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जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में माइक्रोबियल व्यवहार की जांच करने के लिए सीटू केमोटैक्सिस परख में

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/61062
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zürich, 2Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 3School of Oceanography, University of Washington

Summary

यहां प्रस्तुत एक सीटू केमोटैक्सिस परख के लिए प्रोटोकॉल है, जो हाल ही में विकसित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस है जो पर्यावरण में सीधे माइक्रोबियल व्यवहार के अध्ययन को सक्षम बनाता है।

Abstract

माइक्रोबियल व्यवहार, जैसे गतिशीलता और केमोटैक्सिस (रासायनिक ढाल के जवाब में अपने आंदोलन को बदलने के लिए सेल की क्षमता), बैक्टीरियल और आर्कियल डोमेन में व्यापक हैं। केमोटैक्सिस के परिणामस्वरूप विषम वातावरण में पर्याप्त संसाधन अधिग्रहण लाभ हो सकते हैं। यह सहजीवी बातचीत, रोग और वैश्विक प्रक्रियाओं, जैसे बायोजियोकेमिकल साइकिलिंग में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, वर्तमान तकनीकों प्रयोगशाला के लिए केमोटैक्सिस अनुसंधान को प्रतिबंधित और क्षेत्र में आसानी से लागू नहीं कर रहे हैं । यहां प्रस्तुत एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल है, जो सीटू केमोटैक्सिस परख (आईएससीए) की तैनाती के लिए है, एक ऐसा उपकरण जो प्राकृतिक वातावरण में सीधे माइक्रोबियल केमोटैक्सिस की मजबूत पूछताछ को सक्षम बनाता है। आईएससीए एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस है जिसमें 20 वेल सरणी होती है, जिसमें ब्याज के रसायनों को लोड किया जा सकता है । एक बार जलीय वातावरण में तैनात होने के बाद, रसायन कुओं से बाहर निकलते हैं, एकाग्रता ढाल बनाते हैं जो रोगाणुओं की भावना रखते हैं और केमोटैक्सिस के माध्यम से कुओं में तैराकी करके जवाब देते हैं। अच्छी सामग्री का नमूना लिया जा सकता है और इसका उपयोग (1) प्रवाह साइटोमेट्री, (2) अलग-थलग और संस्कृति उत्तरदायी सूक्ष्मजीवों के माध्यम से विशिष्ट यौगिकों के लिए केमोटेक्टिक प्रतिक्रियाओं की ताकत को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, और (3) आणविक तकनीकों के माध्यम से प्रतिक्रिया देने वाली आबादी की पहचान और जीनोमिक क्षमता की विशेषता है। आईएससीए एक लचीला मंच है जिसे किसी भी प्रणाली में जलीय चरण के साथ तैनात किया जा सकता है, जिसमें समुद्री, मीठे पानी और मिट्टी के वातावरण शामिल हैं।

Introduction

विविध सूक्ष्मजीव बद पोषक तत्वों के वातावरण का दोहन करने, मेजबान खोजने या हानिकारक परिस्थितियों से बचने के लिए गतिशीलता और केमोटैक्सिस का उपयोग करते हैं1,,2,,3। ये माइक्रोबियल व्यवहार बदले में रासायनिक परिवर्तन4 की दरों को प्रभावित कर सकते हैं और स्थलीय, मीठे पानी और समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों2, 5,5में सहजीवी भागीदारी को बढ़ावा देते हैं।

पिछले 60 वर्षों से प्रयोगशाला स्थितियों के अंतर्गत चेमोटैक्सिस का व्यापक अध्ययन कियागयाहै . केमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए पहली मात्रात्मक विधि, केशिका परख, बैक्टीरिया6के निलंबन में डूबे ख्यात केमोएट्रेक्ट से भरी एक केशिका ट्यूब शामिल है। ट्यूब से बाहर रसायन का प्रसार एक रासायनिक ढाल बनाता है, और केमोटेक्टिक बैक्टीरिया ट्यूब7में माइग्रेट करके इस ढाल का जवाब देते हैं। केशिका परख के विकास के बाद से, आज भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, कई अन्य तकनीकों को तेजी से नियंत्रित भौतिक/रासायनिक स्थितियों के तहत कीमोटैक्सिस का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, जिसमें सबसे हाल ही में माइक्रोफ्लुइडिक्स8,,9,,10का उपयोग शामिल है।

माइक्रोफ्लुइडिक्स, हाई-स्पीड वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ, ध्यान से नियंत्रित ढाल के जवाब में एकल कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने में सक्षम बनाता है। हालांकि इन तकनीकों काफी chemotaxis के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है, वे प्रयोगशाला के उपयोग के लिए प्रतिबंधित किया गया है और पर्यावरण प्रणालियों में क्षेत्र तैनाती के लिए आसानी से अनुवाद नहीं है । नतीजतन, प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों के भीतर केमोटैक्सिस का उपयोग करने के लिए बैक्टीरिया के प्राकृतिक समुदायों की क्षमता की जांच नहीं की गई है; इस प्रकार, केमोटैक्सिस के संभावित पारिस्थितिक महत्व की वर्तमान समझ कृत्रिम प्रयोगशाला स्थितियों और प्रयोगशाला-सुसंस्कृत जीवाणु आइसोलेशन की सीमित संख्या की ओर पक्षपातपूर्ण है। हाल ही में विकसित आईएससीए इन सीमाओं को पार करता है11.

आईएससीए केशिका परख के सामान्य सिद्धांत पर बनाता है; हालांकि, यह प्राकृतिक पर्यावरण में रुचि के यौगिकों की ओर केमोटैक्सिस के मात्राकरण के लिए एक अत्यधिक दोहराया, आसानी से तैनात करने योग्य प्रयोगात्मक मंच देने के लिए आधुनिक माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का उपयोग करता है। यह प्रत्यक्ष अलगाव या आणविक तकनीकों द्वारा केमोटेक्टिक सूक्ष्मजीवों की पहचान और लक्षण वर्णन की भी अनुमति देता है। जबकि पहला काम करने वाला उपकरण स्वयं-निर्मित और ग्लास और पीडीएमएस11का निर्माण किया गया था, नवीनतम इंजेक्शन-ढाला संस्करण पॉली कार्बोनेट से बना है, एक उच्च मानकीकृत निर्माण प्रक्रिया का उपयोग करके (डिवाइस के नवीनतम संस्करण में रुचि के लिए, संबंधित लेखकों से संपर्क किया जा सकता है)।

