Summary
Presentert her er protokollen for en in situ chemotaxis analyse, en nylig utviklet mikrofluidisk enhet som muliggjør studier av mikrobiell oppførsel direkte i miljøet.
Abstract
Mikrobiell atferd, som motilitet og chemotaxis (en celles evne til å endre bevegelsen som svar på en kjemisk gradient), er utbredt på tvers av bakterielle og arkaeale domener. Chemotaxis kan resultere i betydelige ressursoppkjøpsfordeler i heterogene miljøer. Det spiller også en avgjørende rolle i symbiotiske interaksjoner, sykdom og globale prosesser, som biogeokjemisk sykling. Imidlertid begrenser dagens teknikker chemotaxis forskning til laboratoriet og er ikke lett aktuelt i feltet. Presentert her er en trinnvis protokoll for utplassering av in situ chemotaxis analyse (ISCA), en enhet som muliggjør robust avhør av mikrobielle chemotaxis direkte i det naturlige miljøet. ISCA er en mikrofluidisk enhet bestående av en 20 brønnarray, hvor kjemikalier av interesse kan lastes. Når de er utplassert i vandige miljøer, sprer kjemikalier seg ut av brønnene, og skaper konsentrasjonsgradienter som mikrober fornemmer og reagerer på ved å svømme inn i brønnene via chemotaxis. Brønninnholdet kan deretter samples og brukes til å (1) kvantifisere styrken til de chemotaktiske reaksjonene på spesifikke forbindelser gjennom strømningscytometri, (2) isolere og kulturresponsive mikroorganismer, og (3) karakteriserer identiteten og genomiske potensialet til de responderende populasjonene gjennom molekylære teknikker. ISCA er en fleksibel plattform som kan distribueres i alle system med en vandig fase, inkludert marine, ferskvann og jordmiljøer.
Introduction
Ulike mikroorganismer bruker motilitet og chemotaxis for å utnytte usammenhengende næringsmiljøer, finne verter eller unngå skadeligeforhold 1,,2,,3. Disse mikrobielle atferdene kan igjen påvirke frekvensen av kjemisk transformasjon4 og fremme symbiotiske partnerskap på tvers av terrestriske, ferskvann og marine økosystemer2,,5.
Chemotaxis har blitt grundig studert under laboratorieforhold de siste 60 årene6. Den første kvantitative metoden for å studere chemotaxis, kapillæranalysen, innebærer et kapillærrør fylt med et antatt kjemoattractant nedsenket i en suspensjon av bakterier6. Diffusjon av kjemikaliet ut av røret skaper en kjemisk gradient, og chemotaktiske bakterier reagerer på denne gradienten ved å migrere inn irøret 7. Siden utviklingen av kapillæranalysen, fortsatt mye brukt i dag, har mange andre teknikker blitt utviklet for å studere chemotaxis under stadig mer kontrollerte fysiske / kjemiske forhold, med den nyeste som involverer bruk av mikrofluidics8,9,10.
Mikrofluidiker, sammen med høyhastighets videomikroskopi, muliggjør sporing av oppførselen til enkeltceller som svar på nøye kontrollerte graderinger. Selv om disse teknikkene har forbedret vår forståelse av chemotaxis, har de blitt begrenset til laboratoriebruk og oversetter ikke lett til feltdistribusjon i miljøsystemer. Som en konsekvens har kapasiteten til naturlige samfunn av bakterier til å bruke chemotaxis i naturlige økosystemer ikke blitt undersøkt; Dermed er dagens forståelse av den potensielle økologiske betydningen av chemotaxis partisk mot kunstige laboratorieforhold og et begrenset antall laboratoriekulturerte bakterielle isolater. Den nylig utviklede ISCA overvinner disse begrensningene11.
ISCA bygger på det generelle prinsippet om kapillæranalysen; Det gjør det imidlertid bruk av moderne mikrofabrikasjonsteknikker for å levere en svært replikert, lett deployerbar eksperimentell plattform for kvantifisering av chemotaxis mot forbindelser av interesse for det naturlige miljøet. Det tillater også identifisering og karakterisering av chemotaktiske mikroorganismer ved direkte isolasjon eller molekylære teknikker. Mens den første arbeidsenheten var selvfablantert og konstruert av glass og PDMS11,består den nyeste injeksjonsstøpte versjonen av polykarbonat, ved hjelp av en svært standardisert fabrikasjonsprosedyre (for interesse for den nyeste versjonen av enheten, kan de tilsvarende forfatterne kontaktes).
