Summary
我们提出了一个体外血管疾病模型，以研究整个血液与患者衍生的内皮的相互作用。该系统允许研究各种情况下原发内皮细胞的血栓特性。该方法特别适用于凝血不同阶段的原位血栓形成性和抗凝治疗。
Abstract
血块的形成涉及内皮细胞、其底层基质、各种血细胞和蛋白质之间的复杂相互作用。内皮是控制血小板聚集、凝固和纤维化的许多主要止血分子的主要来源。虽然血栓形成的机制已经研究了几十 年 ，体外研究主要侧重于血管损伤的情况，其中下皮基质暴露，或细胞与单血成分之间的相互作用。我们的方法允许研究全血和完整的，汇合血管细胞网络之间的相互作用。
通过利用原发性人类内皮细胞，该协议为研究内皮细胞对血栓动力学的影响提供了独特的机会，并为血栓疾病的病理生理学提供了宝贵的见解。使用定制的微流体流通道可以应用疾病特异性血管几何体和模型特定的形态血管变化。血栓的发育记录为实时和定量特征，以血小板粘附和纤维素沉积为特征。通过特定分子的免疫荧光染色，通过后分析确定内皮功能在改变的血栓动力学中的影响。
代表性的结果描述了实验设置、数据收集和数据分析。根据研究问题，每个部分的参数都可以调整，包括细胞类型、剪切速率、通道几何形状、药物治疗和后分析程序。通过量化慢性血栓栓塞病患者肺动脉内皮的血栓形成，验证了该方案。
Introduction
内皮形成血管的内部细胞层，将血液与周围组织分离。它被描述为一个动态的器官，积极调节其微环境，并响应外部刺激1。由于其与流动血液的直接接触，内皮在控制血栓和血栓形成方面起着关键作用，并且是控制血小板聚集、凝固和纤维化2的许多主要调节分子的主要来源。健康、非活性内皮细胞（EC）产生多种分子，可抑制血小板活化，防止凝血和血栓形成，维持血液流动，如蛋白素、血栓素或组织因子通路抑制剂（TFPI）2、3。2,这可防止血小板的粘附、血小板聚集和血栓形成。血管壁的伤害或激活导致一个超凝内皮表型，启动局部血小板粘附和凝块形成2,2，4。当内皮激活血小板粘附于冯·威利布兰德因子（VWF）时，一种从ECs释放的多美蛋白，或与底层下表皮基质的暴露结合位点结合。随后，血小板的分子变化和接触组织因子（TF）启动凝固系统的激活，通过纤维蛋白聚合5，6,诱导血栓的形成。由此产生的血块共同通过重新内皮化7为伤口闭合提供了基础。凝固系统的扰动可能导致出血性疾病，如冯·威利布兰德病、血友病或血栓形成，这些疾病通常是由于内皮止血通路2、3,的调节失调和抗血性平衡引起的。
血液扩张过程发生在动脉和静脉循环中。然而，动脉和静脉血栓形成背后的机制是根本不同的。而动脉血栓形成，如缺血性心脏病，主要是由动脉硬化斑块在高剪切应力条件下破裂，静脉血栓主要在没有内皮损伤的情况下发展，在停滞8，9，10,9,10的情况下。深静脉血栓可能栓塞并前往肺动脉，导致肺栓塞。这可能导致慢性血管阻塞导致功能能力严重受损，可能促进胆肺疾病的发展，包括慢性血栓性肺高血压（CTEPH）11、12、13、14的发展。11,12,13,14CTEPH的特点是肺压升高，由于肺动脉阻塞的血栓物质后，至少三个月的抗凝治疗15。除了肺栓塞，假设肺内皮在CTEPH中提供了一个前血型环境，促进肺动脉的原位血栓形成和慢性阻塞in situ，导致血压升高，最终可能导致心力衰竭，如果不治疗16，17。,17