आईएससीए क्रेडिट कार्ड के आकार का है और इसमें 5 x 4 अच्छी तरह से सरणी में वितरित 20 कुओं के होते हैं, प्रत्येक एक छोटे बंदरगाह (व्यास में 800 माइक्रोन) द्वारा बाहरी जलीय पर्यावरण से जुड़े होते हैं; चित्रा 1)। कुओं में भरे ख्यात केमोएट्रेक्ट्स बंदरगाह के माध्यम से पर्यावरण में फैलते हैं, और केमोटैक्टिक रोगाणु बंदरगाह के माध्यम से अच्छी तरह से तैराकी करके प्रतिक्रिया करते हैं। चूंकि कई कारक प्राकृतिक वातावरण में आईएससीए प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, इस कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल नए उपयोगकर्ताओं को संभावित बाधाओं को दूर करने और प्रभावी तैनाती की सुविधा प्रदान करने में मदद करेगा।

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Protocol

हम परिणामों को अनुकूलित करने के लिए फ़ील्ड प्रयोगों से पहले अनुभाग 1 को निष्पादित करने की सलाह देते हैं.

1. प्रयोगशाला अनुकूलन

नोट: अनुकूलन प्रक्रिया में वर्णित वॉल्यूम एक आईएससीए (20 कुओं से बना) के लिए पर्याप्त हैं।

  1. ब्याज के रसायन की तैयारी
    नोट: प्रत्येक रसायनट्रैक्ट के लिए इष्टतम एकाग्रता को अक्सर क्षेत्र की तैनाती से पहले प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। रासायनिक एकाग्रता क्षेत्र स्रोत (आईएससीए वेल) से दूरी के साथ परिमाण में कमी करेगा, जिसका अर्थ है कि पर्यावरण में सूक्ष्मजीवों द्वारा अनुभव की गई एकाग्रता डिवाइस के अंदर मौजूद की तुलना में कम होगी। आईएससीए में अच्छी तरह से उपयोग करने के लिए इष्टतम एकाग्रता केमोएट्रेक्ट्ट की प्रसार दर पर निर्भर करती है। यदि कुएं में एकाग्रता बहुत कम है (रोगाणुओं की पहचान सीमा के करीब), तो कोई सकारात्मक केमोटैक्सिस नहीं देखा जाएगा। इसके विपरीत, यदि कुएं में एकाग्रता बहुत अधिक है, तो तत्काल वातावरण में एकाग्रता भी अधिक होगी और माइक्रोबियल संचय अंदर के बजाय आईएससीए कुओं के ऊपर हो जाएगा। इसलिए, क्षेत्र तैनाती के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए प्रत्येक यौगिक के लिए प्रयोगशाला की स्थिति में कमजोर पड़ने श्रृंखला की जानी चाहिए। आदर्श रूप से, प्रयोगशाला परिणामों की पुष्टि करने के लिए क्षेत्र में एक एकाग्रता सीमा का भी परीक्षण किया जाना चाहिए।
    1. उपयुक्त नमक एकाग्रता (जैसे, फॉस्फेट-बफर नमकीन [पीबीएस] या कृत्रिम समुद्री जल) युक्त उपयुक्त माध्यम के 2.5 एल तैयार करें। एक पेरिस्टाल्टिक या वैक्यूम पंप और ऑटोक्लेव का उपयोग करके 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर के साथ माध्यम को फ़िल्टर करें।
    2. बाँझ माध्यम के 1 एमएल में केमोएट्रेक्टेंट का 10 एमएमएल घोल तैयार करें। कणों और संभावित प्रदूषकों को हटाने के लिए 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ केमोएट्रेक्ट्ट समाधान को फ़िल्टर करें।
      नोट: आदर्श रूप से, अंतिम समाधान में केमोएट्रेक्ट्ट के अलावा कोई कार्बनिक यौगिक मौजूद नहीं होना चाहिए।
  2. कमजोर पड़ने श्रृंखला द्वारा एकाग्रता रेंज
    1. श्रृंखला में फ़िल्टर किए गए केमोएट्रेक्ट स्टॉक समाधान को पतला करें, (उदाहरण के लिए) 10 mm से 100 माइक्रोन तक।
      नोट: कम से कम एक 0.7 एमएल अंतिम मात्रा प्रति एकाग्रता परीक्षण की जरूरत है।
  3. आईएससीए लोड हो रहा है
    1. फ़िल्टर किए गए केमोएट्रेक्ट्ट के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें और इसे 27 जी सिरिंज से कनेक्ट करें। बंदरगाह के साथ आईएससीए को ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है, धीरे-धीरे पदार्थ इंजेक्ट करें जब तक कि बंदरगाह के शीर्ष पर एक छोटी बूंद दिखाई न दे।
      नोट: 1) प्रत्येक कमजोर पड़ने या पदार्थ को क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए एक अलग सिरिंज और सुई के साथ इंजेक्ट किया जाना चाहिए। 2) यह छोटी बूंद महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सुनिश्चित करता है कि कोई हवा बुलबुला बंदरगाह के भीतर फंस गया है, जो रोगाणुओं की क्षमता को बंदरगाह के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए ख़राब कर सकता है । 3) आगे के विश्लेषण के लिए पर्याप्त न्यूनतम मात्रा प्रदान करने के लिए प्रति पदार्थ या एकाग्रता (पांच कुओं) को एक पूरी पंक्ति भरने की सिफारिश की जाती है। 4) आईएससीए प्रति एक पंक्ति नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करना चाहिए और फ़िल्टर किए गए माध्यम से भरा जाना चाहिए जिसमें रोगाणुओं को निलंबित कर दिया जाएगा। यह उपचार आईएससीए कुओं में रोगाणुओं द्वारा यादृच्छिक गतिशीलता के प्रभाव के लिए खाता है और इसका उपयोग कीमोएट्रेक्ट्ट युक्त उपचार को सामान्य बनाने के लिए किया जाना चाहिए।
  4. प्रयोगशाला में तैनाती
    1. रातोंरात, 1% समुद्री शोरबा (समुद्री बैक्टीरिया के लिए) या 1% lysogeny शोरबा (एलबी, ताजे पानी के बैक्टीरिया के लिए) के साथ समृद्ध 5 मिलीएल संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
      नोट: मोटिवल बैक्टीरियल आइसोलेट या प्राकृतिक जीवाणु समुदायों का उपयोग प्रयोगशाला तैनाती के लिए किया जा सकता है।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) और 180 आरपीएम पर 12 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें। 12 घंटे के बाद, यह सुनिश्चित करें कि माइक्रोबियल समुदाय एक माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा गतिशील हैं।
    3. 10 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर संस्कृति को स्पिन करें और उपयुक्त माध्यम के 150 एमएल में 1/100 को फिर से 1/100 करें (उदाहरण के लिए, फ़िल्टर किए गए समुद्री जल, फ़िल्टर किए गए मीठे पानी)।
    4. 200 एमएल क्षमता ट्रे की सपाट सतह पर दो तरफा चिपकने वाले टेप के दो छोटे टुकड़े रखें (1 एमएल टिप बॉक्स के ढक्कन में इस उद्देश्य के लिए आदर्श आयाम हैं और आसानी से ऑटोक्लेव किया जा सकता है)। एक आईएससीए को शीर्ष पर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह टेप को सुरक्षित रूप से देता है। धीरे-धीरे 50 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके बैक्टीरियल समाधान के साथ तैनाती ट्रे भरें।
      नोट: ट्रे भरें जब तक आईएससीए लगभग 1-2 सेमी तरल के तहत जलमग्न हो जाता है। यदि कई ट्रे का उपयोग कर रहे हैं, तो सभी में एक ही वॉल्यूम का उपयोग करें।
    5. बैक्टीरियल केमोटैक्सिस की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के लिए आईएससीए छोड़ दें। 1 घंटे के बाद, अशांत प्रवाह को कम करने के लिए 50 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ माध्यम को बहुत धीरे से हटा दें।
    6. ऊपरी सतह को छूने के बिना तैनाती ट्रे से आईएससीए को पुनः प्राप्त करें। आईएससीए की सतह पर शेष तरल को हटाने के लिए एक पिपेट और डिस्पोजेबल वाइपर का उपयोग करें।
      नोट: इस प्रक्रिया के दौरान बंदरगाहों को छूने से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि दबाव में परिणामी परिवर्तन बाहर के वातावरण से बैक्टीरिया को अच्छी तरह से हटा या जोड़ सकते हैं और इस तरह बैक्टीरिया घनत्व और संरचना को अच्छी तरह से अंदर पूर्वाग्रह कर सकते हैं।
  5. नमूनों की पुनः प्राप्ति
    1. नीचे की ओर सामना करना पड़ बंदरगाह के साथ आईएससीए होल्डिंग, एक बाँझ 27 जी सिरिंज सुई एक 1 मिलील सिरिंज से जुड़ी का उपयोग कर कुओं की मात्रा को पुनः प्राप्त ।
      नोट: प्रत्येक पंक्ति (यदि एक ही पदार्थ युक्त) लगभग 550 माइक्रोन का एक काम नमूना प्रदान करने के लिए जमा किया जा सकता है। इस नमूने को बाद में आवश्यक डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर विभिन्न ट्यूबों में अलीकोट किया जा सकता है।
    2. प्रवाह साइटोमेट्री12के साथ नमूनों का विश्लेषण करके प्रत्येक रसायनीय एकाग्रता के प्रति आकर्षित बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें । केमोएट्रेक्ट्ट की एकाग्रता चुनें जो बाद के क्षेत्र की तैनाती के लिए केमोटैक्सिस को अधिकतम करता है।