ISCA er kredittkortstørrelse og består av 20 brønner fordelt i en 5 x 4 brønnarray, hver knyttet til det ytre vannmiljøet med en liten port (800 μm i diameter; Figur 1). Antatte kjemoattractants lastet inn i brønnene sprer seg inn i miljøet via havnen, og kjemotaktiske mikrober reagerer ved å svømme gjennom havnen inn i brønnen. Så mange faktorer kan påvirke utfallet av et ISCA-eksperiment i det naturlige miljøet, vil denne trinnvise protokollen hjelpe nye brukere med å overvinne potensielle hindringer og legge til rette for effektive distribusjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi anbefaler at du utfører del 1 før felteksperimenter for å optimalisere resultatene.
1. Laboratorieoptimalisering
MERK: Volumene som er beskrevet i optimaliseringsprosedyren er tilstrekkelige for en enkelt ISCA (bestående av 20 brønner).
- Utarbeidelse av kjemikaliet av interesse
MERK: Den optimale konsentrasjonen for hvert kjemoattractant må ofte bestemmes under laboratorieforhold før feltdistribusjoner. Det kjemiske konsentrasjonsfeltet vil avta i størrelsesorden med avstand fra kilden (ISCA-brønn), noe som betyr at konsentrasjonen som oppleves av mikroorganismer i miljøet, vil være lavere enn det som er tilstede inne i enheten. Den optimale konsentrasjonen som skal brukes i ISCA-brønnen, avhenger av kjemoattractvæskens diffusjonshastighet. Hvis konsentrasjonen i brønnen er for lav (nær deteksjonsgrensen for mikrobene), vil ingen positive chemotaxis bli observert. Omvendt, hvis konsentrasjonen i brønnen er for høy, vil konsentrasjonen også være høy i umiddelbar miljø og mikrobiell akkumulering vil forekomme over ISCA-brønnene i stedet for inne. Derfor bør fortynningsserie utføres under laboratorieforhold for hver forbindelse for å bestemme den optimale konsentrasjonen for feltdistribusjoner. Ideelt sett bør et konsentrasjonsområde også testes i feltet for å bekrefte laboratorieresultater.- Forbered 2,5 l av et egnet medium som inneholder riktig saltkonsentrasjon (f.eks. fosfatbufret saltvann [PBS] eller kunstig sjøvann). Filtrer mediet med et 0,2 μm filter ved hjelp av en peristaltisk eller vakuumpumpe og autoklav.
- Forbered en 10 mM løsning av kjemoattractant i 1 ml av det sterile mediet. Filtrer kjemoattractmiddeloppløsningen med et sprøytefilter på 0,2 μm for å fjerne partikler og potensielle forurensninger.
MERK: Ideelt sett bør ingen organiske forbindelser enn kjemoattractanten være til stede i den endelige løsningen.
- Konsentrasjonsområde etter fortynningsserie
- Fortynn den filtrerte kjemoattractant lagerløsningen i serie, alt (for eksempel) fra 10 mM til 100 μM.
MERK: Minst et 0,7 ml endelig volum er nødvendig per konsentrasjonstestet.
- Fortynn den filtrerte kjemoattractant lagerløsningen i serie, alt (for eksempel) fra 10 mM til 100 μM.
- Laste inn ISCA
- Fyll en 1 ml sprøyte med det filtrerte kjemoattractmiddelet og koble den til en 27 G sprøyte. Hold ISCA med porten vendt oppover, sakte injisere stoffet til en liten dråpe vises på toppen av porten.
MERK: 1) Hver fortynning eller substans må injiseres med en separat sprøyte og kanyle for å hindre krysskontaminering. 2) Denne lille dråpen er viktig fordi det sikrer at ingen luftboble er fanget i havnen, noe som kan svekke mikrobers evne til å migrere gjennom havnen. 3) Det anbefales å fylle en hel rad per substans eller konsentrasjon (fem brønner) for å gi et tilstrekkelig minimalt volum for videre analyser. 4) En rad per ISCA skal fungere som negativ kontroll og bør fylles med det filtrerte mediet der mikrobene vil bli suspendert. Denne behandlingen står for effekten av tilfeldig motilitet av mikrober i ISCA-brønnene og bør brukes til å normalisere behandlingene som inneholder et kjemoattractant.
- Fyll en 1 ml sprøyte med det filtrerte kjemoattractmiddelet og koble den til en 27 G sprøyte. Hold ISCA med porten vendt oppover, sakte injisere stoffet til en liten dråpe vises på toppen av porten.
