Test de chimiotaxis in situ pour examiner le comportement microbien dans les écosystèmes aquatiques

Summary

Présenté ici est le protocole pour un test de chimiotaxis in situ, un dispositif microfluidique récemment développé qui permet des études du comportement microbien directement dans l’environnement.

Abstract

Les comportements microbiens, tels que la motilité et la chimiotaxis (la capacité d’une cellule à modifier son mouvement en réponse à un gradient chimique), sont répandus dans les domaines bactérien et archéal. Les chimiotaxis peuvent se traduire par d’importants avantages d’acquisition de ressources dans des environnements hétérogènes. Il joue également un rôle crucial dans les interactions symbiotiques, les maladies et les processus mondiaux, tels que le cyclisme biogéochimique. Cependant, les techniques actuelles limitent la recherche de chimiotaxis au laboratoire et ne sont pas facilement applicables sur le terrain. Présenté ici est un protocole étape par étape pour le déploiement de l’essai in situ chemotaxis (ISCA), un dispositif qui permet un interrogatoire robuste de chimiotaxis microbienne directement dans l’environnement naturel. L’ISCA est un dispositif microfluidique composé d’un réseau de 20 puits, dans lequel les produits chimiques d’intérêt peuvent être chargés. Une fois déployés dans des environnements aqueux, les produits chimiques se diffusent hors des puits, créant des gradients de concentration auxquels les microbes sentent et réagissent en nageant dans les puits par le biais de chimiotaxis. Le contenu du puits peut ensuite être échantillonné et utilisé pour (1) quantifier la force des réponses chimiotaxiques à des composés spécifiques par cytométrie de flux, (2) isoler et la culture des micro-organismes sensibles, et (3) caractériser l’identité et le potentiel génomique des populations répondantes par des techniques moléculaires. L’ISCA est une plate-forme flexible qui peut être déployée dans n’importe quel système avec une phase aqueuse, y compris les milieux marins, d’eau douce et de sol.

Introduction

Divers micro-organismes utilisent la motilité et la chimiotaxis pour exploiter des environnements nutritifs irréguliers, trouver des hôtes, ou éviter les conditions délétères^1,2,3. Ces comportements microbiens peuvent à leur tour influencer les taux de transformation chimique⁴ et favoriser des partenariats symbiotiques entre les écosystèmes terrestres, d’eau douce et marins^2,5.

Chemotaxis a été largement étudié dans des conditions de laboratoire pour les 60 dernières années⁶. La première méthode quantitative pour étudier la chimiotaxis, l’essai capillaire, implique un tube capillaire rempli d’un chimioattractant putatif immergé dans une suspension de bactéries⁶. La diffusion du produit chimique hors du tube crée un gradient chimique, et les bactéries chimiotaxiques réagissent à ce gradient en migrant dans le tube⁷. Depuis le développement de l’essai capillaire, encore largement utilisé aujourd’hui, de nombreuses autres techniques ont été développées pour étudier la chimiotaxis dans des conditions physiques/chimiques de plus en plus contrôlées, la plus récente impliquant l’utilisation de microfluidiques^8,9,10.

La microfluidique, associée à la microscopie vidéo à haute vitesse, permet de suivre le comportement des cellules individuelles en réponse à des gradients soigneusement contrôlés. Bien que ces techniques aient grandement amélioré notre compréhension de la chimiotaxis, elles ont été limitées à l’utilisation en laboratoire et ne se traduisent pas facilement par le déploiement sur le terrain dans les systèmes environnementaux. Par conséquent, la capacité des communautés naturelles de bactéries à utiliser des chimiotaxis dans les écosystèmes naturels n’a pas été examinée; ainsi, la compréhension actuelle de l’importance écologique potentielle de la chimiotaxis est biaisée vers des conditions artificielles de laboratoire et un nombre limité d’isolats bactériens de culture en laboratoire. L’ISCA récemment développé surmonte ces limitations¹¹.

L’ISCA s’appuie sur le principe général de l’essai capillaire; cependant, il utilise des techniques modernes de microfabrication pour fournir une plate-forme expérimentale hautement répliquée et facilement déployable pour la quantification de la chimiotaxis vers des composés d’intérêt pour l’environnement naturel. Il permet également l’identification et la caractérisation des micro-organismes chimiotaxiques par l’isolement direct ou les techniques moléculaires. Alors que le premier dispositif de travail a été auto-fabriqué et construit en verre et PDMS¹¹, la dernière version moulée par injection est composée de polycarbonate, en utilisant une procédure de fabrication très standardisée (pour l’intérêt pour la dernière version de l’appareil, les auteurs correspondants peuvent être contactés).