2. फील्ड तैनाती की तैयारी

नोट: सामग्री की तैयारी और प्रवाह-डैमिंग बाड़े (धारा 2) के निर्माण तैनाती से पहले आयोजित किया जाना चाहिए ।

  1. सामग्री की तैयारी
    1. तालिका 1में सूचीबद्ध सभी सामग्री तैयार करें ।
      नोट: एक आईएससीए के लिए सामग्री मात्रा प्रदान की जाती है।
  2. निर्माण और प्रवाह-गीला बाड़े की तैयारी
    नोट: प्रवाह-गीला बाड़े अवांछित अशांति को कम करता है जो अन्यथा आईएससीए से निकलने वाले रासायनिक ढाल की स्थापना को रोकता है।
    1. एक 3 मिमी ऐक्रेलिक शीट से एक लेजर कटर के साथ तैनाती बाड़े के लिए टुकड़ों को काटें।
      नोट: टुकड़ों के लिए फ़ाइल निम्नलिखित लिंक का उपयोग करके पाया जा सकता है: ।
    2. लेजर-कट टुकड़ों को इकट्ठा करें जैसा कि चित्रा 2 में एक्रेलिक गोंद का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है।
      नोट: देखभाल के साथ टुकड़े इकट्ठा। छेद या गलत संरेखण तैनाती पर लीक बना सकते हैं, जो सीधे डेटा गुणवत्ता को प्रभावित करता है।
    3. इकट्ठे बाड़े को रात भर सूखने के लिए छोड़ दें।
    4. बाड़े को डिवोनाइज्ड पानी से धोएं।
    5. बाड़े में डिएकोन्ड पानी डालकर संभावित रिसाव की पहचान करें। अधिक ऐक्रेलिक गोंद जोड़कर किसी भी संभावित लीक जोड़ों को ठीक करें, फिर चरण 2.2.3-2.2.5 दोहराएं।
    6. पेंच धागे को एक्रेलिक टुकड़े में काटें जिसका उपयोग आईएससीए को सुरक्षित करने के लिए किया जाएगा। यह एक व्यास और बढ़ते शिकंजा मिलान पिच के साथ एक नल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है।
      1. सबसे पहले, नल को नल रिंच में प्रत्यय करें, फिर एक्रेलिक टुकड़े को बेंचटॉप वाइस में टैप करने के लिए सुरक्षित करें। सबसे अच्छे परिणामों के लिए, सुनिश्चित करें कि ऐक्रेलिक टुकड़ा जितना संभव हो उतना स्तर है। सुनिश्चित करें कि नल ऐक्रेलिक टुकड़े के लिए लंबवत है और नल रिंच (दक्षिणावर्त) मोड़ शुरू, नल के लिए प्रकाश दबाव लागू ।
      2. ऐक्रेलिक टुकड़े में कई पूर्ण क्रांतियों के बाद, नल से ऐक्रेलिक को साफ करने के लिए एक-चौथाई रोटेशन के लिए नल (प्रतिवर्त) के रोटेशन को रिवर्स करें। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि ऐक्रेलिक टुकड़े की पूरी गहराई टैप न हो जाए।
      3. अंत में, टैप (टर्निंग काउंटरलॉकवाइज) को हटा दें और पेंच का उपयोग करके धागे का परीक्षण करें।

