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Ensayo de Chemotaxis Situ para Examinar el Comportamiento Microbiano en Ecosistemas Acuáticos

Published: May 5, 2020 doi: 10.3791/61062
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zürich, 2Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 3School of Oceanography, University of Washington

Summary

Aquí se presenta el protocolo para un ensayo de quimiotaxis in situ, un dispositivo microfluídico desarrollado recientemente que permite estudios de comportamiento microbiano directamente en el medio ambiente.

Abstract

Los comportamientos microbianos, como la motilidad y la quimiotaxis (la capacidad de una célula para alterar su movimiento en respuesta a un gradiente químico), están muy extendidos en los dominios bacteriano y arqueal. La quimiotaxis puede dar lugar a ventajas sustanciales de adquisición de recursos en entornos heterogéneos. También desempeña un papel crucial en las interacciones simbióticas, enfermedades, y procesos globales, como el ciclo biogeoquímico. Sin embargo, las técnicas actuales restringen la investigación de quimiotaxis al laboratorio y no son fácilmente aplicables en el campo. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el despliegue del ensayo de quimiotaxis in situ (ISCA), un dispositivo que permite un interrogatorio robusto de quimiotaxis microbiana directamente en el entorno natural. El ISCA es un dispositivo microfluídico que consiste en una matriz de 20 pozos, en la que se pueden cargar productos químicos de interés. Una vez desplegados en ambientes acuosos, los productos químicos se difunden fuera de los pozos, creando gradientes de concentración que los microbios detectan y responden nadando en los pozos a través de la quimiotaxis. El contenido del pozo se puede muestrear y utilizar para (1) cuantificar la fuerza de las respuestas quimiotácticas a compuestos específicos a través de la citometría de flujo, (2) aislar y cultivar microorganismos sensibles, y (3) caracterizar la identidad y el potencial genómico de las poblaciones que responden a través de técnicas moleculares. La ISCA es una plataforma flexible que se puede implementar en cualquier sistema con una fase acuosa, incluyendo ambientes marinos, de agua dulce y de suelo.

Introduction

Diversos microorganismos utilizan motilidad y quimiotaxis para explotar ambientes de nutrientes irregulares, encontrar huéspedes, o evitar condiciones perjudiciales1,2,3. Estos comportamientos microbianos pueden a su vez influir en las tasas de transformación química4 y promover asociaciones simbióticas en los ecosistemas terrestres, de agua dulce y marinos2,,5.

La quimiotaxis ha sido ampliamente estudiada en condiciones de laboratorio durante los últimos 60 años6. El primer método cuantitativo para estudiar la quimiotaxis, el ensayo capilar, consiste en un tubo capilar lleno de un quimioatractante putativo sumergido en una suspensión de bacterias6. La difusión del producto químico fuera del tubo crea un gradiente químico, y las bacterias quimiotácticas responden a este gradiente migrando al tubo7. Desde el desarrollo del ensayo capilar, todavía ampliamente utilizado hoy en día, se han desarrollado muchas otras técnicas para estudiar la quimiotaxis en condiciones físicas/químicas cada vez más controladas, con la más reciente implicación del uso de microfluidos8,,9,,10.

Los microfluídicos, junto con la microscopía de vídeo de alta velocidad, permiten rastrear el comportamiento de las células individuales en respuesta a gradientes cuidadosamente controlados. Aunque estas técnicas han mejorado enormemente nuestra comprensión de la quimiotaxis, se han limitado al uso en laboratorio y no se traducen fácilmente en el despliegue de campo en los sistemas ambientales. Como consecuencia, no se ha examinado la capacidad de las comunidades naturales de bacterias para utilizar quimiotaxis dentro de los ecosistemas naturales; por lo tanto, la comprensión actual de la importancia ecológica potencial de la quimiotaxis está sesgada hacia condiciones de laboratorio artificiales y un número limitado de aislados bacterianos cultivados en laboratorio. El ISCA recientemente desarrollado supera estas limitaciones11.

La ISCA se basa en el principio general del ensayo capilar; sin embargo, hace uso de técnicas modernas de microfabricación para entregar una plataforma experimental altamente replicada y fácilmente desplegable para la cuantificación de la quimiotaxis hacia compuestos de interés en el medio natural. También permite la identificación y caracterización de microorganismos quimiotácticos mediante aislamiento directo o técnicas moleculares. Mientras que el primer dispositivo de trabajo fue autofabricado y construido de vidrio y PDMS11, la última versión moldeada por inyección se compone de policarbonato, utilizando un procedimiento de fabricación altamente estandarizado (para el interés en la última versión del dispositivo, se puede contactar con los autores correspondientes).