L’ISCA est de la taille d’une carte de crédit et se compose de 20 puits répartis dans un réseau de puits de 5 x 4, chacun relié à l’environnement aquatique externe par un petit port (800 μm de diamètre; Figure 1). Les chimioattractants putatifs chargés dans les puits se diffusent dans l’environnement via le port, et les microbes chimiotaxiques réagissent en nageant à travers le port dans le puits. Comme de nombreux facteurs peuvent influer sur le résultat d’une expérience isca dans l’environnement naturel, ce protocole étape par étape aidera les nouveaux utilisateurs à surmonter les obstacles potentiels et à faciliter des déploiements efficaces.

Protocol

Nous recommandons d’exécuter la section 1 avant les expériences sur le terrain afin d’optimiser les résultats.

1. Optimisation de laboratoire

REMARQUE : Les volumes décrits dans la procédure d’optimisation sont suffisants pour un seul ISCA (composé de 20 puits).

1. Préparation du produit chimique d’intérêt
   REMARQUE : La concentration optimale pour chaque chimioattractant doit souvent être déterminée dans des conditions de laboratoire avant les déploiements sur le terrain. Le champ de concentration chimique diminuera en magnitude avec la distance de la source (puits ISCA), ce qui signifie que la concentration ressentie par les micro-organismes dans l’environnement sera inférieure à celle présente à l’intérieur de l’appareil. La concentration optimale à utiliser dans le puits ISCA dépend du taux de diffusion du chimiotractant. Si la concentration dans le puits est trop faible (proche de la limite de détection des microbes), aucune chimiotaxis positive ne sera observée. Inversement, si la concentration dans le puits est trop élevée, la concentration sera également élevée dans l’environnement immédiat et l’accumulation microbienne se produira au-dessus des puits de l’ISCA plutôt qu’à l’intérieur. Par conséquent, la série de dilution doit être effectuée dans des conditions de laboratoire pour chaque composé afin de déterminer la concentration optimale pour les déploiements sur le terrain. Idéalement, une plage de concentration devrait également être testée sur le terrain pour confirmer les résultats de laboratoire.
   1. Préparer 2,5 L d’un milieu approprié contenant la concentration de sel appropriée (p. ex., saline tamponnée de phosphate [PBS] ou eau de mer artificielle). Filtrer le milieu à l’aide d’un filtre de 0,2 μm à l’aide d’une pompe péristaltique ou sous vide et d’une autoclave.
   2. Préparer une solution de 10 mM de chimioattractant dans 1 mL du milieu stérile. Filtrer la solution chimioattractante à l’aide d’un filtre à seringues de 0,2 μm pour éliminer les particules et les contaminants potentiels.
      REMARQUE : Idéalement, aucun composé organique autre que le chimiotractant ne devrait être présent dans la solution finale.
2. Plage de concentration par série de dilution
   1. Diluer la solution de stock chimioattractant filtrée en série, allant (par exemple) de 10 mM à 100 μM.
      REMARQUE : Au moins un volume final de 0,7 mL est nécessaire par concentration testée.
3. Chargement de l’ISCA
   1. Remplissez une seringue de 1 mL avec le chimioattractant filtré et connectez-la à une seringue de 27 G. Tenir l’ISCA avec le port orienté vers le haut, injecter lentement la substance jusqu’à ce qu’une petite gouttelette apparaisse sur le dessus du port.
      REMARQUE : 1) Chaque dilution ou substance doit être injectée avec une seringue et une aiguille séparées pour prévenir la contamination croisée. 2) Cette petite gouttelette est importante parce qu’elle garantit qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée dans le port, ce qui pourrait nuire à la capacité des microbes de migrer à travers le port. 3) Il est recommandé de remplir une rangée entière par substance ou concentration (cinq puits) afin de fournir un volume minimal adéquat pour d’autres analyses. 4) Une ligne par ISCA doit agir comme contrôle négatif et doit être remplie avec le milieu filtré dans lequel les microbes seront suspendus. Ce traitement explique l’effet de la motilité aléatoire par les microbes dans les puits de l’ISCA et devrait être utilisé pour normaliser les traitements contenant un chimiotractant.
4. Déploiement en laboratoire
   1. Du jour au lendemain, incuber une culture de 5 mL enrichie de 1% de bouillon marin (pour les bactéries marines) ou de 1% de bouillon de lysogénie (LB, pour les bactéries d’eau douce).
      REMARQUE : Les isolats bactériens motiles ou les communautés bactériennes naturelles peuvent être utilisés pour les déploiements en laboratoire.
   2. Incuber la culture pendant 12 h à température ambiante (RT) et 180 tr/min. Après 12 h, assurez-vous que les communautés microbiennes sont motiles par observation directe au microscope.
   3. Faites tourner la culture à 1 500 x g pendant 10 min et resuspendez 1/100 dans 150 mL de milieu approprié (p. ex., eau de mer filtrée, eau douce filtrée).
   4. Placez deux petits morceaux de ruban adhésif à double face sur la surface plane d’un plateau de capacité de 200 mL (les couvercles des boîtes à pointes de 1 mL ont les dimensions idéales à cet effet et peuvent facilement être autoclavés). Placez un ISCA sur le dessus, en vous assurant qu’il se fixe solidement à la bande. Remplissez lentement le plateau de déploiement avec la solution bactérienne à l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL.
      REMARQUE : Remplissez le plateau jusqu’à ce que l’ISCA soit submergée sous environ 1 à 2 cm de liquide. Si vous utilisez plusieurs plateaux, utilisez le même volume dans l’ensemble.
   5. Laisser l’ISCA incuber pendant 1 h pour permettre la chimiotaxie bactérienne. Après 1 h, retirer le milieu très doucement avec une pipette sérologique de 50 mL pour minimiser le débit turbulent.
   6. Récupérez l’ISCA du plateau de déploiement sans toucher la surface supérieure. Utilisez une pipette et des essuie-glaces jetables pour enlever le liquide restant sur la surface de l’ISCA.
      REMARQUE : Il est important d’éviter de toucher les ports pendant ce processus, car les changements de pression qui en résultent peuvent éliminer ou ajouter des bactéries de l’environnement extérieur dans le puits et biaiser ainsi la densité bactérienne et la composition à l’intérieur du puits.
5. Récupération des échantillons
   1. En tenant l’ISCA avec le port orienté vers le bas, récupérer le volume des puits à l’aide d’une aiguille stérile de 27 G fixée à une seringue de 1 mL.
      REMARQUE : Chaque rangée (si elle contient la même substance) peut être mise en commun pour fournir un échantillon de travail d’environ 550 μL. Cet échantillon peut ensuite être aliquoté dans différents tubes en fonction des applications en aval requises.
   2. Déterminer le nombre de bactéries attirées par chaque concentration de chimioattractant en analysant les échantillons avec la cytométrie de flux¹². Choisissez la concentration de chimioattractant qui maximise la chimiotaxis pour les déploiements ultérieurs sur le terrain.