- Utplassering i laboratoriet
- Over natten inkubere en 5 ml kultur beriket med 1% marine kjøttkraft (for marine bakterier) eller 1% lysogeny kjøttkraft (LB, for ferskvannsbakterier).
MERK: Motile bakterielle isolater eller naturlige bakteriesamfunn kan brukes til laboratoriedistribusjoner. - Inkuber kulturen i 12 timer ved romtemperatur (RT) og 180 omdr./min. Etter 12 timer, sørg for at mikrobielle samfunn er motile ved direkte observasjon under et mikroskop.
- Spinn ned kulturen på 1500 x g i 10 min og gjenoppliv 1/100 i 150 ml passende medium (f.eks. filtrert sjøvann, filtrert ferskvann).
- Plasser to små biter av dobbeltsidig tape på den flate overflaten av en 200 ml kapasitetsskuff (lokkene på 1 ml tippbokser har de ideelle dimensjonene for dette formålet og kan enkelt autoklaveres). Plasser en ISCA på toppen, slik at den festes godt til båndet. Fyll langsomt utskuffen med bakterieoppløsningen ved hjelp av en 50 ml serologisk pipette.
MERK: Fyll brettet til ISCA er nedsenket under ca. 1–2 cm væske. Hvis du bruker flere skuffer, bruker du samme volum på tvers av alle. - La ISCA inkubere i 1 time for å tillate bakteriell chemotaxis. Etter 1 t, fjern mediet veldig forsiktig med en 50 ml serologisk pipette for å minimere turbulent strømning.
- Hent ISCA fra distribusjonsbrettet uten å berøre den øvre overflaten. Bruk en pipette og disponibel viskere for å fjerne gjenværende væske på ISCA-overflaten.
MERK: Det er viktig å unngå å berøre portene under denne prosessen, da de resulterende trykkendringene kan fjerne eller legge bakterier fra utsiden til brønnen og dermed forutse bakterietettheten og sammensetningen inne i brønnen.
- Over natten inkubere en 5 ml kultur beriket med 1% marine kjøttkraft (for marine bakterier) eller 1% lysogeny kjøttkraft (LB, for ferskvannsbakterier).
- Henting av prøvene
- Hold ISCA med porten vendt nedover, hent volumet av brønnene ved hjelp av en steril 27 G sprøytenål festet til en 1 ml sprøyte.
MERK: Hver rad (hvis den inneholder samme substans) kan være samlet for å gi en arbeidsprøve på ca. 550 μL. Denne prøven kan deretter bli aliquoted i forskjellige rør avhengig av de nødvendige nedstrøms applikasjoner. - Bestem antall bakterier tiltrukket av hver kjemoattractantkonsentrasjon ved å analysere prøvene med strømningscytometri12. Velg konsentrasjonen av kjemoattractant som maksimerer chemotaxis for påfølgende feltdistribusjoner.
- Hold ISCA med porten vendt nedover, hent volumet av brønnene ved hjelp av en steril 27 G sprøytenål festet til en 1 ml sprøyte.
2. Forberedelse til feltdistribusjon
MERK: Tilberedning av materiale og konstruksjon av strømningsdempingskabinettet (avsnitt 2) må utføres før distribusjon.
- Utarbeidelse av materialer
- Klargjør alt materiale som er oppført i tabell 1.
MERK: Det finnes materialantall for én ISCA.
- Klargjør alt materiale som er oppført i tabell 1.
- Bygging og tilberedning av strømningsdempende kabinett
MERK: Strømningsdempingskabinettet minimerer uønskede turbulenser som ellers forhindrer etablering av kjemiske gradienter som kommer fra ISCA.- Klipp brikkene for utplasseringskabinettet med en laserkutter fra et 3 mm akrylark.
MERK: Filen for brikkene finner du ved hjelp av følgende kobling: - Monter de laserkuttede bitene som vist i figur 2 ved hjelp av akryllim.
MERK: Monter bitene forsiktig. Hull eller feiljustering kan skape lekkasjer ved distribusjon, noe som direkte påvirker datakvaliteten. - La det monterte kabinettet tørke over natten.
- Vask kabinettet med avionisert vann.
- Identifiser potensiell lekkasje ved å helle deionisert vann inn i kabinettet. Fest eventuelle lekkende skjøter ved å legge til mer akryllim, og gjenta deretter trinn 2.2.3–2.2.5.
- Klipp skruegjengene inn i akrylstykket som skal brukes til å feste ISCA. Dette kan oppnås ved hjelp av et trykk med en diameter og tonehøyde som passer til monteringsskruene.