El ISCA es del tamaño de una tarjeta de crédito y consta de 20 pozos distribuidos en una matriz de 5 x 4 pozos, cada uno vinculado al medio acuático externo por un pequeño puerto (800 m de diámetro; Figura 1). Los quimioatractantes putativos cargados en los pozos se difunden en el medio ambiente a través del puerto, y los microbios quimiotácticos responden nadando a través del puerto en el pozo. Como muchos factores pueden influir en el resultado de un experimento ISCA en el entorno natural, este protocolo paso a paso ayudará a los nuevos usuarios a superar posibles obstáculos y facilitar implementaciones eficaces.

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Protocol

Se recomienda ejecutar la sección 1 antes de los experimentos de campo para optimizar los resultados.

1. Optimización de laboratorio

NOTA: Los volúmenes descritos en el procedimiento de optimización son suficientes para un único ISCA (compuesto por 20 pozos).

  1. Preparación del producto químico de interés
    NOTA: La concentración óptima para cada quimioatractant a menudo debe determinarse en condiciones de laboratorio antes de los despliegues sobre el terreno. El campo de concentración química disminuirá en magnitud con la distancia de la fuente (pozo ISCA), lo que significa que la concentración experimentada por los microorganismos en el medio ambiente será menor que la presente dentro del dispositivo. La concentración óptima a utilizar en el pozo ISCA depende de la tasa de difusión del quimioatractant. Si la concentración en el pozo es demasiado baja (cerca del límite de detección de los microbios), no se observará quimiotaxis positiva. Por el contrario, si la concentración en el pozo es demasiado alta, la concentración también será alta en el ambiente inmediato y la acumulación microbiana se producirá por encima de los pozos ISCA en lugar de dentro. Por lo tanto, las series de dilución deben llevarse a cabo en condiciones de laboratorio para cada compuesto con el fin de determinar la concentración óptima para los despliegues en campo. Idealmente, también se debe probar un rango de concentración sobre el terreno para confirmar los resultados de laboratorio.
    1. Preparar 2,5 L de un medio adecuado que contenga la concentración de sal adecuada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato [PBS] o agua de mar artificial). Filtrar el medio con un filtro de 0,2 m utilizando una bomba peristáltica o de vacío y autoclave.
    2. Preparar una solución de 10 mM de quimioatractant en 1 ml del medio estéril. Filtrar la solución quimioatractant con un filtro de jeringa de 0,2 m para eliminar partículas y contaminantes potenciales.
      NOTA: Idealmente, no hay compuestos orgánicos que no sean el quimioatractant debe estar presente en la solución final.
  2. Rango de concentración por serie de dilución
    1. Diluir la solución filtrada de quimioatractantes en serie, que van (por ejemplo) de 10 mM a 100 m.
      NOTA: Se necesita al menos un volumen final de 0,7 ml por concentración probada.
  3. Carga de la ISCA
    1. Llene una jeringa de 1 ml con el quimioatractant filtrado y conéctelo a una jeringa de 27 G. Sosteniendo el ISCA con el puerto mirando hacia arriba, inyecte lentamente la sustancia hasta que aparezca una pequeña gota en la parte superior del puerto.
      NOTA: 1) Cada dilución o sustancia debe inyectarse con una jeringa y una aguja separadas para evitar la contaminación cruzada. 2) Esta pequeña gota es importante porque asegura que ninguna burbuja de aire está atrapada dentro del puerto, lo que podría afectar la capacidad de los microbios para migrar a través del puerto. 3) Se recomienda llenar una fila entera por sustancia o concentración (cinco pozos) para proporcionar un volumen mínimo adecuado para análisis posteriores. 4) Una fila por ISCA debe actuar como control negativo y debe llenarse con el medio filtrado en el que se suspenderán los microbios. Este tratamiento explica el efecto de la motilidad aleatoria por microbios en los pozos ISCA y debe utilizarse para normalizar los tratamientos que contienen un quimioatractant.
  4. Despliegue en el laboratorio
    1. Durante la noche, incubar un cultivo de 5 ml enriquecido con 1% de caldo marino (para bacterias marinas) o 1% caldo de lysogeny (LB, para bacterias de agua dulce).
      NOTA: Los aislados bacterianos móviles o las comunidades bacterianas naturales se pueden utilizar para despliegues de laboratorio.
    2. Incubar el cultivo durante 12 h a temperatura ambiente (RT) y 180 rpm. Después de 12 h, asegúrese de que las comunidades microbianas son móviles por observación directa bajo un microscopio.
    3. Girar hacia abajo el cultivo a 1.500 x g durante 10 minutos y resuspend 1/100 en 150 ml de medio adecuado (por ejemplo, agua de mar filtrada, agua dulce filtrada).
    4. Coloque dos pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara en la superficie plana de una bandeja de capacidad de 200 ml (las tapas de las cajas de punta de 1 ml tienen las dimensiones ideales para este propósito y se pueden autoclavarse fácilmente). Coloque una ISCA en la parte superior, asegurándose de que se conecta de forma segura a la cinta. Llene lentamente la bandeja de despliegue con la solución bacteriana utilizando una pipeta serológica de 50 ml.
      NOTA: Llene la bandeja hasta que la ISCA esté sumergida por menos de 1-2 cm de líquido. Si utiliza varias bandejas, utilice el mismo volumen en todos.
    5. Deje que la ISCA se incuba durante 1 h para permitir la quimiotaxis bacteriana. Después de 1 h, retire el medio muy suavemente con una pipeta serológica de 50 ml para minimizar el flujo turbulento.
    6. Recupere el ISCA de la bandeja de despliegue sin tocar la superficie superior. Utilice una pipeta y limpiaparabrisas desechables para eliminar el líquido restante en la superficie de ISCA.
      NOTA: Es importante evitar tocar los puertos durante este proceso, ya que los cambios resultantes en la presión pueden eliminar o añadir bacterias del ambiente exterior al pozo y así sesgar la densidad bacteriana y la composición dentro del pozo.
  5. Recuperación de las muestras
    1. Sosteniendo el ISCA con el puerto orientado hacia abajo, recupere el volumen de los pozos utilizando una aguja estéril de jeringa de 27 G unida a una jeringa de 1 ml.
      NOTA: Cada fila (si contiene la misma sustancia) se puede agrupar para proporcionar una muestra de trabajo de aproximadamente 550 l. Esta muestra puede ser posteriormente alícuota en diferentes tubos dependiendo de las aplicaciones posteriores requeridas.
    2. Determinar el número de bacterias atraídas a cada concentración de quimioatractantes mediante el análisis de las muestras con citometría de flujo12. Elija la concentración de quimioatractant que maximiza la quimiotaxis para implementaciones de campo posteriores.