在过去的几年里，各种研究已经导致通过测量血小板功能和凝固18来检查血栓形成分析的发展。然而，他们中的大多数要么研究全血与胶原蛋白或纤维素等单细胞外基质成分的相互作用，要么研究内皮功能与单血分量的相互作用，如内皮-血小板或内皮-白细胞相互作用19、20、21、22。19,20,21,22这些测定最常见的是人体脐静脉内皮细胞（HUVEC），因为这些细胞很容易获得。然而，止血基因在血管树、血管类型和器官系统23、24,24之间以不同方式表达，利用HUVECs来表示动脉血栓形成或肺栓塞问题23的内皮细胞。
除了EC的可塑性，疾病特异性血液动力学的改变和血管形态的变化可以促进血栓形成在正常的内皮25。较高的剪切率，由于局部血管收缩或血管几何形状的变化，例如，可能会导致急性血栓的形成，导致狭窄，加速停止血液流动26。使用定制的微工程流通道可以专门设计代表（病态）生物学的血管几何形状。这样，研究局部生物力学力量对健康或患病EC27的影响是可能的。
有抗凝疗法可用于针对凝血级联的不同阶段和分子，所有这些都构成特定的风险和好处，可以特定于某些疾病。本文所述的疾病建模方法特别适用于测试各种抗凝和抗血小板疗法对血栓动力学的影响。
其目的是呈现一个包括原发性 IC 的血栓形成模型，生成一个多功能模型，根据使用的原发 CS 类型分析各种形式的血栓形成。作为一个例子，我们使用CTEPH患者的肺动脉内皮细胞与整个人体血液相互作用，其中包含血栓形成中涉及的所有成分（血小板、白细胞、红细胞、凝血蛋白和辅助因子）。这种方法可应用于商业并行流量通道或具有特定血管设计的定制微流体流通道中。因此，该模型最终可用于血栓形成和分辨率的研究，用于疾病建模中的炎症反应评估，用于抗血小板或抗凝治疗，并最终用于个性化药物。
本研究描述了原发性人类肺动脉内皮细胞的分离。对于其他原发性人类内皮细胞类型的分离，我们参考了以前发表的方法，包括肺微血管内皮细胞25、人类脐静脉内皮细胞28、血循环内皮组形成细胞图1A29。29
Protocol
这项研究得到了荷兰阿姆斯特丹VU医学中心机构医学伦理审查委员会的批准（METC VUmc，NL69167.029.19）。根据《赫尔辛基宣言》获得书面知情同意后，对人体进行原发性细胞分离和血液采集。
1. 原人类肺动脉内皮细胞的分离与培养
- 温暖完整的内皮细胞培养基（cECM）辅以5%的胎儿牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（P/S），1%内皮细胞生长补充剂（ECGS）和1%非必需氨基酸（NEAA），在37°C的水浴中。用 120°C 热消毒器或 70% 乙醇对手术剪刀、钳子和手术刀进行灭菌。在无菌条件下，在层流柜中执行 PAEC 的隔离。
- 涂上高亲和力细胞结合60毫米细胞培养皿（ 见材料表），2 mL为5μg/mL纤维素，在37°C下孵育至少15分钟。
- 从手术中获取肺动脉 （PA） 组织（例如，叶切除术或肺内皮切除术），储存在 4 °C 冷线缓冲液（4 mM 氯化钾、140 mM 氯化钠、10 mM HEPES、11 mM D-葡萄糖和 1% P/S、pH = 7.3）中，并保持冰，直到隔离。
- 组织切除后2小时内从PA中分离出内皮细胞。拿PA用钳子，并把它放在一个10厘米的培养皿用PBS洗。如果 PA 仍然是一个环，用剪刀切开肺动脉。小心不要用工具触摸容器的最内层，因为内皮很容易损坏和/或被移除。
- 从细胞培养盘中去除纤维素，加入4 mL的cECM培养基。
- 用钳子拿 PA 组织，放在介质中。同时，小心地用手术刀将容器的内层刮入介质中。通常，在容器壁上可以看到脂质堆积。尝试省略这些，因为它们会影响细胞生长。
- 保持细胞培养，直到内皮细胞的小菌落开始出现。