2. Préparation au déploiement sur le terrain

REMARQUE : La préparation du matériau et la construction de l’enceinte d’amortissement des débits (section 2) doivent être effectuées avant le déploiement.

1. Préparation des matériaux
   1. Préparer tous les documents énumérés au tableau 1.
      REMARQUE : Des quantités de matériaux sont fournies pour un ISCA.
2. Construction et préparation de l’enceinte d’amortissement du débit
   REMARQUE : L’enceinte d’amortissement des débits minimise les turbulences indésirables qui empêchent autrement l’établissement de gradients chimiques émanant de l’ISCA.
   1. Couper les morceaux pour l’enceinte de déploiement à l’aide d’un coupe-laser à partir d’une feuille acrylique de 3 mm.
      REMARQUE : Le fichier des pièces se trouve à l’aide du lien suivant : .
   2. Assemblez les morceaux découpés au laser comme le démontre la figure 2 à l’aide de colle acrylique.
      REMARQUE : Assemblez les pièces avec soin. Les trous ou le désalignement peuvent créer des fuites lors du déploiement, ce qui a un impact direct sur la qualité des données.
   3. Laisser sécher l’enceinte assemblée pendant la nuit.
   4. Laver l’enceinte avec de l’eau déionisée.
   5. Identifier les fuites potentielles en versant de l’eau déionisée dans l’enceinte. Fixer les joints qui fuient en ajoutant plus de colle acrylique, puis répétez les étapes 2.2.3–2.2.5.
   6. Couper les fils à vis dans la pièce acrylique qui sera utilisé pour sécuriser l’ISCA. Ceci peut être réalisé à l’aide d’un robinet avec un diamètre et un pas correspondant aux vis de montage.
      1. Tout d’abord, apposer le robinet dans une clé à robinet, puis fixer la pièce acrylique à taper dans un vice banctop. Pour les meilleurs résultats, assurez-vous que la pièce acrylique est aussi de niveau que possible. Assurez-vous que le robinet est perpendiculaire à la pièce acrylique et commencez à tourner la clé de robinet (dans le sens des aiguilles d’une montre), en appliquant une pression légère sur le robinet.
      2. Après plusieurs révolutions complètes dans la pièce acrylique, inverser la rotation du robinet (dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) pour un quart de rotation pour effacer l’acrylique du robinet. Répétez le processus jusqu’à ce que toute la profondeur de la pièce acrylique soit tapée.
      3. Enfin, retirez le robinet (en tournant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) et testez les fils à l’aide d’une vis.