2. Preparación para el despliegue sobre el terreno

NOTA: La preparación del material y la construcción de la carcasa de amortiguación de flujo (sección 2) deben llevarse a cabo antes del despliegue.

  1. Preparación de materiales
    1. Prepare todos los materiales enumerados en la Tabla 1.
      NOTA: Se proporcionan cantidades de material para un ISCA.
  2. Construcción y preparación del cerramiento de amortiguación de flujo
    NOTA: La carcasa de amortiguación de flujo minimiza las turbulencias no deseadas que de otro modo impiden el establecimiento de gradientes químicos que emanan de la ISCA.
    1. Corte las piezas para el gabinete de despliegue con un cortador láser de una lámina de acrílico de 3 mm.
      NOTA: El archivo de las piezas se puede encontrar utilizando el siguiente enlace: .
    2. Montar las piezas cortadas por láser como se muestra en la Figura 2 utilizando pegamento acrílico.
      NOTA: Montar las piezas con cuidado. Los agujeros o la desalineación pueden crear fugas en la implementación, lo que afecta directamente a la calidad de los datos.
    3. Deje que el recinto montado se seque durante la noche.
    4. Lave el recinto con agua desionizada.
    5. Identifique posibles fugas vertiendo agua desionizada en el recinto. Corrija las posibles articulaciones con fugas añadiendo más pegamento acrílico y, a continuación, repita los pasos 2.2.3–2.2.5.
    6. Corte las roscas de tornillo en la pieza de acrílico que se utilizará para fijar el ISCA. Esto se puede lograr usando un grifo con un diámetro y paso que coincida con los tornillos de montaje.
      1. En primer lugar, coloque el grifo en una llave de grifo y, a continuación, fije la pieza de acrílico que se va a roscar en un vicio de sobremesa. Para obtener los mejores resultados, asegúrese de que la pieza de acrílico esté lo más nivelada posible. Asegúrese de que el grifo es perpendicular a la pieza acrílica y comience a girar la llave del grifo (en el sentido de las agujas del reloj), aplicando presión ligera al grifo.
      2. Después de varias revoluciones completas en la pieza de acrílico, invierta la rotación del grifo (en sentido contrario a las agujas del reloj) durante un cuarto de rotación para eliminar el acrílico del grifo. Repita el proceso hasta que se toque toda la profundidad de la pieza acrílica.
      3. Por último, retire el grifo (girando en sentido contrario a las agujas del reloj) y pruebe las roscas con un tornillo.