- 每隔一天更换一次介质。如果成纤维细胞污染培养，请按照制造商的说明，用磁性亲和细胞分离来净化其，用套件进行 CD144（参见 材料表）。使用两列方法进行初始纯化，每次连续纯化使用单列法。通常，当流式细胞仪检测到 10% 的污染细胞时≤培养素是纯的。
- 将细胞以1：3与1：4的比例分割，直到产生足够的PAC供实验使用。当 PAC 准备好使用时，请继续执行下一步。
- 纯化后，原发性内皮细胞需要针对EC特异性标记（如，VE-卡德林、CD31、TIE2）和缺乏平滑肌细胞（α-SMA）、成纤维细胞（维他命）和上皮（细胞素）标记（图1B）的特征。
2. 流室和PAEC单层的准备
注：根据假设，使用市售流室（参见材料表和图1C 选项A，协议的步骤 2.1）或定制的微流体流室（图 1C 选项 B，协议步骤 2.2）。
- 在市售微滑梯中内皮单层细胞播种
注：商用流室易于使用，在整个通道中提供层流模式，可在高剪切速率下使用。这些微滑梯旨在允许多通道并行运行，并提供准确且可重现的流量轮廓。由于它们针对倒置显微镜进行了优化，因此可以捕获高质量的荧光图像。此外，流量室的各种尺寸有不同通道尺寸或几何形状可供选择。6井流通道是此测定的首选，因为这些微滑梯具有小尺寸，并允许多分离运行。- 要覆盖 6 井流滑梯的一个通道（3.5 毫米宽度 x 0.4 毫米高度 x 17 毫米长），请使用每个通道 30 μL 的 0.1% 明胶，并在 37 °C 下孵育至少 15 分钟。
- 要播种一个通道，试穿 10 厘米2 的汇合 PAC，并在室温 （RT） 下以 300 x g 旋转 7 分钟。
- 将 PAEC 悬浮在 600 μL 的 cECM 和移液器 100 μL （1.5 cm2） 的细胞悬浮液中。这通过毛细管作用覆盖微滑梯。如果速度太慢，就会形成气泡。在移液时使用多一点力，避免气泡的形成。
注：细胞密度影响内皮表型。每个通道共有 1.5 厘米2 的汇合细胞过余，因为通道的表面面积为 0.6 cm2。在开始实验之前，在通道内再培养这些细胞6天，直到它们达到最大汇合。 - 在通道中添加额外的 50 μL cECM，为在 37 °C、5% CO2下过夜孵育提供足够的介质。第二天更换介质以洗去未绑定的细胞。
- 在37°C下保持细胞培养6天，CO2 为5%，使PAEC形成一个坚定的、汇合的单层。每隔一天使用 150 μL 的 cECM 更换介质。
- 在第7天，在ECM中用100μL的1μM组胺和1%的FBS在检测前30分钟使用100μL的1 μL组胺和1%FBS进行治疗。刺激可以选择 广告。例如，TNF-α通常用作炎症激活剂。
- 定制微流体流室的制备
注：定制流室可根据用户需求进行调整，因为尺寸和几何形状可以很容易地更改为首选项。例如，为了模仿生理上更相关的血管，可以引入狭窄（图1D）。这种方法允许在微血管疾病中使用非常小的血液量。- 使用图案晶圆的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 的软光刻
- 将 PDMS 固化剂和预聚合物以 1：10 的比例在微平衡上混合，与通用实验室混合器彻底混合。
- 要去除产生的气泡，请将 PDMS 在干燥器中脱气约 1 小时。
- 用铝箔将玻璃培养皿排成一行，并加入几滴水，然后再将晶圆放入内衬的培养皿中。晶圆用作定制通道的模具。
注：晶圆或模具由洁净室设施提供。负光回印器在晶圆上进行图案化，以创建具有以下典型尺寸的突出通道特征：300 μm 宽度 x 270 μm 高度 x 14 mm 长度。 - 将脱气的 PDMS 倒入放入玻璃培养皿中的晶圆上。