3. Procédure sur le terrain

1. Filtration de l’eau
   1. Recueillir l’eau du site du champ lorsque vous êtes prêt à commencer l’expérience. Filtrer 5 ml d’eau par ISCA à travers un filtre à seringues de 0,2 μm (avec une seringue de 50 ml) dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL.
      REMARQUE : Environ 3 mL d’eau filtrée sont nécessaires pour remplir tous les puits d’une ISCA; cependant, il est recommandé de filtrer 1) 5 mL par appareil pour tenir compte des pertes pendant le processus de filtration quadruple, et 2) préserver les aliquots des filtrates comme contrôles négatifs pour la cytométrie de flux et les procédures moléculaires.
   2. Filtrer le filtrate deux fois à travers une cartouche de filtre gp hydrophile de 0,2 μm (en utilisant la même, les deux fois) avec une nouvelle seringue de 50 ml dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 mL. Filtrer le filtrate à travers un filtre à seringues de 0,02 μm (avec une nouvelle seringue de 50 ml) dans un nouveau tube conique de 50 mL.
      REMARQUE : Cette quadruple filtration devrait éliminer presque tous les micro-organismes et particules de l’eau. Gardez le filtrate final à l’écart de toute source de chaleur jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Cette eau sera utilisée pour réutiliser tous les produits chimiques utilisés dans l’ISCA, et elle doit être maintenue à la même température que l’eau sur le site de déploiement. Des flux convectifs déclenchés par des différences de température entre les puits isca et l’environnement extérieur peuvent autrement se produire.
   3. Utilisez des aliquots du filtrate pour réutilire tous les chimioattractants d’intérêt (généralement secs) aux concentrations désirées dans les tubes de centrifugeuse conique de 15 mL.
   4. Filtrer les chimiotracteurs resuspendés à travers un filtre à seringues de 0,2 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL dans des tubes stériles de centrifugeuse conique de 15 m L pour éliminer les particules indésirables ou les composés insolubles (si vous utilisez des extraits).
      REMARQUE : Filtrer doucement pour empêcher les particules de passer à travers le filtre. Il est important de résuspender les chimioattractants dans l’eau ultrafiltrée à partir du site du champ et de ne pas les solubiliser dans d’autres solutions. L’utilisation de l’eau du site du champ est nécessaire pour (1) obtenir la même concentration de sel à l’intérieur des puits que dans l’eau environnementale en vrac pour prévenir le débit axé sur la densité, et (2) garantir que les niveaux d’éléments nutritifs de fond sont égaux à l’intérieur et à l’extérieur du puits.
2. Remplissage ISCA
   1. Effectuez la section 1.3 pour remplir l’ISCA.
      REMARQUE : Il est recommandé de remplir une rangée (cinq puits) par substance (c.-à-d. trois substances différentes par ISCA et une lutte contre l’eau de mer ultrafiltrée).
3. Déploiement sur le terrain
   1. Visser l’ISCA (Figure 3A) sur la pièce 9 de l’enceinte (figure 2K et figure 3B).
      REMARQUE : L’enceinte d’amortissement de l’écoulement décrite ci-dessus peut contenir deux ISCA côte à côte ou une ISCA placée au centre.
   2. Fermez l’enceinte (figure 3C)et scellez-la avec du ruban adhésif (figure 3D).
      REMARQUE : Les rides doivent être évitées pour assurer un joint parfait. Sceller tous les côtés d’abord, puis (dans une deuxième étape) sceller les trous latéraux, qui seront utilisés pour drainer l’eau de l’enceinte à la fin de l’échantillonnage. Ne pas sceller les trous supérieurs et inférieurs. Ne placez pas l’ISCA à l’envers, car le débit à densité peut se produire dans les puits contenant des chimioattractants, ce qui biaise le nombre de cellules dans les puits.
   3. Étant donné que l’enceinte doit rester stable pendant le déploiement, il est recommandé de l’attacher à des structures artificielles (p. ex., ponton, échelle) à l’aide de cordons élastiques.
      REMARQUE : L’enceinte peut être fixée à un bras de déploiement (ici, une pince modifiée avec une plate-forme perpendiculaire) à l’aide de cordons élastiques avant l’immersion dans l’eau. Alternativement, l’enceinte peut être remplie et fixée avec un petit poids sur des substrats peu profonds. Si des déploiements sont prévus dans l’océan pélagique, l’enceinte peut être fixée à un filet avec une bouée d’un côté et le poids de plongée de l’autre.
   4. Submergez complètement l’enceinte pour commencer à remplir. Pendant le remplissage, maintenez fermement l’enceinte pour éviter un mouvement excessif de l’eau à l’intérieur. Une fois que le niveau de l’eau atteint le sommet de l’enceinte, assurez-vous qu’aucun air n’est emprisonné à l’intérieur.
      REMARQUE : Dans le cas où certaines bulles d’air sont emprisonnées, inclinez doucement l’enceinte avec le trou d’évent orienté vers le haut, ce qui permettra aux bulles de s’échapper.
   5. Une fois complètement plein, sceller les trous inférieurs et supérieurs avec deux bouchons, qui peuvent être fabriqués à partir de silicium ou de caoutchouc ou en scellant les extrémités de 20 pointes de pipette μL (figure 4).
      REMARQUE : Cette étape empêche l’écoulement à l’intérieur de l’enceinte pendant l’échantillonnage.
   6. Laissez l’ISCA en place pour l’échantillonnage pendant 1 à 3 h.
      REMARQUE : Le temps de déploiement idéal est principalement dicté par la température de l’eau et le temps de doublement de la communauté bactérienne. Lorsque la température de l’eau est supérieure à 20 °C, il n’est pas recommandé de déployer l’ISCA pendant plus de 1 h, car la division cellulaire peut se produire dans les puits contenant des chimioattractants après 1,5–2,0 h. Toutefois, le temps de déploiement optimal peut être testé avant l’expérience de l’ISCA en modifiant les communautés naturelles avec les produits chimiques chargés et en quantifiant le nombre de cellules dans le temps.
   7. Retirez l’enceinte de l’eau. Placez-le sur un récipient permettant de drainer l’eau de l’enceinte.
   8. Retirez très doucement la partie supérieure du ruban adhésif des trous avant.
      REMARQUE : L’écoulement de l’eau qui sort de l’enceinte doit être à une vitesse de ruissellement. Procéder un trou à la fois, du haut de l’enceinte vers le bas. Il faut environ 10 à 15 min pour drainer complètement l’enceinte.
   9. Une fois que la ligne de flottaison passe sous le dessus de l’ISCA, retirez le bouchon inférieur et égouttez le reste de l’eau.
   10. Pendant que les ISCA sont toujours fixées à l’enceinte, retirez soigneusement l’eau emprisonnée sur le dessus de l’ISCA à l’aide d’une pipette de 1 mL.
   11. Retirer l’ISCA sans toucher la surface supérieure et utiliser un lingettes jetables pour enlever tout liquide restant à la surface.
       REMARQUE : Il est important de ne pas toucher les ports pendant ce processus, car les changements de pression qui en résultent peuvent éliminer ou ajouter des bactéries en vrac dans le puits et biaiser les dénombrements bactériens.
   12. Récupérez les échantillons de l’ISCA en répétant l’étape 1.5.1.