3. Procedimiento sobre el terreno

  1. Filtración de agua
    1. Recoja el agua del sitio de campo cuando esté listo para iniciar el experimento. Filtrar 5 ml de agua por ISCA a través de un filtro de jeringa de 0,2 m (con una jeringa de 50 ml) en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml.
      NOTA: Se requieren aproximadamente 3 ml de agua filtrada para llenar todos los pozos de un ISCA; sin embargo, se recomienda filtrar 1) 5 ml por dispositivo para tener en cuenta las pérdidas durante el proceso de filtración cuádruple, y 2) conservar las alícuotas de los filtrados como controles negativos tanto para la citometría de flujo como para los procedimientos moleculares.
    2. Filtrar el filtrado dos veces a través de un cartucho de filtro GP hidrófilo de 0,2 m (utilizando el mismo, ambas veces) con una nueva jeringa de 50 ml en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Filtrar el filtrado a través de un filtro de jeringa de 0,02 m (con una nueva jeringa de 50 ml) en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: Esta filtración cuádruple debe eliminar casi todos los microorganismos y partículas del agua. Mantenga el filtrado final lejos de cualquier fuente de calor hasta su uso. Esta agua se utilizará para resuspender todos los productos químicos utilizados en la ISCA, y debe mantenerse a la misma temperatura que el agua en el sitio de despliegue. De lo contrario, pueden producirse flujos convectivos desencadenados por diferencias de temperatura entre los pozos ISCA y el entorno exterior.
    3. Utilice alícuotas del filtrado para resuspender todos los quimioatractantes de interés (normalmente secos) a las concentraciones deseadas en tubos de centrífuga cónica de 15 ml.
    4. Filtrar los quimioatractantes resuspendidos a través de un filtro de jeringa de 0,2 m con una jeringa de 10 ml en tubos estériles de centrífuga cónica de 15 ml para eliminar partículas no deseadas o compuestos insolubles en agua (si se utilizan extractos).
      NOTA: Filtre suavemente para evitar que las partículas pasen a través del filtro. Es importante resuspender los quimioatractantes en el agua ultrafiltrada del sitio de campo y no solubilizarlos en otras soluciones. El uso de agua del sitio de campo es necesario (1) obtener la misma concentración de sal dentro de los pozos que en el agua ambiental a granel para evitar el flujo impulsado por la densidad, y (2) garantizar que los niveles de nutrientes de fondo son iguales dentro y fuera del pozo.
  2. Relleno ISCA
    1. Realice la sección 1.3 para llenar el ISCA.
      NOTA: Se recomienda llenar una fila (cinco pozos) por sustancia (es decir, tres sustancias diferentes por ISCA y un control de agua de mar ultrafiltrado).
  3. Despliegue sobre el terreno
    1. Atornille el ISCA (Figura 3A) a la pieza 9 de la carcasa(Figura 2K y Figura 3B).
      NOTA: La carcasa de amortiguación de flujo delineada anteriormente puede contener dos ISCA uno al lado del otro o un ISCA colocado en su centro.
    2. Cierre la carcasa (Figura 3C) y selle con cinta adhesiva (Figura 3D).
      NOTA: Las arrugas deben evitarse para garantizar un sellado perfecto. Selle todos los lados primero, luego (en un segundo paso) selle los orificios laterales, que se utilizarán para drenar el agua de la carcasa al final del muestreo. No selle los orificios superior e inferior. No coloque el ISCA boca abajo, ya que el flujo impulsado por la densidad puede ocurrir en pozos que contienen quimioatractantes, lo que sesgará el número de células en los pozos.
    3. Debido a que el gabinete debe permanecer estable durante el despliegue, se recomienda fijarlo a las estructuras artificiales (por ejemplo, pontón, escalera) utilizando cordones de bungee.
      NOTA: La carcasa se puede conectar a un brazo de despliegue (aquí, una abrazadera modificada con una plataforma perpendicular) utilizando cables de bungee antes de la inmersión en el agua. Alternativamente, el gabinete se puede llenar y asegurar con un pequeño peso en sustratos poco profundos. Si los despliegues están previstos en el océano pelágico, el recinto se puede conectar a una red con una boya en un lado y el peso de buceo en el otro.
    4. Sumerja completamente la carcasa para empezar a llenar. Durante el llenado, sostenga la carcasa firmemente para evitar el movimiento excesivo del agua en el interior. Una vez que el nivel del agua llegue a la parte superior de la carcasa, asegúrese de que no haya aire atrapado en el interior.
      NOTA: En caso de que algunas burbujas de aire queden atrapadas, incline la carcasa suavemente con el orificio de ventilación hacia arriba, lo que permitirá que las burbujas escapen.
    5. Una vez completamente llenos, sellar los orificios inferior y superior con dos tapones, que pueden estar hechos de silicio o caucho o sellando las extremidades de las puntas de pipeta de 20 l (Figura 4).
      NOTA: Este paso impide el flujo dentro de la carcasa durante el muestreo.
    6. Deje el ISCA en su lugar para el muestreo durante 1–3 h.
      NOTA: El tiempo de despliegue ideal está dictado principalmente por la temperatura del agua y el tiempo de duplicación de la comunidad bacteriana. Cuando la temperatura del agua está por encima de 20 oC, no se recomienda desplegar el ISCA durante más de 1 h, ya que la división celular puede ocurrir en los pozos que contienen quimioatractantes después de 1.5–2.0 h. Sin embargo, el tiempo óptimo de despliegue se puede probar antes del experimento ISCA modificando las comunidades naturales con los productos químicos cargados y cuantificando el número de células a través del tiempo.
    7. Retire el cerramiento del agua. Colóquelo sobre un recipiente que permita drenar el agua del recinto.
    8. Retire la parte superior de la cinta adhesiva de los orificios delanteros con mucha succión.
      NOTA: El flujo del agua que sale de la carcasa debe estar a una velocidad de goteo. Proceda un agujero a la vez, desde la parte superior de la carcasa hasta la parte inferior. Debe tomar aproximadamente 10–15 minutos para drenar el gabinete por completo.
    9. Una vez que la línea de flotación pase por debajo de la parte superior de la ISCA, retire el tapón inferior y drene el resto del agua.
    10. Mientras que los ISCA todavía están conectados a la carcasa, retire cuidadosamente el agua atrapada en la parte superior de la ISCA con una pipeta de 1 ml.
    11. Retire el ISCA sin tocar la superficie superior y utilice una toallita desechable para eliminar el líquido restante en la superficie.
      NOTA: Es importante no tocar los puertos durante este proceso, ya que los cambios resultantes en la presión pueden eliminar o agregar bacterias a granel en el pozo y sesgo de los recuentos bacterianos.
    12. Recupere las muestras del ISCA repitiendo el paso 1.5.1.