- PDMS 将 PDMS 倒入干燥器中的晶圆上再浇注 15 分钟，以清除铸造过程中可能形成的任何气泡。
- 从干燥器中取出含有模具和 PDMS 的培养皿，并将其放入 60°C 烤箱中至少 4 小时，以将 PDMS 交线。
- 准备交链接的 PDMS，用于粘合玻璃幻灯片
- 从烤箱中取出模具和交链接的 PDMS，并移动到交叉流罩中，以无尘处理 PDMS。
- 使用手术刀从模具底部取出任何 PDMS，然后从模具中取出交链接 PDMS 的顶板。
- 用胶带将外露的图案 PDMS 板线，以防止灰尘颗粒与 PDMS 通道接触。
- 使用活检冲孔将 PDMS 芯片切割到大小，并冲孔 1 mm 直径的入口和插座。
- PDMS微流体通道和玻璃滑梯的灭菌和粘合
- 用乙醇彻底冲洗，然后冲洗异丙醇，清洁玻璃显微镜滑梯。每次冲洗后，用氮气枪彻底擦干滑梯。
注：或者，如果使用共和显微镜进行分析，可以使用盖滑。 - 打开等离子室，无需保护胶带即可加载清洁的显微镜幻灯片和微流体芯片。
- 关闭腔室，用氮气清洗 1 分钟，用过滤的空气填充腔室，直到达到 500 mTorr 的压力。
- 使用 50 W 的功率和 5 kHz 的频率将玻璃滑梯和 PDMS 芯片暴露在等离子体中 40 s。
- 接触等离子体后，立即粘合玻璃滑梯和微流体芯片。将设备存放在无菌培养皿中。
- 用乙醇彻底冲洗，然后冲洗异丙醇，清洁玻璃显微镜滑梯。每次冲洗后，用氮气枪彻底擦干滑梯。
- 使用图案晶圆的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 的软光刻
- 微流体通道内皮单层细胞播种
- 通过移液 10 μL 0.1 mg/mL 胶原蛋白 I 型或每通道 0.1% 明胶，在 37 °C 下孵育 30 分钟，将定制微通道涂覆。
- 要播种四个微通道，尝试 25 厘米2 的汇合 PAC，并在 RT 以 300 x g 旋转 7 分钟。
注：只有一小部分细胞会粘附在表面。因此，有必要使用多余的细胞来实现汇合单层。 - 将PAEC悬浮在20μL的cECM中，并在每个通道上使用5μL的细胞悬浮液。由于通道尺寸小，毛细管力将填充微滑梯并防止气泡的形成。
- 3~4小时后更换介质以清洗未绑定的细胞。
- 保持培养细胞6天，使PAEC形成一个坚定的，汇合的单层。由于体积小，每天用150μL的cECM更换介质。将移液器尖端在入口中装满介质，并在出口中放入空尖端。这将作为一个水库，为细胞提供足够的营养和生长因子，并防止幻灯片干涸。
- 在第7天，用 Hoechst（1：5，000 在 cECM 中）染色活细胞中的核，并在 37 °C 和 5% CO2下孵育最多 10 分钟。
- 用 cECM 小心清洗 3x，并在检测前 30 分钟在 ECM = 1% FBS 中用 1 μM 组胺进行治疗。刺激可以选择 广告。例如，TNF-α通常用作炎症激活剂。
- 使用直径 1.27 mm 的 90° 角不锈钢连接器将 PDMS 芯片的插座连接到油管。
3. 人类全血的准备
- 从0.109 M柠檬酸钠抗凝剂中从受试者中抽出静脉血。这可能来自未接受抗凝治疗的健康或患病患者。轻轻反转管子以混合。实验所需的血液总量主要取决于所选的流速。流量为 25 mL/h，在 ibidi 6 井滑梯中，总体积为 2 mL，加满浴缸和流通道就足够了。
