-qPCR ve RT-LAMP kullanılarak enfekte ve enfekte edilmemiş balık örneklerinde TiLV tespiti için RT-LAMP doğrulaması
| Özgüllüğü | S.a. | Faruk. | Fc. | Acar. | ıv. | |||||
| qPCR | Lamba | qPCR | Lamba | qPCR | Lamba | qPCR | Lamba | qPCR | Lamba | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Duyarlılık | yöntemi/ | 10-1 arası | 10-2 arası | 10-3 arası | 10-4 arası | 10-5 arası | 10-6 arası | 10-7 arası | 10-8 arası | 10-9 arası |
| Seyreltme | ||||||||||
| qPCR | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lamba | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tablo 2. RT-QPCR ile karşılaştırıldığında RT-LAMP tözünün özgüllüğü ve hassasiyeti. Özgüllük değerlendirmesi için, Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.) ve Iridovirus (I.v.) gibi diğer bakteri veya virüslerle enfekte olan balık dokusundan elde edilen RNA, RT-qPCR ve LAMP-LAMP şablonu olarak kullanılmıştır. Duyarlılık değerlendirmesi için TiLV enfekte balıklardan elde edilen RNA 100 ng'den 1 fg'ye 10 kat seri olarak seyreltilmiş ve RT-qPCR ve RT-LAMP için şablon olarak kullanılmıştır. + ve – işaretleri sırasıyla olumlu ve olumsuz sonuçlar anlamına gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültür balıkçılığı endüstrisi sürekli önemli ekonomikkayıplaraneden viral enfeksiyonlar tarafından tehdit edilir9,23,28. Örneğin, ortaya çıkan TiLV dünyanın birçok yerinde tilapia üreten ülkeler için büyük bir tehdit oluşturmaktadır1,6,9. Şimdiye kadar, TiLVD önlemek için özel bir tedavi mevcut olmuştur. Bir aşının geliştirilmesi devam ederken, etkili bir aşı ticari amaçlar için kullanılabilir önce önemli bir zaman gerektirir. Bu koşullar altında, sıkı biyogüvenlik ölçümleri, dezenfektanların uygulanması gibi, TiLVD yayılmasını önlemek için balık çiftliklerinde gereklidir29,30. Şu anda, TiLV iletimini azaltmak için en verimli kontrol önlemlerinden biri tilv31varlığı veya yokluğu için genç balık ve yetişkinlerin taranması. Tarama amacıyla, tanı aracının hızlı, duyarlı ve spesifik olması gerekir, böylece enfekte popülasyonların ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir ve hastalığın daha da yayılmasını önlemek. Ancak, TiLV için mevcut moleküler tahlilleri yerinde uygulamak zordur. İlk etapta, onlar yetenekli araştırmacılar ve pahalı ekipman gerektirir. İkincisi, zor kontrol etmek ve hastalığın yayılmasını önlemek için yapar laboratuvar sonuçları elde etmek için birkaç gün sürebilir15,16.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, Notomi ve ark.14 2000 yılında döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) adı verilen yeni bir nükleik asit bazlı amplifikasyon testini oluşturmuştur. LAMP reaksiyonu beri başarıyla çeşitli balık virüsleri16,17,,18,19,20,2121,22,23,24,25,26,32,33,34tespit etmek için uygulanmıştır . Bu çalışmada tilapia balık örneklerinde TiLV'yi saptamak için bir RT-LAMP protokolü geliştirdik. RT-LAMP yönteminin hassasiyeti RT-qPCR'den 10 kat daha az verimli olmasına rağmen, RT-LAMP tayini, klinik olarak hastalıklı balıklarda TiLV tespiti için yeterli olan 100 fg gibi düşük bir TiLV RNA genomunun varlığını tespit edebilir34. Özellikle, RT-LAMP