4. Aplicaciones de nivel inferior

NOTA: Los volúmenes se dan sobre la base de una muestra de 550 l (una fila de un ISCA).

  1. Fijar 100 l de contenido de pozo con glutaraldehído (2% concentración final) para la citometría de flujo para cuantificar la quimiotaxis a cada atractor.
    NOTA: Almacenar en hielo (o a 4 oC) y analizar las muestras el mismo día. Alternativamente, las muestras pueden ser congeladas en nitrógeno líquido después de la fijación si el análisis no es factible en el mismo día. La citometría de flujo es el método recomendado para cuantificar el número de células en los pozos ISCA, ya que es sencillo, rápido y preciso12.
  2. Congelación a presión 300 l de contenido de pozo en nitrógeno líquido para la posterior extracción y análisis de ADN11.
    NOTA: Almacene las muestras a -80 oC hasta el análisis.
  3. Añadir 90 l de contenido de pozo a 10 ml de tampón de TE-glicerol y congelar las muestras para la genómica de una sola célula13.
  4. Extienda de 10 a 20 ml en placas de agar que contengan el medio deseado para el aislamiento bacteriano.

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Representative Results

Esta sección presenta los resultados de laboratorio utilizando el ISCA para probar la respuesta quimiotáctica de los microbios marinos a un rango de concentración de glutamina, un aminoácido conocido por atraer bacterias del suelo14. La concentración de glutamina que provocó la respuesta quimiotáctica más fuerte en las pruebas de laboratorio se utilizó para realizar un ensayo de quimiotaxis en el medio marino.

Para realizar las pruebas de laboratorio, las comunidades de agua de mar muestreadas en aguas costeras en Sídney, Australia, se enriquecieron para células móviles a través de una simple enmienda de nutrientes4,como se describe en el paso 1.4. La glutamina se diluyó en serie en agua de mar ultrafiltrada para obtener concentraciones finales que oscilaban entre 10 mM y 100 mM. Cinco réplicas de ISCA se desplegaron simultáneamente para este experimento, y cada una contenía tres concentraciones diferentes de glutamina (una concentración por fila), así como una fila de control de agua de mar filtrada. Después de un despliegue de 1 h, el contenido de cada fila ISCA (que contiene la misma concentración de glutamina) se agruparon para proporcionar muestras de trabajo de aproximadamente 550 l. Este volumen se fijó en glutaraldehído (2% concentración final), y el número de bacterias que respondieron cuantificado a través de la citometría de flujo.

Brevemente, la abundancia bacteriana se cuantificó mediante 1) la tinción de las células con un tinte de ADN fluorescente verde y 2) el análisis utilizando un citometro de flujo con agua desionizada ultrafiltrada como fluido de vaina. Para cada muestra, se registraron dispersión hacia delante (FSC), dispersión lateral (SSC) y fluorescencia verde. Las muestras se analizaron a un caudal de 25 l/min, con células bacterianas discriminadas según SSC y fluorescencia verde. El índice quimiotáctico (Ic) se determinó dividiendo los recuentos bacterianos presentes en cada muestra por los recuentos bacterianos promediados en los pozos de control de agua de mar filtradas (FSW).