4. Applications en aval

REMARQUE : Les volumes sont donnés sur la base d’un échantillon de 550 μL (une rangée d’une ISCA).

1. Fixer 100 μL de contenu de puits avec du glutaraldéhyde (concentration finale de 2 %) pour la cytométrie du débit afin de quantifier le chemotaxis à chaque attractant.
   REMARQUE : Conserver sur la glace (ou à 4 °C) et analyser les échantillons le même jour. Alternativement, les échantillons peuvent être congelés par flash dans l’azote liquide après fixation si l’analyse n’est pas possible le même jour. La cytométrie du débit est la méthode recommandée pour quantifier le nombre de cellules dans les puits isca, car il est simple, rapide et précis¹².
2. Congeler 300 μL de teneur en puits dans l’azote liquide pour l’extraction et l’analyse ultérieures de l’ADN¹¹.
   REMARQUE : Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à l’analyse.
3. Ajouter 90 μL de contenu de puits à 10 μL de tampon TE-glycérol et congeler les échantillons pour la génomique unicellulaire¹³.
4. Étendre 10 à 20 μL sur les plaques d’agar contenant le milieu désiré pour l’isolement bactérien.

Representative Results

Cette section présente les résultats de laboratoire utilisant l’ISCA pour tester la réponse chimiotaxique des microbes marins à une gamme de concentration de glutamine, un acide aminé connu pour attirer les bactéries du sol¹⁴. La concentration de glutamine qui a suscité la réponse chimiotactique la plus forte dans les essais de laboratoire a été employée pour effectuer un essai de chemotaxis dans l’environnement marin.