3. क्षेत्र में प्रक्रिया

  1. पानी का छानने का काम
    1. प्रयोग शुरू करने के लिए तैयार होने पर क्षेत्र स्थल से पानी ले लीजिए। 50 एमएल शंकुकेंद्रित ट्यूब में 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर (50 एमएल सिरिंज के साथ) के माध्यम से प्रति आईएससीए 5 एमएल पानी को फ़िल्टर करें।
      नोट: एक आईएससीए के सभी कुओं को भरने के लिए लगभग 3 एमएल फ़िल्टर किए गए पानी की आवश्यकता होती है; हालांकि, चौगुनी छानने की प्रक्रिया के दौरान नुकसान के लिए खाते में प्रति डिवाइस 1) फिल्टर 5 एमएल की सिफारिश की जाती है, और 2) प्रवाह साइटोमेट्री और आणविक प्रक्रियाओं दोनों के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में फिल्ट्रेट्स के एलिकोट को संरक्षित करती है।
    2. एक नए 50 मिलीएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक नया 50 मिलीएल सिरिंज के साथ एक 0.2 माइक्रोन हाइड्रोफिलिक जीपी फिल्टर कारतूस (एक ही एक, दोनों बार का उपयोग कर) के माध्यम से दो बार फिल्ट्रेट फ़िल्टर करें। एक नई 50 मिली एमएल शंकुसली में 0.02 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर (एक नई 50 एमएल सिरिंज के साथ) के माध्यम से फिल्ट्रेट को फ़िल्टर करें।
      नोट: इस चौगुनी निस्पंदन पानी से लगभग सभी सूक्ष्मजीवों और कणों को हटा देना चाहिए । अंतिम फिलेट्रेट को उपयोग तक गर्मी के किसी भी स्रोत से दूर रखें। इस पानी का इस्तेमाल आईएससीए में इस्तेमाल होने वाले सभी रसायनों को फिर से व्यतीत करने के लिए किया जाएगा और इसे तैनाती स्थल पर पानी के समान तापमान पर रखा जाना चाहिए । आईएससीए कुओं और बाहर के वातावरण के बीच तापमान में अंतर से शुरू होने वाले संवहनी प्रवाह अन्यथा हो सकते हैं।
    3. 15 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूबों में वांछित सांद्रता के लिए ब्याज के सभी रसायनों (आमतौर पर शुष्क) को फिर से खर्च करने के लिए फिलेट के एलिकोट का उपयोग करें।
    4. अवांछित कणों या पानी के अघुलनशील यौगिकों (यदि अर्क का उपयोग कर) को हटाने के लिए बाँझ 15 एमएल शंकुकेंद्रित ट्यूबों में 10 एमएल सिरिंज के साथ 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पुनः निलंबित कीमोटाक्टाइंट्स फ़िल्टर करें।
      नोट: फिल्टर के माध्यम से गुजरने से कणों को रोकने के लिए धीरे से फ़िल्टर करें। क्षेत्र स्थल से अल्ट्राफिल्टर पानी में केमोएट्रेक्ट्स को फिर से रखना महत्वपूर्ण है और उन्हें अन्य समाधानों में नहीं बदलना चाहिए। क्षेत्र साइट से पानी का उपयोग करने के लिए आवश्यक है (1) कुओं के अंदर एक ही नमक एकाग्रता प्राप्त करने के रूप में है कि थोक पर्यावरण के पानी में घनत्व से प्रेरित प्रवाह को रोकने के लिए, और (2) गारंटी है कि पृष्ठभूमि पोषक तत्वों का स्तर के अंदर और कुएं के बाहर बराबर हैं ।
  2. आईएससीए फिलिंग
    1. आईएससीए को भरने के लिए सेक्शन 1.3 करें।
      नोट: प्रति पदार्थ एक पंक्ति (पांच कुओं) (यानी, तीन अलग-अलग पदार्थ प्रति आईएससीए और एक अल्ट्राफ़िल्टर समुद्री जल नियंत्रण) को भरने की सिफारिश की जाती है।
  3. क्षेत्र में तैनाती
    1. आईएससीए(चित्रा 3A)को बाड़े के 9 टुकड़े करने के लिए पेंच(चित्रा 2K और चित्रा 3B)।
      नोट: ऊपर उल्लिखित प्रवाह-डैमिंग बाड़े में दो आईएससीए साथ-साथ या एक आईएससीए अपने केंद्र में रखा जा सकता है।
    2. बाड़े(चित्रा 3 सी)को बंद करें और चिपकने वाले टेप(चित्रा 3 डी) केसाथ इसे सील करें।
      नोट: झुर्रियों से बचा जाना चाहिए एक परिपूर्ण मुहर सुनिश्चित करने के लिए । पहले सभी पक्षों को सील करें, फिर (दूसरे चरण में) साइड होल को सील करें, जिसका उपयोग नमूने के अंत में बाड़े से पानी निकालने के लिए किया जाएगा। ऊपर और नीचे के छेद को सील न करें। आईएससीए को उल्टा न रखें, क्योंकि घनत्व-चालित प्रवाह केमोएट्रेक्ट्स युक्त कुओं में हो सकता है, जो कुओं में कोशिकाओं की संख्या को पूर्वाग्रह देगा।
    3. क्योंकि बाड़े को तैनाती के दौरान स्थिर रहना चाहिए, इसे बंजी डोरियों का उपयोग करके मानव निर्मित संरचनाओं (जैसे, पांटून, सीढ़ी) से संलग्न करने की सिफारिश की जाती है।
      नोट: बाड़े को पानी में विसर्जन से पहले बंजी डोरियों का उपयोग करके एक तैनाती हाथ (यहां, एक लंबवत मंच के साथ एक संशोधित क्लैंप) से जोड़ा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, बाड़े को उथले सब्सट्रेट्स पर एक छोटे से वजन के साथ भरा और सुरक्षित किया जा सकता है। यदि पेलाजिक महासागर में तैनाती का इरादा है, तो बाड़े को एक तरफ बोया के साथ एक जाल से जोड़ा जा सकता है और दूसरी तरफ वजन गोता लगाना चाहिए।
    4. भरने शुरू करने के लिए बाड़े को पूरी तरह से जलमग्न करें। भरते समय, बाड़े को मजबूती से पकड़ें ताकि अंदर अत्यधिक पानी की आवाजाही को रोका जा सके। एक बार जब पानी का स्तर बाड़े के शीर्ष पर पहुंच जाए तो सुनिश्चित करें कि कोई हवा अंदर न फंसे।
      नोट: यदि कुछ हवा के बुलबुले फंस जाते हैं, तो बाड़े को ऊपर की ओर सामना करने वाले वेंट छेद के साथ धीरे-धीरे झुकाएं, जो बुलबुले को बचने में सक्षम बनाएगा।
    5. एक बार पूरी तरह से पूरा होने के बाद, दो प्लग के साथ नीचे और शीर्ष छेद सील करें, जिसे सिलिकॉन या रबर से बाहर किया जा सकता है या 20 माइक्रोन पिपेट टिप्स(चित्रा 4)के चरम को सील करके।
      नोट: यह कदम नमूने के दौरान बाड़े के अंदर प्रवाह को रोकता है ।
    6. 1-3 घंटे के लिए नमूने के लिए जगह में आईएससीए छोड़ दें ।
      नोट: आदर्श तैनाती समय मुख्य रूप से पानी के तापमान और जीवाणु समुदाय के दोहरीकरण समय से तय होता है। जब पानी का तापमान 20 डिग्री सेल्सियस से ऊपर होता है, तो 1 घंटे से अधिक के लिए आईएससीए को तैनात करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि सेल डिवीजन 1.5-2.0 घंटे के बाद केमोएट्रेक्ट्स युक्त कुओं में हो सकता है। हालांकि, इष्टतम तैनाती समय लोडेड रसायनों के साथ प्राकृतिक समुदायों में संशोधन और समय के माध्यम से कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करके आईएससीए प्रयोग से पहले परीक्षण किया जा सकता है ।
    7. बाड़े को पानी से हटा दें। इसे एक कंटेनर पर रखें जिससे पानी को बाड़े से सूखा जा सके।
    8. चिपकने वाले टेप के ऊपरी हिस्से को सामने के छेद से बहुत धीरे-धीरे निकालें।
      नोट: बाड़े छोड़ने वाले पानी का प्रवाह टपकता हुआ गति से होना चाहिए । एक समय में एक छेद आगे बढ़ें, बाड़े के ऊपर से नीचे तक। बाड़े को पूरी तरह से निकालने में लगभग 10-15 मिनट का समय लगना चाहिए।
    9. एक बार वाटरलाइन आईएससीए के ऊपर से नीचे गुजरती है, तो नीचे के प्लग को हटा दें, और बाकी पानी को छान लें।
    10. जबकि आईएससीए अभी भी बाड़े से जुड़े हुए हैं, ध्यान से 1 मिलीएल पिपेट के साथ आईएससीए के शीर्ष पर फंसे पानी को हटा दें।
    11. ऊपरी सतह को छूने के बिना आईएससीए निकालें और सतह पर किसी भी शेष तरल को हटाने के लिए डिस्पोजेबल वाइप का उपयोग करें।
      नोट: इस प्रक्रिया के दौरान बंदरगाहों को छूना महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि दबाव में परिणामी परिवर्तन थोक बैक्टीरिया को अच्छी तरह से हटा या जोड़ सकते हैं और बैक्टीरियल मायने रखता है पूर्वाग्रह ।
    12. चरण 1.5.1 दोहराकर आईएससीए से नमूनों को पुनः प्राप्त करें।