Los resultados mostraron que 1 mM era la concentración óptima de despliegue de glutamina, ya que indujo una respuesta quimiotáctica significativa que era 18 veces mayor que el control de agua de mar filtrada (t-test, p < 0.001) (Figura 5A). Las concentraciones más altas o más bajas de glutamina indujeron respuestas quimiotácticas significativas pero más débiles(Ic a 5,43 para 100 m, p < 0,001; Ic a 7,34 para 10 m, p < 0,001). Si la concentración de quimioatractant añadida a un pozo ISCA es demasiado alta, la quimiotaxis en el pozo puede reducirse, porque (1) las bacterias no podrán detectar un gradiente en la sección del puerto y pueden agregarse por encima del pozo, o (2) el pH u osmolaridad del pozo puede verse afectado.

La concentración óptima de glutamina se utilizó posteriormente para el despliegue en campo. Durante 1 h se desplegaron cinco réplicas de ISCA llenas de 1 mM de glutamina en un sitio costero cerca de Sídney, Australia (33,91 s, 151,26 oS). La glutamina atrajo 2,98 veces más bacterias que los pozos de control llenos de agua de mar filtrada del sitio de despliegue (Figura 5B). La respuesta quimiotáctica en este experimento de campo fue significativamente diferente de los controles(t-test, p < 0.001) y constituyó una fuerte respuesta para el agua de mar costera11.

Figure 1
Figura 1: Vistas detalladas del ensayo de quimiotaxis in situ (ISCA). (A) La última ISCA moldeada por inyección. (B) Esquema de un pozo ISCA. Barra de escala de 7.463 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Montaje de la carcasa de amortiguación de flujo. (A) Las piezas necesarias para el montaje del gabinete de despliegue. Durante la fabricación, los bordes deben ser lisos. (B) Coloque las piezas 2a, 2b, 3a y 3b alrededor de la pieza 1 (superficie inferior). (C) Montar la parte inferior de la carcasa colocando una fina capa de pegamento acrílico alrededor del primer borde de la superficie inferior (1). (D) Coloque la primera pieza de pared lateral más larga (2a) verticalmente sobre el pegamento y sosténguelo en su lugar. El pegamento requiere 1 min para solidificarse y permite que la pieza 2a se apoye mientras coloca el siguiente elemento. (E) Aplicar una fina capa de pegamento acrílico a la superficie inferior en un lado más corto de la pieza 1. Coloque la pieza de pared lateral corta (3a) sobre el pegamento acrílico y fíjela en la pared lateral previamente colocada. Sujete las dos piezas durante aproximadamente 1 min (F) Coloque la otra pieza de pared lateral corta (3b) en el lado opuesto de la superficie inferior (1). Una vez más, enciérralo en la pieza de conexión (2a) y sosténguelo durante aproximadamente 1 min (G) Si es necesario, vuelva a aplicar pegamento acrílico al lado largo restante de la superficie inferior (1). Coloque la última pieza larga de la pared lateral (2b) y conéctela a las dos piezas adyacentes (3a y 3b). Asegúrese de que todas las piezas estén correctamente alineadas con la pieza inferior (1) y de que no haya signos de desalineación o huecos entre las paredes laterales o la superficie inferior. Repita estos pasos para ensamblar la parte superior complementaria del gabinete (4, 5a, 5b, 6a y 6b). (H) Asegúrese de que el orificio en la esquina de la pieza 4 no esté obstruido durante el montaje, de lo contrario golpee la abertura con un objeto afilado como una aguja. Los orificios de la carcasa desempeñan un papel fundamental en el proceso de despliegue y permiten que el agua drene de manera lenta y controlada. Su diámetro se ha optimizado para reducir el flujo turbulento dentro del recinto, lo que evita la perturbación del fluido que rodea los puertos ISCA al ser re recuperada. (Ia,b) Pega dos rectángulos grandes (7) y pega por separado dos más pequeños (8). Repita una vez para cada uno. (J) Pegue los cuatro rectángulos ensamblados en el centro de la superficie inferior del recinto (1). (K) Pegue la cubierta superior (9) en la parte superior de los rectángulos (7 y 8). Asegúrese de que los orificios laterales de la pieza están en el lado externo de los rectángulos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Colocación de ISCA en el recinto y sellado mediante cinta. (A) Coloque los tornillos de montaje en el ISCA. (B) Ubicación isCA en el gabinete de despliegue. Coloque el ISCA en el centro de la carcasa de despliegue y adjúntelo con los tornillos especificados. El orificio de drenaje inferior de la carcasa debe sellarse con una punta modificada de 20 l (Figura 4) una vez que el gabinete se llena de agua. Esto ayuda a evitar la generación de flujos turbulentos que pueden afectar la estabilidad del campo químico y la eficacia de la quimiotaxis. (C) Las partes superior e inferior se ensamblan juntas. (D) Sellado de la carcasa mediante cinta adhesiva. Las arrugas deben evitarse para evitar fugas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Enchufe para sellar la carcasa de amortiguación de flujo. El enchufe se puede hacer secando una punta de pipeta de 20 l con calor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Los ensayos de Chemotaxis utilizan el ISCA hacia la glutamina de una comunidad móvil enriquecida en el laboratorio y la población microbiana natural en el campo. Chemotaxis index Ic (que representa la concentración de células dentro de los pozos ISCA) normalizado por la concentración media de células dentro de los pozos que contienen el agua de mar filtrada (FSW) después de 60 minutos de despliegue. Cada concentración se probó en cinco réplicas ISCA. Las células bacterianas se cuantificaron mediante citometría de flujo (A): FSW a 4,46 x 0,25 x 103; 100 m a 2,43 a 0,16 x 104; 1 mM a 8,07 a 0,45 x 104; 10 mM a 3,28 a 0,20 x 104; (B): FSW a 1,26 a 0,11 x 104; 1 mM a 3,76 a 0,28 x 104 células/ml). Todas las concentraciones de glutamina probadas en el campo (A) y (B) indujeron una respuesta quimiotáctica significativamente superior a los controles de agua de mar filtrada (FSW).. En todas las comparaciones por pares: (A) Tukey HSD, n a 5, p < 0.005; (B) Tukey HSD, n a 5, p < 0,005. Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Material de campo Cantidad
Filtración de agua
Estante de tubo - 50 mL 1
Cartucho de filtro GP hidrófilo - 0,2 m 1
Filtro de jeringa - 0,2 m 1
Filtro de jeringa - 0,02 m 1
Jeringas - 50 mL 4
Tubo de centrífuga cónica - 50 mL 5
Resuspensión química
Tubo de centrífuga cónica - 15 mL 4
Chemoattractants
Jeringas - 10 mL 4
Filtro de jeringa - 0,2 m 4
Estante de tubo - 15 mL 1
Relleno ISCA
Aguja de jeringa 27G 4
Jeringa - 1 ml 4
Isca 1
despliegue
Gabinete de implementación 1
Tornillos de cabeza plana ranurados de nylon 2
Brazo de despliegue 1
Cordón Bungee 2
Cinta adhesiva 1
Enchufe del gabinete de implementación 1
Recuperación de muestras
Aguja de jeringa 27G 4
Jeringas - 1 mL 4
Tubo centrífugo - 2 mL 12
Limpiaparabrisas desechables 1 caja
Glutaraldehído 25% 10 mL
Otro material
Conjunto de pipetas 1
Puntas de pipeta 200 l 1 caja
Puntas de pipeta 20 l 1 caja
Puntas de pipeta 1 mL 1 caja