Pour effectuer les tests de laboratoire, les communautés d’eau de mer échantillonnées dans les eaux côtières de Sydney, en Australie, ont été enrichies pour les cellules motiles par le biais d’un simple amendement nutritionnel⁴, tel que décrit à l’étape 1.4. La glutamine a été diluée en série dans de l’eau de mer ultrafiltrée pour obtenir des concentrations finales allant de 10 mM à 100 μM. Cinq répliques de l’ISCA ont été déployées simultanément pour cette expérience, et chacune contenait trois concentrations différentes de glutamine (une concentration par rangée) ainsi qu’une ligne de contrôle de l’eau de mer filtrée. Après un déploiement de 1 h, le contenu de chaque ligne ISCA (contenant la même concentration de glutamine) a été mis en commun pour fournir des échantillons de travail d’environ 550 μL. Ce volume a été fixé dans le glutaraldéhyde (concentration finale de 2%), et le nombre de bactéries répondantes quantifiées par cytométrie de flux.

En bref, l’abondance bactérienne a été quantifiée par 1) la coloration des cellules avec un colorant d’ADN fluorescent vert et 2) l’analyse utilisant un cytomètre de flux avec l’eau déionisée ultrafiltée comme fluide de gaine. Pour chaque échantillon, la dispersion vers l’avant (FSC), la dispersion latérale (SSC) et la fluorescence verte ont été enregistrées. Les échantillons ont été analysés à un débit de 25 μL/min, les cellules bactériennes discriminées selon le SSC et la fluorescence verte. L’indice chimiotaxique (I_c) a été déterminé en divisant les nombres bactériens présents dans chaque échantillon par les nombres bactériens moyens dans les puits de contrôle de l’eau de mer filtrées (FSW).

Les résultats ont montré que 1 mM était la concentration optimale de déploiement de glutamine, car elleta induit une réponse chimiotaxique significative qui était 18 fois plus élevée que la commande filtrée d’eau de mer ( t-test, p < 0.001) (Figure 5A). Des concentrations plus élevées ou inférieures de glutamine ont induit des réponses chimiotaxiques significatives mais plus faibles(I_c = 5,43 pour 100 μM, p < 0,001; I_c = 7,34 pour 10 μM, p < 0,001). Si la concentration de chimioattractant ajoutée à un puits isca est trop élevée, le chimiotaxis dans le puits peut être réduit, parce que (1) les bactéries ne seront pas en mesure de détecter un gradient dans la section de port et peuvent agréger au-dessus du puits, ou (2) le pH ou l’osmolarité du puits peuvent être affectés.

La concentration optimale de glutamine a ensuite été utilisée pour le déploiement sur le terrain. Cinq répliques de l’ISCA remplies de 1 mM de glutamine ont été déployées pendant 1 h sur un site côtier près de Sydney, en Australie (33,91 °S, 151,26 °E). La glutamine a attiré 2,98 fois plus de bactéries que les puits témoins remplis d’eau de mer filtrée du site de déploiement (figure 5B). La réponse chimiotaxique dans cette expérience sur le terrain était significativement différente des contrôles(t-test, p < 0,001) et constituait une réponse forte pour l’eau de mer côtière¹¹.