4. डाउनस्ट्रीम आवेदन

नोट: वॉल्यूम 550 माइक्रोल नमूने (आईएससीए की एक पंक्ति) के आधार पर दिए जाते हैं।

  1. प्रत्येक आकर्षित करने के लिए केमोटैक्सिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के लिए ग्लूटारल्डिहाइड (2% अंतिम एकाग्रता) के साथ अच्छी तरह से सामग्री के 100 माइक्रोन को ठीक करें।
    नोट: बर्फ पर स्टोर (या 4 डिग्री सेल्सियस पर) और एक ही दिन नमूनों का विश्लेषण। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को एक ही दिन विश्लेषण संभव नहीं है, तो निर्धारण के बाद तरल नाइट्रोजन में स्थिर जमे हुए किया जा सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री आईएससीए कुओं में कोशिकाओं की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुशंसित विधि है, क्योंकि यह सीधा, तेज और सटीक12है।
  2. स्नैप फ्रीज ३०० μL के बाद डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण11के लिए तरल नाइट्रोजन में अच्छी तरह से सामग्री ।
    नोट: विश्लेषण तक नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. ते-ग्लाइसरोल बफर के 10 माइक्रोन में अच्छी सामग्री के 90 माइक्रोन जोड़ें और सिंगल-सेल जीनोमिक्स13के लिए नमूनों को स्नैप-फ्रीज करें।
  4. बैक्टीरियल अलगाव के लिए वांछित माध्यम युक्त आगर प्लेटों पर 10-20 μL फैलाएं।

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Representative Results

यह खंड समुद्री रोगाणुओं की रसायनोता प्रतिक्रिया को ग्लूटामाइन की एकाग्रता श्रृंखला में परीक्षण करने के लिए आईएससीए का उपयोग करके प्रयोगशाला परिणाम प्रस्तुत करता है, जो मिट्टी के बैक्टीरिया को आकर्षित करने के लिए जाना जाता है14। प्रयोगशाला परीक्षणों में सबसे मजबूत केमोटैक्टिक प्रतिक्रिया प्राप्त करने वाले ग्लूटामाइन की एकाग्रता का उपयोग समुद्री पर्यावरण में कीमोटैक्सिस परख करने के लिए किया गया था।

प्रयोगशाला परीक्षणों को करने के लिए, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया में तटीय पानी से नमूना समुद्री जल समुदायों को एक साधारण पोषक तत्व संशोधन4के माध्यम से मोती कोशिकाओं के लिए समृद्ध किया गया था, जैसा कि चरण 1.4 में वर्णित है। ग्लूटामीन को अल्ट्राफिल्टर समुद्री जल में 10 mm से 100 μM तक अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए क्रमिक रूप से पतला किया गया था। इस प्रयोग के लिए एक साथ पांच आईएससीए प्रतिकृतियां तैनात की गई थीं, और प्रत्येक में तीन अलग-अलग ग्लूटामाइन सांद्रता (प्रति पंक्ति एकाग्रता) के साथ-साथ एक फ़िल्टर किए गए समुद्री जल नियंत्रण पंक्ति शामिल थी। 1 एच तैनाती के बाद, प्रत्येक आईएससीए पंक्ति (एक ही ग्लूटामीन एकाग्रता युक्त) की सामग्री को लगभग 550 माइक्रोन के कामकाजी नमूने प्रदान करने के लिए एकत्र किया गया था। यह मात्रा ग्लूटारल्डिहाइड (2% अंतिम एकाग्रता) में तय की गई थी, और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से मात्रा निर्धारित बैक्टीरिया की संख्या।