Tabla 1: Materiales necesarios para la implementación de campo.

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Discussion

A escala de microorganismos acuáticos, el medio ambiente está lejos de ser homogéneo y a menudo se caracteriza por gradientes físicos/químicos que estructuran las comunidades microbianas1,,15. La capacidad de los microorganismos móviles para utilizar el comportamiento (es decir, quimiotaxis) facilita la bifurcación dentro de estos microambientes heterogéneos1. Estudiar la quimiotaxis directamente en el medio ambiente tiene el potencial de identificar interacciones interespecíficas importantes y preferencias químicas, y esto puede ayudar a desenredar las contribuciones de microbios específicos a los procesos biogeoquímicos. El protocolo presentado despliega la ISCA en el entorno11 para facilitar la adquisición de investigaciones reproducibles sobre quimiotaxis in situ.

Usando la ISCA, se muestra que la glutamina provoca una respuesta quimiotáctica positiva tanto en condiciones de laboratorio como en el campo. El despliegue ISCA de glutamina sobre el terreno produce una respuesta quimiotáctica menor que en el laboratorio (Figura 5). Anteriormente se han observado golpes similares entre experimentos de laboratorio y de campo11. Esto puede explicarse por la menor proporción de células móviles en el medio ambiente en comparación con las comunidades enriquecidas o aislado de un solo móvil utilizado en ensayos de laboratorio.

No se debe subestimar la importancia de los experimentos preliminares basados en laboratorio, ya que permiten determinar las concentraciones óptimas de quimioatractantes para utilizar en despliegues sobre el terreno. La concentración óptima es específica de cada quimioatractant e influenciada por su peso molecular, solubilidad y difusividad de los pozos. En el caso del despliegue de varias sustancias distintas, cada una de ellas debe probarse individualmente en un rango de concentración. Si no se detecta quimiotaxis en el campo después de 1 h, se pueden llevar a cabo despliegues más largos. Sin embargo, la duración del despliegue está fuertemente limitada por el crecimiento bacteriano y siempre debe ser más corta que la tasa de división de bacterias en el entorno objetivo. Esto ayuda a evitar el crecimiento de la población dentro de la ISCA.