- Først fest tappen inn i en trykknøkkel, og fest deretter akrylstykket som skal tappes i en benkeplate vice. For best resultat må du sørge for at akrylstykket er så jevnt som mulig. Pass på at kranen er vinkelrett på akrylstykket og begynn å dreie trykknøkkelen (med klokken), og trykk lett på kranen.
- Etter flere full omdreininger i akrylstykket, reverserer du rotasjonen av kranen (mot klokken) for en fjerdedel av en rotasjon for å fjerne akryl fra springen. Gjenta prosessen til hele dybden av akrylstykket er tappet.
- Til slutt fjerner du kranen (drei mot klokken) og tester trådene ved hjelp av en skrue.
- Klipp brikkene for utplasseringskabinettet med en laserkutter fra et 3 mm akrylark.
3. Prosedyre i feltet
- Filtrering av vann
- Samle vann fra feltområdet når du er klar til å starte eksperimentet. Filtrer 5 ml vann per ISCA gjennom et 0,2 μm sprøytefilter (med en 50 ml sprøyte) i et konisk sentrifugrør på 50 ml.
MERK: Ca. 3 ml filtrert vann er nødvendig for å fylle alle brønnene til en ISCA; Det anbefales imidlertid å 1) filtrere 5 ml per enhet for å ta hensyn til tap under den firedobbelte filtreringsprosessen, og 2) bevare aliquots av filtrater som negative kontroller for både strømningscytometri og molekylære prosedyrer. - Filtrer filtratet to ganger gjennom en 0,2 μm hydrofil gp filterpatron (med samme, begge ganger) med en ny 50 ml sprøyte i et nytt konisk sentrifugerør på 50 ml. Filtrer filtratet gjennom et 0,02 μm sprøytefilter (med en ny 50 ml sprøyte) inn i et nytt konisk rør på 50 ml.
MERK: Denne firedoble filtreringen skal fjerne nesten alle mikroorganismer og partikler fra vannet. Hold den endelige filtraten borte fra enhver varmekilde til bruk. Dette vannet vil bli brukt til å gjenbruke alle kjemikalier som brukes i ISCA, og det bør opprettholdes ved samme temperatur som vannet på distribusjonsstedet. Konvektive strømmer utløst av temperaturforskjeller mellom ISCA-brønnene og utenformiljøet kan ellers forekomme. - Bruk aliquots av filtratet til å gjenbruke alle kjemoattractants av interesse (vanligvis tørr) til de ønskede konsentrasjonene i 15 ml koniske sentrifuge rør.
- Filtrer de resuspenderte kjemoattractivane gjennom et sprøytefilter på 0,2 μm med en 10 ml sprøyte i sterile koniske sentrifugerør for å fjerne uønskede partikler eller vannløselige forbindelser (hvis du bruker ekstrakter).
MERK: Filtrer forsiktig for å hindre at partikler passerer gjennom filteret. Det er viktig å bruke kjemoattractivane i det ultrafiltrerte vannet fra feltområdet og ikke løse dem til andre løsninger. Bruk av vann fra feltområdet er nødvendig for å (1) oppnå samme saltkonsentrasjon inne i brønnene som i bulkmiljøvannet for å hindre tetthetsdrevet strømning, og (2) garantere at næringsnivået i bakgrunnen er like innenfor og utenfor brønnen.
- Samle vann fra feltområdet når du er klar til å starte eksperimentet. Filtrer 5 ml vann per ISCA gjennom et 0,2 μm sprøytefilter (med en 50 ml sprøyte) i et konisk sentrifugrør på 50 ml.
- ISCA-fylling
- Utfør avsnitt 1.3 for å fylle ISCA.
MERK: Det anbefales å fylle én rad (fem brønner) per stoff (det vil si tre forskjellige stoffer per ISCA og en ultrafiltrert sjøvannskontroll).
- Utfør avsnitt 1.3 for å fylle ISCA.
- Distribusjon i feltet
- Skru ISCA (figur 3A) til del 9 i kabinettet (figur 2K og figur 3B).
MERK: Strømningsdempende kabinettet som er skissert ovenfor, kan inneholde to ISCAer side ved side eller en ISCA plassert i midten. - Lukk kabinettet (figur 3C) og forsegle det med tape (figur 3D).