संक्षेप में, बैक्टीरियल बहुतायत 1 द्वारा निर्धारित किया गया था) एक हरे फ्लोरोसेंट डीएनए डाई और 2) विश्लेषण के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके अल्ट्राफिल्टर्ड डिओनाइज्ड पानी के साथ म्यान तरल पदार्थ के रूप में। प्रत्येक नमूने के लिए, फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी), साइड स्कैटर (एसएससी), और ग्रीन फ्लोरेसेंस दर्ज किए गए थे। नमूनों का विश्लेषण 25 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर पर किया गया, जिसमें जीवाणु कोशिकाओं को एसएससी और ग्रीन फ्लोरेसेंस के अनुसार भेदभाव किया गया । केमोटैक्टिक इंडेक्स(आईसी)फ़िल्टर किए गए समुद्री जल नियंत्रण कुओं (एफएसडब्ल्यू) में औसत जीवाणु गिनती द्वारा प्रत्येक नमूने में मौजूद बैक्टीरियल काउंट को विभाजित करके निर्धारित किया गया था।

परिणामों से पता चला है कि 1 mm इष्टतम ग्लूटामाइन तैनाती एकाग्रता थी, क्योंकि इसने एक महत्वपूर्ण रसायनीय प्रतिक्रिया को प्रेरित किया जो फ़िल्टर किए गए समुद्री जल नियंत्रण(टी-टेस्ट, पी एंड एलटी; 0.001)(चित्रा 5A)से 18 गुना अधिक था। ग्लूटामीन की उच्च या कम सांद्रता ने महत्वपूर्ण लेकिन कमजोर केमोटैक्टिक प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया(आईसी = 5.43 100 माइक्रोएम, पी एंड एलटी; 0.001 के लिए; मैंसी = 7.34 के लिए 10 μM, पी एंड एलटी; 0.001). यदि एक आईएससीए कुएं में जोड़ा गया केमोएट्रेक्ट एकाग्रता बहुत अधिक है, तो कुएं में कीमोटैक्सिस को कम किया जा सकता है, क्योंकि (1) बैक्टीरिया बंदरगाह अनुभाग में एक ढाल का पता लगाने में सक्षम नहीं होगा और अच्छी तरह से ऊपर एकत्र हो सकता है, या (2) कुएं की पीएच या ऑसमोलैरिटारिटायता प्रभावित हो सकती है।

इष्टतम ग्लूटामीन एकाग्रता का उपयोग बाद में क्षेत्र की तैनाती के लिए किया गया था। सिडनी, ऑस्ट्रेलिया (33.91 डिग्री एस, 151.26 डिग्री ई) के पास एक तटीय स्थल पर 1 घंटे के लिए 1 एमएमएम ग्लूटामीन से भरे पांच आईएससीए प्रतिकृति तैनात किए गए थे। ग्लूटामीन ने तैनाती स्थल(चित्रा 5B)से फ़िल्टर किए गए समुद्री जल से भरे नियंत्रण कुओं की तुलना में 2.98 गुना अधिक बैक्टीरिया को आकर्षित किया। इस क्षेत्र प्रयोग में रसायनीय प्रतिक्रिया नियंत्रण(टी-टेस्ट,पी एंड एलटी; 0.001) से काफी अलग थी और तटीय समुद्री जल11के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया का गठन किया।