- 将血液转移到50 mL管中，将钙蛋白 AM （1：10，000） 添加到荧光标记血细胞和 Alexa488-纤维蛋白原 （15 μg/mL） 以结合自体纤维蛋白原。让血液在37°C下孵育15分钟，以完全吸收。
- 在实验开始前立即用重新计算缓冲液（154 mM氯化钠、10.8 mM三钠柠檬酸、2.5 mM氯化钙和2 mM氯化镁）稀释血液1：1。
注：最大为50%的血融，不会影响凝固反应时间30。此外，人类血液可以包含病毒和其他制剂。因此，使用血液样本有感染的风险。强烈建议使用适当的安全措施并小心处理材料。
4. 组装流量系统
- 在连接管材之前，使用充满洗涤液液（36 mM 柠檬酸、103 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、5 mM EDTA 和 0.35% wt/vol 牛血清白蛋白 [BSA]，pH = 6.5）的注射器冲洗流管，以防止管中的血液凝固。
- 使用新的注射器用 HEPES 缓冲液（132 mM 氯化钠、20 mM HEPES、6 mM 氯化钾、1 mM 氯化镁、1% BSA 和 5.5 mM D-葡萄糖，pH = 7.4）填充流量管，并小心地将其与在介质中填充 EC 的微滑梯连接。将接头连接到微通道时，尽量防止在滑道中形成任何气泡。气泡会损害内皮，影响实验结果。完全去除洗涤缓冲液，不要让缓冲液与细胞接触，因为这将抑制凝固。
- 设置流系统，如图 1E 所示。在 20 mL 注射器中加入 2 mL 的洗涤缓冲液，并在血液进入注射器时冲洗以防止凝固。将空注射器插入注射器泵中，并将出口管与母 Luer 连接器连接到此注射器。将进气管放入含有准备好的人类血液的容器中。
- 打开注射器泵并计算流量。流轮廓在高度上遵循抛物线图案。假设血液作为牛顿流体，使用以下公式计算流速。
（方程式 1）
在哪里
• 剪切应力
η = 动态粘度
Q = 体积流速
h = 通道高度
w = 通道宽度
注：对于具有长方形尺寸、0.4 毫米高、宽度为 3.5 毫米的商用 6 通道微滑梯中带血的肺动脉流，使用 25 mL/h 的体积流速 5 分钟。由于定制流量通道的尺寸不同，这些动态也将发生变化。调整变量以确保剪切应力相等。 - 将 20 mL 注射器的直径定义为 19.05 mm，并设置程序为 "退出"。通过施加负压将血液通过细胞涂层通道，将保证恒定的剪切速率和最小的细胞层损伤。
（方程式 1）
5. 设置显微镜进行图像采集
- 使用 20 倍的镜面，将微滑梯放在倒相对比度荧光显微镜的舞台上。启动显微镜软件，在 Z 方向上移动舞台，以聚焦在细胞单层上。
- 在每个流通道的开始、中间和结束中选择一个感兴趣区域 （ROI）。起点和终点应至少离通道的入口和出口 3 mm 远。设置蓝色、绿色和红色荧光滤光片，具有激光功率和光强，显示最少的背景。
6. 全血灌注在PAECs上
- 在像图 1E 所示连接所有内容 并准备好录制显微镜后，按下 "开始 "以录制视频。 在 注射器泵上启动，将血液注入内皮上。
- 一旦血液开始流过内皮，获取图像与预先选择的活性通道和 ROI 位置每 15 秒 5 分钟。
- 灌注5分钟后，完成记录并停止注射器泵。拆解流管，小心地拆下油管。通常，如果用力太大，就会形成气泡。尝试防止这种情况，因为这会冲走内皮。
7. 固定和后分析
注：为了排除由于灌注实验造成的内皮损伤导致的假阳性血小板附着力，有必要对内皮细胞的间隙形成和单层进行表征。这可以通过定期免疫荧光染色的 VE-卡德林。