Figure 1 : Vues détaillées de l’essai de chimiotaxis in situ (ISCA). (A) La dernière ISCA moulée par injection. (B) Schéma d’un puits ISCA. Barre d’échelle = 7,463 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Assemblage de l’enceinte d’amortissement de l’écoulement. (A) Les pièces requises pour l’assemblage de l’enceinte de déploiement. Pendant la fabrication, les bords doivent être lisses. (B) Placer les pièces 2a, 2b, 3a et 3b autour de la pièce 1 (surface inférieure). (C) Assembler la partie inférieure de l’enceinte en plaçant une fine couche de colle acrylique autour du premier bord de la surface inférieure (1). (D) Placez verticalement la première pièce latérale plus longue (2a) sur la colle et maintenez-la en place. La colle nécessite ~1 min pour se solidifier et permet à la pièce 2a de se soutenir tout en plaçant l’élément suivant. (E) Appliquer une fine couche de colle acrylique sur la surface inférieure sur un côté plus court de la pièce 1. Placez la pièce latérale courte (3a) sur la colle acrylique et verrouillez-la dans la paroi latérale précédemment placée. Tenir les deux morceaux pendant environ 1 min. (F) Placer l’autre pièce de paroi latérale courte (3b) sur le côté opposé de la surface inférieure (1). Encore une fois, verrouillez-le dans la pièce de raccordement (2a) et maintenez-la pendant environ 1 min. (G) Si nécessaire, réappliquez la colle acrylique sur le côté long restant de la surface inférieure (1). Placez la dernière longue pièce latérale (2b) et connectez-la dans les deux pièces adjacentes (3a et 3b). Assurez-vous que toutes les pièces sont correctement alignées avec la pièce inférieure (1) et qu’aucun signe de désalignement ou d’écart entre les parois latérales ou la surface inférieure n’est présent. Répétez ces étapes pour assembler la partie supérieure complémentaire de l’enceinte (4, 5a, 5b, 6a et 6b). H) Assurez-vous que le trou dans le coin de la pièce 4 n’est pas obstrué pendant l’assemblage, sinon frappez l’ouverture avec un objet pointu comme une aiguille. Les trous de l’enceinte jouent un rôle essentiel dans le processus de déploiement et permettent à l’eau de s’écouler de manière lente et contrôlée. Leur diamètre a été optimisé pour réduire le flux turbulent à l’intérieur de l’enceinte, ce qui empêche la perturbation du fluide entourant les ports ISCA lors de la récupération. (Ia,b) Collez deux grands rectangles (7) et collez séparément deux petits (8). Répétez une fois pour chacun. (J) Collez les quatre rectangles assemblés au centre de la surface inférieure de l’enceinte (1). (K) Collez le pont supérieur (9) sur le dessus des rectangles (7 et 8). Assurez-vous que les trous latéraux de la pièce sont sur le côté externe des rectangles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Placement des ISCA dans l’enceinte et étanchéité par enregistrement. (A) Placez les vis de montage dans l’ISCA. (B) placement isca dans l’enceinte de déploiement. Placez l’ISCA au milieu de l’enceinte de déploiement et attachez-la avec les vis spécifiées. Le trou de vidange inférieur de l’enceinte doit être scellé avec une pointe modifiée de 20 μL (figure 4) une fois que l’enceinte est remplie d’eau. Cela permet d’éviter la génération de flux turbulents qui peuvent affecter la stabilité du champ chimique et l’efficacité de la chimiotaxis. (C) Les parties supérieures et inférieures sont assemblées ensemble. (D) Étanchéité de l’enceinte à l’aide de ruban adhésif. Les rides doivent être évitées pour prévenir les fuites. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Branchez-vous pour sceller l’enceinte d’amortissement du débit. La prise peut être faite en scellant une pointe de pipette de 20 μL avec de la chaleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Tests de chimiotaxis utilisant l’ISCA vers la glutamine d’une communauté de motile enrichie en laboratoire et population microbienne naturelle sur le terrain. L’indice chemotaxis I_c (représentant la concentration de cellules dans les puits ISCA) normalisé par la concentration moyenne de cellules dans les puits contenant l’eau de mer filtrée (FSW) après 60 min de déploiement. Chaque concentration a été testée dans cinq répliques isca. Les cellules bactériennes ont été quantifiées par cytométrie de débit (A) : FSW = 4,46 ± 0,25 x 10³; 100 μM = 2,43 ± 0,16 x 10⁴; 1 mM = 8,07 ± 0,45 x 10⁴; 10 mM = 3,28 ± 0,20 x 10⁴; (B): FSW = 1,26 ± 0,11 x 10⁴; 1 mM = 3,76 ± 0,28 x 10⁴ cellules/mL). Toutes les concentrations de glutamine testées dans le laboratoire (A) et (B) ont induit une réponse chimiotaxique significativement plus élevée que les contrôles de l’eau de mer filtrée (FSW).. Dans toutes les comparaisons en couple : (A) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005; (B) Tukey HSD, n = 5, p < 0,005. Les barres d’erreur représentent SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre.

Matériel de terrain	Quantité
Filtration de l’eau
Porte-tubes - 50 mL	1
Cartouche de filtre GP hydrophile - 0,2 μm	1
Filtre à seringues - 0,2 μm	1
Filtre à seringues - 0,02 μm	1
Seringues - 50 mL	4
Tube de centrifugeuse conique - 50 mL	5
Resuspension chimique
Tube de centrifugeuse conique - 15 mL	4
Les chimioattractants
Seringues - 10 mL	4
Filtre à seringues - 0,2 μm	4
Porte-tubes - 15 mL	1
Remplissage ISCA
Aiguille de seringue 27G	4
Seringue - 1 mL	4
Isca	1
Déploiement
Enceinte de déploiement	1
Vis à tête plates à fentes en nylon	2
Bras de déploiement	1
Cordon élastique	2
Ruban adhésif	1
Prise d’enceinte de déploiement	1
Récupération d’échantillons
Aiguille de seringue 27G	4
Seringues - 1 mL	4
Tube de centrifugeuse - 2 mL	12
Essuie-glaces jetables	1 boîte
Glutaraldéhyde 25%	10 mL
Autres documents
Ensemble de pipettes	1
Pipette pointes 200 μL	1 boîte
Pointes de pipette 20 μL	1 boîte
Pipette conseils 1 mL	1 boîte

Tableau 1 : Matériaux nécessaires au déploiement sur le terrain.