Figure 1
चित्रा 1: सीटू केमोटैक्सिस परख (आईएससीए) में विस्तृत विचार। (A)नवीनतम इंजेक्शन-ढाला आईएससीए । (ख)एक आईएससीए अच्छी तरह से योजनाबद्ध । स्केल बार = 7.463 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह-डैमिंग बाड़े की विधानसभा । (क)तैनाती बाड़े की विधानसभा के लिए आवश्यक टुकड़े । निर्माण के दौरान, किनारों को चिकनी होना चाहिए। (ख)टुकड़ा 1 (निचली सतह) के आसपास 2a, 2b, 3a, और 3b रखें । (ग)निचले सतह (1) के पहले किनारे के चारों ओर ऐक्रेलिक गोंद की एक पतली परत डालकर बाड़े के निचले हिस्से को इकट्ठा करें। (घ) पहले लंबे साइडवॉल टुकड़े (2a) को गोंद पर खड़ी रखें और इसे जगह में रखें । गोंद को जमना करने के लिए ~ 1 मिनट की आवश्यकता होती है और अगले तत्व को रखते हुए टुकड़ा 2a खुद को समर्थन करने की अनुमति देता है। (ई) टुकड़ा 1 के एक छोटे पक्ष पर निचली सतह पर ऐक्रेलिक गोंद की एक पतली परत लागू करें । एक्रेलिक गोंद पर शॉर्ट साइडवॉल पीस (3a) रखें और इसे पहले रखे साइडवॉल में लॉक करें। लगभग 1 मिनट के लिए दो टुकड़ों पकड़ो (एफ) निचले सतह (1) के विपरीत दिशा में अन्य छोटे साइडवॉल टुकड़ा (3b) रखें। फिर, इसे कनेक्टिंग पीस (2a) में बंद करें और इसे लगभग 1 मिनट (जी) के लिए पकड़ें यदि आवश्यक हो, तो निचली सतह (1) के शेष लंबे हिस्से में ऐक्रेलिक गोंद को फिर से लागू करें। पिछले लंबे साइडवॉल टुकड़ा (2b) प्लेस और यह दो आसन्न टुकड़ों (3a और 3b) में कनेक्ट । सुनिश्चित करें कि सभी टुकड़े निचले टुकड़े (1) के साथ ठीक से गठबंधन कर रहे हैं और साइडवॉल या निचली सतह के बीच गलत संरेखण या अंतराल के कोई संकेत मौजूद नहीं हैं। बाड़े के पूरक ऊपरी हिस्से (4, 5a, 5b, 6a, और 6b) को इकट्ठा करने के लिए इन चरणों को दोहराएं। (ज) सुनिश्चित करें कि टुकड़ा 4 के कोने में छेद विधानसभा के दौरान बाधित नहीं है, अन्यथा एक सुई के रूप में एक तेज वस्तु के साथ खोलने पंच। बाड़े के छेद तैनाती प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और पानी को धीमी और नियंत्रित तरीके से निकालने की अनुमति देते हैं। उनके व्यास को बाड़े के अंदर अशांत प्रवाह को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जो पुनः प्राप्ति पर आईएससीए बंदरगाहों के आसपास के तरल पदार्थ की अशांति को रोकता है । (आईए, ख) गोंद एक साथ दो बड़े आयतों (7) और अलग से गोंद दो छोटे लोगों (8) । प्रत्येक के लिए एक बार दोहराएं। (जम्मू) बाड़े की निचली सतह (1) के केंद्र में चार इकट्ठे आयतों को गोंद करें। (कश्मीर) आयतों (7 और 8) के शीर्ष पर ऊपरी डेक (9) गोंद। सुनिश्चित करें कि टुकड़े के साइड छेद आयतों के बाहरी पक्ष पर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: बाड़े में आईएसकेए की नियुक्ति और टेप द्वारा सीलिंग। }Aआईएससीए में बढ़ते शिकंजा को रखें। (ख)तैनाती बाड़े में आईएससीए प्लेसमेंट । तैनाती बाड़े के बीच में ISCA रखें और निर्दिष्ट शिकंजा के साथ देते हैं। बाड़े के निचले नाले के छेद को एक संशोधित 20 माइक्रोन टिप(चित्रा 4)के साथ सील किया जाना चाहिए एक बार बाड़े पानी से भर जाता है। यह अशांत प्रवाह की पीढ़ी से बचने में मदद करता है जो रासायनिक क्षेत्र की स्थिरता और केमोटैक्सिस की प्रभावशीलता को प्रभावित कर सकता है। (ग)ऊपरी और निचले हिस्सों को एक साथ इकट्ठा किया जाता है । (घ)चिपकने वाले टेप का उपयोग कर बाड़े की सीलिंग । लीक को रोकने के लिए झुर्रियों से बचना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रवाह-डैमिंग बाड़े को सील करने के लिए प्लग करें। प्लग गर्मी के साथ एक 20 μL पिपेट टिप सील द्वारा किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Chemotaxis प्रयोगशाला और क्षेत्र में प्राकृतिक माइक्रोबियल आबादी में एक समृद्ध मोटिवल समुदाय के ग्लूटामीन की ओर आईएससीए का उपयोग करते हुए कहते हैं । केमोटैक्सिस इंडेक्स Ic (आईएससीए कुओं के भीतर कोशिकाओं की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करना) 60 मिनट की तैनाती के बाद फ़िल्टर किए गए समुद्री जल (एफएसडब्ल्यू) वाले कुओं के भीतर कोशिकाओं की औसत एकाग्रता द्वारा सामान्यीकृत किया गया। प्रत्येक एकाग्रता पांच ISCA प्रतिकृति में परीक्षण किया गया था । जीवाणु कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री (ए): एफएसडब्ल्यू = 4.46 ± 0.25 x 103द्वारा निर्धारित किया गया था; 100 माइक्रोन = 2.43 ± 0.16 x 104; 1 mm = 8.07 ± 0.45 x 104; 10 mM = 3.28 ± 0.20 x 104; (ख): एफएसडब्ल्यू = 1.26 ± 0.11 x 104; 1 mM = 3.76 ± 0.28 x 104 कोशिकाओं/ (ए) प्रयोगशाला और (बी) क्षेत्र में परीक्षण किए गए ग्लूटामाइन की सभी सांद्रता ने फ़िल्टर किए गए समुद्री जल (एफएसडब्ल्यू) नियंत्रणों की तुलना में एक रसायनीय प्रतिक्रिया को काफी अधिक प्रेरितकिया। सभी जोड़ीवार तुलना में: (ए) टुकी एचएसडी, एन = 5, पी एंड एलटी; 0.005; (ख) टुकी एचएसडी, एन = 5, पी एंड एलटी; 0005। त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फील्ड मटेरियल मात्रा
पानी का छानने का काम
ट्यूब रैक - 50 एमएल 1
हाइड्रोफिलिक जीपी फिल्टर कारतूस - 0.2 माइक्रोन 1
सिरिंज फिल्टर - 0.2 माइक्रोन 1
सिरिंज फिल्टर - 0.02 माइक्रोन 1
सीरिंज - 50 एमएल 4
शंकुल सेंट्रलाइज ट्यूब - 50 एमएल 5
रासायनिक पुन: 1999
शंकुकेंद्री ट्यूब - 15 एमएल 4
केमोटाट्रेक्टेंट्स
सीरिंज - 10 एमएल 4
सिरिंज फिल्टर - 0.2 माइक्रोन 4
ट्यूब रैक - 15 एमएल 1
आईएससीए फिलिंग
सिरिंज सुई 27G 4
सिरिंज - 1 एमएल 4
आईएससीए 1
परिनियोजन
तैनाती बाड़े 1
नायलॉन स्लॉट फ्लैट सिर शिकंजा 2
तैनाती शाखा 1
बंजी कॉर्ड 2
चिपकने वाला टेप 1
तैनाती बाड़े प्लग 1
नमूने पुनः प्राप्त
सिरिंज सुई 27G 4
सीरिंज - 1 मिलील 4
सेंट्रलाइज ट्यूब - 2 एमएल 12
डिस्पोजेबल वाइपर 1 बॉक्स
ग्लूटारल्डिहाइड 25% 10 एमएल
अन्य सामग्री
पिपेट सेट 1
पिपेट टिप्स 200 माइक्रोल 1 बॉक्स
पिपेट टिप्स 20 माइक्रोल 1 बॉक्स
पिपेट टिप्स 1 एमएलए 1 बॉक्स

तालिका 1: क्षेत्र तैनाती के लिए आवश्यक सामग्री।

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Discussion

जलीय सूक्ष्मजीवों के पैमाने पर, पर्यावरण समरूप से दूर है और अक्सर भौतिक/रासायनिक ढाल की विशेषता है जो माइक्रोबियल समुदायों की संरचना1,,15। व्यवहार (यानी कीमोटैक्सिस) का उपयोग करने के लिए मोटिवल सूक्ष्मजीवों की क्षमता इन विषम माइक्रोएनवायरमेंट्स1के भीतर फोर्जिंग की सुविधा प्रदान करती है। पर्यावरण में सीधे केमोटैक्सिस का अध्ययन करने से महत्वपूर्ण अंतरविशिष्ट बातचीत और रासायनिक वरीयताओं की पहचान करने की क्षमता होती है, और यह जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के लिए विशिष्ट रोगाणुओं के योगदान को सुलझाने में मदद कर सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल11 पर्यावरण में आईएससीए तैनात करता है ताकि सीटू में केमोटैक्सिस पर प्रजनन योग्य अनुसंधान के अधिग्रहण को सुगम बनाया जा सके ।