MERK: Rynker må unngås for å sikre en perfekt forsegling. Forsegle alle sider først, deretter (i et andre trinn) forsegle sidehullene, som vil bli brukt til å drenere vann fra kabinettet på slutten av prøvetaking. Ikke forsegle de øverste og nederste hullene. Ikke plasser ISCA opp ned, da tetthetsdrevet strømning kan forekomme i brønner som inneholder kjemoattractants, noe som vil forutse antall celler i brønnene. - Fordi kabinettet må forbli stødig under distribusjon, anbefales det å feste det til menneskeskapte strukturer (f.eks. pongtong, stige) ved hjelp av strikkledninger.
MERK: Kabinettet kan festes til en uttrekkingsarm (her, en modifisert klemme med en vinkelrett plattform) ved hjelp av strikkledninger før nedsenking i vannet. Alternativt kan kabinettet fylles og sikres med en liten vekt på grunne underlag. Hvis utplasseringer er ment i det pelagiske havet, kan kabinettet festes til et nett med bøye på den ene siden og dykke vekt på den andre. - Senk kabinettet helt ned for å begynne å fylle. Hold kabinettet godt under påfylling for å unngå overdreven vannbevegelse inne. Når vannnivået når toppen av kabinettet, må du sørge for at ingen luft er fanget inne.
MERK: Hvis noen luftbobler er fanget, vipp kabinettet forsiktig med ventilasjonshullet vendt oppover, noe som gjør at boblene kan unnslippe. - Når de er helt fulle, forsegler du bunn- og topphullene med to plugger, som kan være laget av silisium eller gummi eller ved å forsegle ekstremitetene på 20 μL pipettespisser (figur 4).
MERK: Dette trinnet forhindrer strømning inne i kabinettet under prøvetaking. - La ISCA være på plass for prøvetaking i 1–3 timer.
MERK: Den ideelle distribusjonstiden dikteres hovedsakelig av temperaturen på vannet og doblingstiden til bakteriesamfunnet. Når vanntemperaturen er over 20 °C, anbefales det ikke å distribuere ISCA i mer enn 1 time, fordi celledeling kan forekomme i brønnene som inneholder kjemoattractants etter 1,5–2,0 timer. Optimal distribusjonstid kan imidlertid testes før ISCA-eksperimentet ved å endre naturlige samfunn med de lastede kjemikaliene og kvantifisere antall celler gjennom tiden. - Fjern kabinettet fra vannet. Plasser den over en beholder slik at vannet kan dreneres fra kabinettet.
- Fjern den øvre delen av teipen fra de fremre hullene veldig forsiktig.
MERK: Vannstrømmen som forlater kabinettet må være i dryppende hastighet. Fortsett ett hull om gangen, fra toppen av kabinettet til bunnen. Det bør ta ca 10-15 min å tømme kabinettet helt. - Når vannlinjen passerer under toppen av ISCA, fjern bunnpluggen og tøm resten av vannet.
- Mens ISCAs fortsatt er festet til kabinettet, fjern forsiktig vannet som er fanget på toppen av ISCA med en 1 ml pipette.
- Fjern ISCA uten å berøre den øvre overflaten og bruk en engangsserviett for å fjerne gjenværende væske på overflaten.
MERK: Det er viktig å ikke berøre portene under denne prosessen, da de resulterende trykkendringene kan fjerne eller legge bulkbakterier inn i brønnen og skjevheten bakterietallene. - Hent prøvene fra ISCA ved å gjenta trinn 1.5.1.
- Skru ISCA (figur 3A) til del 9 i kabinettet (figur 2K og figur 3B).
4. Nedstrøms applikasjoner
MERK: Volumer gis basert på en 550 μL prøve (én rad i en ISCA).
- Fest 100 μL godt innhold med glutaraldehyd (2% endelig konsentrasjon) for strømningscytometri for å kvantifisere chemotaxis til hvert attractant.
MERK: Oppbevares på is (eller ved 4 °C) og analyser prøvene samme dag. Alternativt kan prøver bli blinket frosset i flytende nitrogen etter fiksering hvis analyse ikke er mulig på samme dag. Flow cytometri er den anbefalte metoden for å kvantifisere antall celler i ISCA-brønnene, da det er enkelt, raskt og nøyaktig12. - Snap fryse 300 μL av brønninnhold i flytende nitrogen for påfølgende DNA ekstraksjon og analyse11.
MERK: Oppbevar prøvene ved -80 °C til analyse. - Tilsett 90 μL godt innhold i 10 μL TE-glyserolbuffer og fest prøvene for encelledegenomikk 13.