tahlil 60 dakika içinde bir sonuç verir ve sadece basit bir su banyosu veya ısı bloğu aletlerigerektirir 34, RT-qPCR tahlil daha fazla zaman alır ve analiz için daha pahalı gerçek zamanlı PCR ekipman gerektirir15,34. Ayrıca, RT-LAMP son ürün açık sarı floresan yeşil floresan boya renk değişikliği ile gözlendi, sofistike ekipman için herhangi bir ihtiyaç olmadan çıplak gözle görülebilir hale34. Bu avantajlar RT-LAMP'yi saha tanısı için uygun kılmıştır. Ayrıca çalışma bulguları rt-LAMP kullanılarak TiLV tespiti için hem karaciğer hem de mukus kullanılabileceğini ileri sürmüştür. Önceki çalışmalara benzer şekilde, mukus kullanarak öldürücü olmayan bir örnek balık veya değerli broodstock öldürmeden TiLV tanısı izin35. Son zamanlarda, bir RT-LAMP tsay segment 1 TiLV nükleotit dizileri Çince ve Tay izole tespit etmek için geliştirilmiştir (S1 bölge) altı astar bir dizi kullanarak36. Bu çalışma, geliştirilen RT-LAMP teşrinin aynı astar seti kullanılırken RT-PCR ile karşılaştırıldığında %27,78 oranında TiLV enfeksiyonu nun yanlış negatif sinyalini teşhis ettiğini göstermiştir. Daha fazla karşılaştırma, rt-PCR ile karşılaştırıldığında TiLV segment 3 tespit ederken yanlış negatif sonuç nispeten% 19.05 daha az oldu. Viral algılama yönteminin etkinliğini diğer raporlarla karşılaştırırken TiLV enfeksiyonunu %80,95 oranında tespit edebildik, diğer çalışmalarda ise virüsü %72,2236 ve %82,8937olarak tespit ettik. Rt-LAMP testinin farklı bileşenlerinin, örneğin, farklı astar kümelerinin ve TiLV genomunun farklı hedefli segmentlerinin, testin geçerliliğini etkileyen önemli faktörler olduğu varsayımına varılabilir.
RT-LAMP tsay hastalık taraması için güçlü bir araç olmasına ve çeşitli kanıtlanabilir faydaları olmasına rağmen, bu çalışma sınırlamalar olmadan değildi. RT-LAMP tsay için kritik noktalardan biri, dört ila altı astardan oluşan uygun bir astar setinin tasarımıydı. PCR ürünlerinin kök-döngü yapılarının oluşumunu teşvik etmek için, hedeflenen genlerin veya nükleotit dizilerinin uygun uzunluklarının yaklaşık 500 bp'den daha uzun olması gerekirken, RT-PCR titrenin hedeflenen genlerinin 50-150 bp14,38,39aralığında nispeten kısa olması gerekiyordu.39
Sonuç olarak, geliştirilen RT-LAMP testi hızlı, uygun maliyetli, hassas ve TiLV tespitiiçin özeldir. Analiz, RT-qPCR tahlilleri için 4-5 saat ile karşılaştırıldığında 1 saat içinde tamamlanabilir. Özellikle RT-LAMP testi, sofistike ekipman kullanımına gerek kalmadan çıplak gözle gözle görülebildiği için saha koşulları için pratiktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Proje mali Tayland Araştırma Fonu (TRF) hibe numarası RDG6050078 ve Merkezi Tarım ve Gıda İleri Çalışmalar, İleri Çalışmalar Enstitüsü, Kasetsart Üniversitesi, Bangkok, Tayland Yüksek Öğretim Araştırma Teşvik ve Ulusal Araştırma Üniversitesi Projesi, Yüksek Öğretim Komisyonu Ofisi, Eğitim Bakanlığı, Tayland altında finanse edilmektedir. Araştırma kısmen Kasetsart Üniversitesi Lisansüstü Programı Bursu ile desteklenmiştir. Yazarlar dr Kwanrawee Sirikanchana video ve Piyawatchara Sikarin video düzenleme için konuşma için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