आईएससीए का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि ग्लूटामीन प्रयोगशाला की स्थिति और क्षेत्र दोनों में एक सकारात्मक रसायनीय प्रतिक्रिया प्राप्त करता है। क्षेत्र में ग्लूटामाइन की आईएससीए तैनाती प्रयोगशाला(चित्रा 5)की तुलना में कम रसायनीय प्रतिक्रिया देती है। प्रयोगशाला और क्षेत्र प्रयोगों के बीच इसी तरह के पैटर पहले11देखे गए हैं . इन्हें समृद्ध समुदायों या प्रयोगशाला परख में उपयोग किए जाने वाले एकल मोटिवल आइसोल की तुलना में पर्यावरण में मोती कोशिकाओं के निचले अनुपात द्वारा समझाया जा सकता है।

प्रारंभिक प्रयोगशाला आधारित प्रयोगों के महत्व को कम करके नहीं आंका जाना चाहिए, क्योंकि वे क्षेत्र की तैनाती में उपयोग करने के लिए इष्टतम रसायनीय सांद्रता के निर्धारण की अनुमति देते हैं । इष्टतम एकाग्रता प्रत्येक रसायनके लिए विशिष्ट है और कुओं से इसके आणविक वजन, घुलनशीलता और प्रसार से प्रभावित होती है। कई अलग-अलग पदार्थों की तैनाती के मामले में, प्रत्येक को एकाग्रता सीमा में व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि 1 घंटे के बाद क्षेत्र में कोई केमोटैक्सिस का पता नहीं चलता है, तो लंबी तैनाती की जा सकती है। हालांकि, तैनाती की लंबाई दृढ़ता से बैक्टीरिया के विकास से विवश है और हमेशा लक्षित वातावरण में बैक्टीरिया की विभाजन दर से कम होना चाहिए । यह आईएससीए के भीतर जनसंख्या वृद्धि से बचने में मदद करता है।

आईएससीए पानी की अशांति के प्रति संवेदनशील है और प्रवाह-डैमिंग बाड़े को भरने और खाली करते समय देखभाल की जानी चाहिए। इन चरणों को धीरे-धीरे किया जाना चाहिए, क्योंकि तेजी से भरने के परिणामस्वरूप प्रवाह कुओं की सामग्री को फ्लश या पतला कर सकते हैं। नतीजतन, यह केमोएट्रेक्ट्स को ठीक से फैलाने या आसपास के वातावरण से बैक्टीरिया को पेश करने से हटाता है या रोकता है, अंततः सेल मायने रखता है। सभी हवा निकालते समय बाड़े को पूरी तरह से पानी से भरना, फिर इसे पूरी तरह से बंद करना, यह सुनिश्चित करता है कि अशांति तैनाती में हस्तक्षेप नहीं करेगी। तैनाती स्थल (यानी तापमान, लवणता, क्लोरोफिल/पोषक तत्व एकाग्रता) पर मेटाडेटा एकत्र करना भी परिणामों की व्याख्या करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि ये कारक कीमोटैक्सिस को प्रभावित कर सकते हैं ।

आईएससीए एक सुलभ, उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण है जो पर्यावरण में केमोटैक्सिस की भूमिका और व्यापकता में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यह तरल चरण (जैसे, समुद्री, मीठे पानी, मिट्टी, अपशिष्ट जल प्रणालियों) वाले किसी भी सिस्टम में केमोटैक्सिस से पूछताछ करने में सक्षम बनाता है। अंत में, इसका उपयोग पर्यावरण में रोगजनकों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध पर लक्षित अध्ययन, बायोप्रोस्पेक्टिंग के लिए प्रमुख रोगाणुओं के अलगाव और विशिष्ट प्रदूषकों और माइक्रोप्लास्टिक के बायोरेमेडिएशन के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस शोध को गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन मरीन माइक्रोबायोलॉजी इनिशिएटिव द्वारा जेआर और आरएस को अनुदान GBMF3801 के माध्यम से, और आरएस को एक अन्वेषक पुरस्कार (GBMF3783) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, साथ ही एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद फैलोशिप (DE160100636) J.B.R. के लिए, सिमंस फाउंडेशन से B.S.L. (५९४१११) के लिए एक पुरस्कार, और सिमंस फाउंडेशन (५४२३९५) से एक अनुदान माइक्रोबियल पारिस्थितिकी प्रणालियों (PriME) सहयोगात्मक के सिद्धांतों के भाग के रूप में आर एस ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic glue Evonik 1133 Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet McMaster-Carr 8505K725 Or different company
Adhesive tape Scotch 3M 810 Scotch Magic tape
Autoclave Systec D-200 Or different company
Benchtop centrifuge Fisher Scientific 75002451 Or different company
Bungee cord Paracord Planet 667569184000 Or different company
Centrifuge tube - 2 mL Sigma Aldrich BR780546-500EA Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL Fisher Scientific 11507411 Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL Fisher Scientific 10788561 Falcon tube
Deployment arm Irwin 1964719 Or different company
Deployment enclosure plug Fisher Scientific 21-236-4 See alternatives in manuscript
Disposable wipers Kimtech - Fisher Scientific 06-666 Kimwipes
Flow cytometer Beckman C09756 CYTOFlex
Glutaraldehyde 25% Sigma Aldrich G5882 Or different company
Green fluorescent dye Sigma Aldrich S9430 SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm Merck C3235 Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) - - Contact corresponding authors
Laser cutter Epilog Laser Fusion pro 32 Or different company
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Or different company
Marine Broth 2216 VWR 90004-006 Difco
Nylon slotted flat head screws McMaster-Carr 92929A243 M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set Fisher Scientific 05-403-151 Or different company
Pipette tips - 1 mL Fisher Scientific 21-236-2A Or different company
Pipette tips - 20 µL Fisher Scientific 21-236-4 Or different company
Pipette tips - 200 µL Fisher Scientific 21-236-1 Or different company
Sea salt Sigma Aldrich S9883 For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL Sigma Aldrich SIAL1490-100EA Or different company
Syringe filter - 0.02 µm Whatman WHA68091002 Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm Fisher Scientific 10695211 Or different company
Syringe needle 27G Henke Sass Wolf 4710004020 0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL Codau 329650 Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL BD 303134 Or different company
Syringes - 50 mL BD 15899152 Or different company
Tube rack - 15 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Tube rack - 50 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap McMaster-Carr 8305A77 Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm Merck SCGPS05RE Steritop filter

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References

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Clerc, E. E., Raina, J. B., Lambert, B. S., Seymour, J., Stocker, R. In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems. J. Vis. Exp. (159), e61062, doi:10.3791/61062 (2020).

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