- Spred 10–20 μL på agarplater som inneholder ønsket medium for bakteriell isolasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen presenterer laboratorieresultater ved hjelp av ISCA for å teste den chemotaktiske responsen av marine mikrober til et konsentrasjonsområde av glutamin, en aminosyre kjent for å tiltrekke seg jordbakterier14. Konsentrasjonen av glutamin som fremkalte den sterkeste kjemotaktiske responsen i laboratorietestene ble brukt til å utføre en chemotaxis analyse i det marine miljøet.
For å utføre laboratorietestene ble sjøvannssamfunn samplet fra kystvann i Sydney, Australia, beriket for motile celler gjennom en enkel næringsendring4, som beskrevet i trinn 1.4. Glutamin ble serielt fortynnet i ultrafiltrert sjøvann for å oppnå endelige konsentrasjoner fra 10 mM til 100 μM. Fem ISCA-repliker ble utplassert samtidig for dette eksperimentet, og hver inneholdt tre forskjellige glutaminkonsentrasjoner (en konsentrasjon per rad) samt en filtrert sjøvannskontrollrad. Etter en 1 h-utplassering ble innholdet i hver ISCA-rad (som inneholder samme glutaminkonsentrasjon) samlet for å gi arbeidsprøver på ca. 550 μL. Dette volumet ble løst i glutaraldehyd (2% endelig konsentrasjon), og antall responderende bakterier kvantifisert via strømningscytometri.
Kort sagt, bakteriell overflod ble kvantifisert av 1) farging cellene med en grønn fluorescerende DNA fargestoff og 2) analyse ved hjelp av en strømningscytometer med ultrafiltrert deionisert vann som skjedevæske. For hvert utvalg ble det registrert foroversp utvalg (FSC), sidesptrød (SSC) og grønn fluorescens. Prøvene ble analysert med en strømningshastighet på 25 μL/min, med bakterielle celler diskriminert i henhold til SSC og grønn fluorescens. Den chemotaktiske indeksen (Ic) ble bestemt ved å dele bakterietallene som finnes i hver prøve med gjennomsnittlig bakterielle tellinger i de filtrerte sjøvannskontrollbrønnene (FSW).
Resultatene viste at 1 mM var den optimale glutamindistribusjonskonsentrasjonen, da det induserte en signifikanttchemotaktisk respons som var 18 ganger høyere enn den filtrerte sjøvannskontrollen ( t-test, p < 0,001) (figur 5A). Høyere eller lavere konsentrasjoner av glutamin indusert signifikante, men svakere chemotaktiske responser (Ic = 5,43 for 100 μM, p < 0,001; Ic = 7,34 for 10 μM, p < 0,001). Hvis kjemoattractantkonsentrasjonen som legges til en ISCA-brønn er for høy, kan chemotaxis i brønnen reduseres, fordi (1) bakterier ikke vil kunne oppdage en gradient i portdelen og kan aggregere over brønnen, eller (2) pH eller osmolaritet av brønnen kan bli påvirket.
Den optimale glutaminkonsentrasjonen ble senere brukt til feltdistribusjon. Fem ISCA-replikerer fylt med 1 mM glutamin ble utplassert i 1 time på et kystområde i nærheten av Sydney, Australia (33,91 °S, 151,26 °E). Glutamin tiltrakk seg 2,98 ganger flere bakterier enn kontrollbrønnene fylt med filtrert sjøvann fra distribusjonsstedet (figur 5B). Den chemotaktiske responsen i dette felteksperimentet var vesentlig forskjellig frakontrollene( t-test, p < 0,001) og utgjorde en sterk respons for kystvann11.