Discussion

À l’échelle des micro-organismes aquatiques, l’environnement est loin d’être homogène et se caractérise souvent par des gradients physiques/chimiques qui structurent les communautés microbiennes^1,15. La capacité des micro-organismes motiles à utiliser le comportement (c.-à-d. la chimiotaxis) facilite la recherche de nourriture dans ces microenvironnements hétérogènes¹. L’étude de la chimiotaxis directement dans l’environnement a le potentiel d’identifier d’importantes interactions interspécifiques et les préférences chimiques, ce qui peut aider à démêler les contributions de microbes spécifiques aux processus biogéochimiques. Le protocole présenté déploie l’ISCA dans l’environnement¹¹ pour faciliter l’acquisition de recherches reproductibles sur la chimiotaxis in situ.

À l’aide de l’ISCA, il est démontré que la glutamine provoque une réponse chimiotaxique positive tant en laboratoire qu’sur le terrain. Le déploiement de la glutamine par ISCA sur le terrain donne une réponse chimiotaxique inférieure à celle du laboratoire (figure 5). Des palpiters similaires entre les expériences de laboratoire et sur le terrain ont été observés précédemment¹¹. Cela s’explique par la proportion plus faible de cellules motiles dans l’environnement par rapport aux communautés enrichies ou à l’isolat motile unique utilisé dans les essais de laboratoire.

Il ne faut pas sous-estimer l’importance des expériences préliminaires en laboratoire, car elles permettent de déterminer les concentrations optimales de chimioattractants à utiliser dans les déploiements sur le terrain. La concentration optimale est spécifique à chaque chimioattractant et influencée par son poids moléculaire, sa solubilité et sa diffusion des puits. Dans le cas du déploiement de plusieurs substances distinctes, chacune doit être testée individuellement dans une plage de concentration. Si aucun chemotaxis n’est détecté sur le terrain après 1 h, des déploiements plus longs peuvent être effectués. Cependant, la durée du déploiement est fortement limitée par la croissance bactérienne et devrait toujours être plus courte que le taux de division des bactéries dans l’environnement ciblé. Cela permet d’éviter la croissance démographique au sein de l’ISCA.

L’ISCA est sensible aux turbulences d’eau et il faut faire attention lors du remplissage et du vidage de l’enceinte d’amortissement du débit. Ces étapes doivent être effectuées lentement, car les débits résultant d’un remplissage rapide peuvent rincer ou diluer le contenu des puits. En conséquence, cela élimine ou empêche les chimioattractants de diffuser correctement ou d’introduire des bactéries de l’environnement environnant, ce qui finit par biaiser le nombre de cellules. Remplir complètement l’enceinte d’eau tout en évacuant tout l’air, puis en le fermant complètement, garantit que la turbulence n’interférera pas avec le déploiement. La collecte de métadonnées sur le site de déploiement (c.-à-d. température, salinité, chlorophylle/concentration en éléments nutritifs) est également une étape essentielle pour interpréter les résultats, car ces facteurs peuvent influencer la chimiotaxis.

L’ISCA est un dispositif accessible et convivial qui fournit de nouvelles informations sur le rôle et la prévalence de la chimiotaxis dans l’environnement. Il permet d’interroger les chimiotaxis dans n’importe quel système contenant une phase liquide (p. ex., les systèmes marins, d’eau douce, de sol, d’eaux usées). Enfin, il peut être utilisé pour des études ciblées sur les agents pathogènes et la résistance aux antibiotiques dans l’environnement, l’isolement des microbes clés pour la bioprospection, et la biorestauration de polluants spécifiques et de microplastiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic glue	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K725	Or different company
Adhesive tape	Scotch	3M 810	Scotch Magic tape
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Benchtop centrifuge	Fisher Scientific	75002451	Or different company
Bungee cord	Paracord Planet	667569184000	Or different company
Centrifuge tube - 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon tube
Deployment arm	Irwin	1964719	Or different company
Deployment enclosure plug	Fisher Scientific	21-236-4	See alternatives in manuscript
Disposable wipers	Kimtech - Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Green fluorescent dye	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)	-	-	Contact corresponding authors
Laser cutter	Epilog Laser	Fusion pro 32	Or different company
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Or different company
Marine Broth 2216	VWR	90004-006	Difco
Nylon slotted flat head screws	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Pipette tips - 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	Or different company
Pipette tips - 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	Or different company
Pipette tips - 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	Or different company
Sea salt	Sigma Aldrich	S9883	For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	Or different company
Syringe filter - 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	Or different company
Syringe needle 27G	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL	Codau	329650	Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL	BD	303134	Or different company
Syringes - 50 mL	BD	15899152	Or different company
Tube rack - 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Tube rack - 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap	McMaster-Carr	8305A77	Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop filter