La ISCA es sensible a las turbulencias del agua y se debe tener cuidado al llenar y vaciar el gabinete de amortiguación de flujo. Estos pasos deben realizarse lentamente, porque los flujos resultantes del llenado rápido pueden vaciar o diluir el contenido de los pozos. Como resultado, esto elimina o evita que los quimioatractantes se difundan correctamente o introduzcan bacterias del entorno circundante, en última instancia, sesgando el recuento celular. Llenar completamente el recinto con agua mientras se ventila todo el aire, a continuación, cerrarlo por completo, garantiza que la turbulencia no interferirá con el despliegue. La recopilación de metadatos en el sitio de despliegue (es decir, temperatura, salinidad, concentración de clorofila/nutrientes) también es un paso crítico para interpretar los resultados, ya que estos factores pueden influir en la quimiotaxis.

El ISCA es un dispositivo accesible y fácil de usar que proporciona nuevos conocimientos sobre el papel y la prevalencia de la quimiotaxis en el medio ambiente. Permite el interrogatorio de quimiotaxis en cualquier sistema que contenga una fase líquida (por ejemplo, sistemas marinos, de agua dulce, de suelo, de aguas residuales). Por último, se puede utilizar para estudios específicos sobre patógenos y resistencia a los antibióticos en el medio ambiente, aislamiento de microbios clave para la bioprospección y biorremediación de contaminantes y microplásticos específicos.

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Disclosures

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada en parte por la Iniciativa de Microbiología Marina de la Fundación Gordon y Betty Moore, a través de la subvención GBMF3801 a J.R.S. y R.S., y un Premio investigador (GBMF3783) a R.S., así como una beca del Consejo Australiano de Investigación (DE160100636) a J.B.R., un premio de la Fundación Simons a B.S.L. (594111), y una subvención de la Fundación Simons (542395) a R.S. como parte de la Colaboración de Principios de Ecosistemas Microbianos (PriME).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic glue Evonik 1133 Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet McMaster-Carr 8505K725 Or different company
Adhesive tape Scotch 3M 810 Scotch Magic tape
Autoclave Systec D-200 Or different company
Benchtop centrifuge Fisher Scientific 75002451 Or different company
Bungee cord Paracord Planet 667569184000 Or different company
Centrifuge tube - 2 mL Sigma Aldrich BR780546-500EA Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL Fisher Scientific 11507411 Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL Fisher Scientific 10788561 Falcon tube
Deployment arm Irwin 1964719 Or different company
Deployment enclosure plug Fisher Scientific 21-236-4 See alternatives in manuscript
Disposable wipers Kimtech - Fisher Scientific 06-666 Kimwipes
Flow cytometer Beckman C09756 CYTOFlex
Glutaraldehyde 25% Sigma Aldrich G5882 Or different company
Green fluorescent dye Sigma Aldrich S9430 SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm Merck C3235 Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) - - Contact corresponding authors
Laser cutter Epilog Laser Fusion pro 32 Or different company
Luria Bertani Broth Sigma Aldrich L3022 Or different company
Marine Broth 2216 VWR 90004-006 Difco
Nylon slotted flat head screws McMaster-Carr 92929A243 M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set Fisher Scientific 05-403-151 Or different company
Pipette tips - 1 mL Fisher Scientific 21-236-2A Or different company
Pipette tips - 20 µL Fisher Scientific 21-236-4 Or different company
Pipette tips - 200 µL Fisher Scientific 21-236-1 Or different company
Sea salt Sigma Aldrich S9883 For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL Sigma Aldrich SIAL1490-100EA Or different company
Syringe filter - 0.02 µm Whatman WHA68091002 Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm Fisher Scientific 10695211 Or different company
Syringe needle 27G Henke Sass Wolf 4710004020 0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL Codau 329650 Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL BD 303134 Or different company
Syringes - 50 mL BD 15899152 Or different company
Tube rack - 15 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Tube rack - 50 mL Thomas Scientific 1159V80 Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap McMaster-Carr 8305A77 Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm Merck SCGPS05RE Steritop filter

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References

  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
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  6. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
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Ciencias Ambientales Número 159 microfluídicos quimiotaxis in situ microbiología marina ecología microbiana ensayo conductual
Ensayo de Chemotaxis Situ para Examinar el Comportamiento Microbiano en Ecosistemas Acuáticos
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Clerc, E. E., Raina, J. B., Lambert, … More

Clerc, E. E., Raina, J. B., Lambert, B. S., Seymour, J., Stocker, R. In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems. J. Vis. Exp. (159), e61062, doi:10.3791/61062 (2020).

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