Figur 1: Detaljerte synspunkter på in situ chemotaxis-analysen (ISCA). (A)Den nyeste injeksjonsstøpte ISCA. (B) Skjematisk av en ISCA brønn. Skala bar = 7.463 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Montering av strømningsdempende kabinett. (A)Delene som kreves for montering av uttrekkingskabinettet. Under fabrikasjon bør kantene være glatte. (B) Plasser delene 2a, 2b, 3a og 3b rundt stk 1 (nedre overflate). (C) Monter den nedre delen av kabinettet ved å sette et tynt lag med akryllim rundt den første kanten av den nedre overflaten (1). (D) Plasser det første lengre sideveggstykket (2a) vertikalt på limet og hold det på plass. Limet krever ~ 1 min for å stivne og tillater stykke 2a å støtte seg selv mens du plasserer neste element. (E) Påfør et tynt lag akryllim på underoverflaten på en kortere side av stk 1. Plasser det korte sideveggstykket (3a) på akryllimet og lås det inn i den tidligere plasserte sideveggen. Hold de to delene i ca. 1 min. (F) Plasser det andre kortsideveggstykket (3b) på motsatt side av underflaten (1). Igjen låser du den inn i forbindelsesstykket (2a) og holder det i ca. 1 min. (G) Bruk om nødvendig akryllim på den gjenværende langsiden av underoverflaten (1). Plasser det siste lange sideveggstykket (2b) og koble det til de to tilstøtende delene (3a og 3b). Pass på at alle bitene er riktig justert med det nedre stykket (1) og at det ikke er tegn til feiljustering eller mellomrom mellom sidevegger eller under overflaten. Gjenta disse trinnene for å montere den komplementære øvre delen av kabinettet (4, 5a, 5b, 6a og 6b). (H) Kontroller at hullet i hjørnet av stk 4 ikke er blokkert under monteringen, ellers slå åpningen med en skarp gjenstand som en nål. Hullene i kabinettet spiller en avgjørende rolle i distribusjonsprosessen og tillater vann å renne på en langsom og kontrollert måte. Diameteren er optimalisert for å redusere turbulent strømning inne i kabinettet, noe som forhindrer forstyrrelser av væsken rundt ISCA-porter ved henting. (Ia,b) Lim sammen to store rektangler (7) og lim to mindre separat (8). Gjenta én gang for hver. (J) Lim de fire monterte rektanglene i midten av kabinettets nedre overflate (1). (K) Lim det øvre decket (9) oppå rektanglene (7 og 8). Pass på at sidehullene på stykket er på utsiden av rektanglene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plassering av ISCAer i kabinettet og forsegling ved å teipe. (A)Plasser monteringsskruene i ISCA. (B) ISCA plassering i distribusjonskabinettet. Plasser ISCA midt i distribusjonskabinettet og fest den med de angitte skruene. Det nedre dreneringshullet i kabinettet må forsegles med en modifisert 20 μL-spiss (figur 4) når kabinettet er fylt med vann. Dette bidrar til å unngå generering av turbulente strømmer som kan påvirke stabiliteten til det kjemiske feltet og effektiviteten av chemotaxis. (C) De øvre og nedre delene er montert sammen. (D) Tetting av kabinettet ved hjelp av tape. Rynker må unngås for å hindre lekkasjer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Plugg for tetting av strømningsdempende kabinett. Pluggen kan gjøres ved å forsegle en 20 μL pipettespiss med varme. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Chemotaxis analyserer ved hjelp av ISCA mot glutamin av et beriket motilsamfunn i laboratoriet og naturlig mikrobiell befolkning i feltet. Chemotaxis indeks Ic (som representerer konsentrasjonen av celler i ISCA-brønner) normalisert ved gjennomsnittlig konsentrasjon av celler i brønnene som inneholder det filtrerte sjøvannet (FSW) etter 60 min distribusjon. Hver konsentrasjon ble testet i fem ISCA replikerer. Bakterieceller ble kvantifisert ved strømningscytometri (A): FSW = 4,46 ± 0,25 x 103; 100 μM = 2,43 ± 0,16 x 104; 1 mM = 8,07 ± 0,45 x 104; 10 mM = 3,28 ± 0,20 x 104; (B): FSW = 1,26 ± 0,11 x 104; 1 mM = 3,76 ± 0,28 x 104 celler/ml). Alle konsentrasjoner av glutamin testet i (A) laboratoriet og (B) feltet induserte en chemotactic respons betydelig høyere enn de filtrerte sjøvann (FSW) kontroller. I alle sammenligninger på pairvis: (A) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005; (B) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005. Feilfelt representerer SEM. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Feltmateriale | Antall |
| Filtrering av vann | |
| Rørstativ - 50 ml | 1 |
| Hydrofil gp filterpatron - 0,2 μm | 1 |
| Sprøytefilter - 0,2 μm | 1 |
| Sprøytefilter - 0,02 μm | 1 |
| Sprøyter - 50 ml | 4 |
| Konisk sentrifuge rør - 50 ml | 5 |
| Kjemisk resuspensjon | |
| Konisk sentrifuge rør - 15 ml | 4 |
| Kjemoattractants | |
| Sprøyter - 10 ml | 4 |
| Sprøytefilter - 0,2 μm | 4 |
| Rørstativ - 15 ml | 1 |
| ISCA-fylling | |
| Sprøytenål 27G | 4 |
| Sprøyte - 1 ml | 4 |
| ISCA | 1 |
| Distribusjon | |
| Kabinett for distribusjon | 1 |
| Nylon slisset flate hodet skruer | 2 |
| Arm for distribusjon | 1 |
| Strikk ledning | 2 |
| Tape | 1 |
| Plugg for innkapsling av utkapsling | 1 |
| Eksempler henting | |
| Sprøytenål 27G | 4 |
| Sprøyter - 1 ml | 4 |
| Sentrifuge rør - 2 ml | 12 |
| Disponibel viskere | 1 boks |
| Glutaraldehyd 25% | 10 ml |
| Annet materiale | |
| Pipetter sett | 1 |
| Pipettespisser 200 μL | 1 boks |
| Pipettespisser 20 μL | 1 boks |
| Pipettespisser 1 ml | 1 boks |
Tabell 1: Materialer som er nødvendige for feltdistribusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På omfanget av akvatiske mikroorganismer er miljøet langt fra homogent og er ofte preget av fysiske / kjemiske gradienter som strukturerer mikrobielle samfunn1,15. Kapasiteten til motile mikroorganismer til å bruke atferd (det vil si chemotaxis) letter foraging innenfor disse heterogene mikromiljøene1. Å studere chemotaxis direkte i miljøet har potensial til å identifisere viktige interspesifikke interaksjoner og kjemiske preferanser, og dette kan bidra til å løse bidragene fra spesifikke mikrober til biogeokjemiske prosesser. Den presenterte protokollen distribuerer ISCA i miljøet11 for å lette oppkjøpet av reproduserbar forskning på chemotaxis in situ.
Ved hjelp av ISCA er det vist at glutamin fremkaller en positiv chemotaktisk respons både under laboratorieforhold og i feltet. ISCA-utplasseringen av glutamin i feltet gir en lavere chemotaktisk respons enn i laboratoriet (figur 5). Lignende patters mellom laboratorie- og felteksperimenter har blitt observert tidligere11. Disse kan forklares av den nedre andelen motile celler i miljøet sammenlignet med de berikede samfunnene eller enkelt motile isolat som brukes i laboratorieanalyser.
Betydningen av foreløpige laboratoriebaserte eksperimenter bør ikke undervurderes, da de tillater bestemmelse av optimale kjemoattracterende konsentrasjoner å bruke i feltdistribusjoner. Den optimale konsentrasjonen er spesifikk for hver kjemoattractant og påvirket av sin molekylære vekt, løselighet og diffusivitet fra brønnene. Ved utplassering av flere forskjellige stoffer, bør hver testes individuelt over et konsentrasjonsområde. Hvis ingen chemotaxis oppdages i feltet etter 1 t, kan lengre distribusjoner utføres. Lengden på utplasseringen er imidlertid sterkt begrenset av bakteriell vekst og bør alltid være kortere enn divisjonsraten for bakterier i det målrettede miljøet. Dette bidrar til å unngå befolkningsvekst innen ISCA.
ISCA er følsom for vannturbulens og forsiktighet bør tas ved fylling og tømming av strømningsdempende kabinett. Disse trinnene må utføres sakte, fordi strømmer som følge av rask fylling kan skylle eller fortynne innholdet i brønnene. Som et resultat fjerner eller forhindrer dette at kjemoattractants sprer seg riktig eller introduserer bakterier fra omgivelsene, til slutt forutinntatte celletellinger. Fullstendig fylling av kabinettet med vann mens du lufter all luft, og lukker det helt, sikrer at turbulens ikke forstyrrer utplasseringen. Innsamling av metadata på distribusjonsstedet (det vil si temperatur, saltholdighet, klorofyll/næringskonsentrasjon) er også et kritisk skritt for å tolke resultater, da disse faktorene kan påvirke chemotaxis.
ISCA er en tilgjengelig, brukervennlig enhet som gir ny innsikt i rollen og utbredelsen av chemotaxis i miljøet. Det muliggjør avhør av chemotaxis i ethvert system som inneholder en flytende fase (f.eks marine, ferskvann, jord, avløpsvannsystemer). Til slutt kan den brukes til målrettede studier på patogener og antibiotikaresistens i miljøet, isolering av viktige mikrober for bioprospektering, og bioremediering av spesifikke forurensende stoffer og mikroplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis finansiert av Gordon og Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, gjennom å gi GBMF3801 til J.R.S. og R.S., og en Investigator Award (GBMF3783) til R.S., samt en Australian Research Council Fellowship (DE160100636) til J.B.R., en pris fra Simons Foundation til B.S.L. (594111), og et stipend fra Simons Foundation (542395) til R.S. som en del av prinsippene for mikrobielle økosystemer (PriME) Collaborative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | - | - | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes - 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes - 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes - 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
References
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