- 灌注和拆卸管材后，用 HEPES 清洗微流体通道。滴管 HEPES 进入通道，以便它将血液推入出水口。用另一个移液器去除多余的。
- 可选地，用PBS+（0.5 mM氯化镁和0.9m氯化钙）清洗通道，以防止蛋白质上清液沉淀。++这减少了背景。然而，额外的洗涤步骤可以改变细胞行为和形态，可能会影响分析后成像。
- 取出 HEPES，用粘附的血小板固定内皮，通过移液 37 °C 将 4% 半甲醛 （PFA） 加热到通道中并孵育 15 分钟。用粘附的血小板和沉积纤维蛋白。
注：在固定定制微流体时要格外小心，因为这些通道甚至更小，这会导致每个处理步骤中通道的剪切力更高。 - 从通道上拆下 PFA，用 PBS 清洗 3x。微滑梯现在已准备好使用标准染色协议来描述内皮细胞标记，如 VE-卡德林、CD31、P-选择或集成蛋白、粘附血小板的CD42b或白细胞的CD45。
- 染色后，用常规共体显微镜拍摄至少五张图像，以描述结肠化特征。
8. 图像分析
- 在 ImageJ 中打开包含荧光标记血小板或荧光纤维蛋白的流量测定图像。将选择的图像拖动到 ImageJ。
- 图像以 RGB 颜色拍摄。为了进行分析，首选 8 位图像，因此请将图像转换为 8 位： 图像 | 类型 | 8 位。
- 为了最小化背景，请用滑动抛物线减去，其中滚球局部计算并减去原始图像的背景像素： 过程 | 减去背景 | 滚球半径 = 50 像素 | 滑动抛物线。
注：图像大小以像素为单位定义。但是，要测量面积，必须设置比例。当以 20 倍目标拍摄图像时，数字孔径为 0.45 时，显微镜的刻度为每 μm 2 像素。大多数时候，设置比例的必要信息存储在图像的元数据中，并可由 ImageJ 自动使用： 分析 | 设置比例。 - 设置阈值以定义粘附血小板或沉积纤维蛋白。使用三角形方法，阈值将自动调整： 图像 | 调整 | 阈值。
- 使用"分析粒子"命令分析血小板或纤维 素覆盖 的区域。将大小设置为 2 无限，因为血小板的最小尺寸为 2 μm： 分析 | 分析粒子。
- 结果将提供总面积在μm2，与平均大小的聚合在μm2 和覆盖面积的百分比。
Representative Results
代表性的结果可分为三个部分，每个部分分别代表实验设置、数据收集和数据分析的各个步骤。根据研究问题，可以更改每个步骤的参数。数据用于研究内皮对血栓形成的影响。
实验设置
众所周知，内皮细胞在结构和功能上具有高度异质性，取决于在健康和疾病期间的位置和时间。各种内皮细胞来源可用于研究内皮-血液相互作用，在这种情况下，内皮细胞和PAECs是市售的（图1A）。HUVECs 是实验室模型中最常用的，而 PAECs 是来自肺动脉的患者衍生的分离细胞。此外，还有成熟的方案可用于将微血管内皮细胞（MVEC）与肺循环或血液循环内皮组形成细胞（ECFC）25、28、2925,28,分离。
分离后，内皮细胞的特点是 VE-卡德林、CD31和 TIE2 染色，以确认内皮表型。μSMA 和细胞蛋白的存在特征表明不存在成纤维细胞或上皮类表型（图 1B）。在获得高度纯化的ECs群体后，使用3~5个细胞来播种商业微滑梯或定制的微流体流通道（图1C）。虽然市售微滑道主要是平行流室，或Y形通道，在高度或分叉角度上具有明确定义的参数，但使用微流体滑道使实验参数能够适应体内血管几何和血流动力学31。然而，定制的微流体大小较小，往往限制细胞扩散，诱导更多的细胞死亡32，33。32,使用多余的细胞可以补偿只有一小部分细胞会粘附的事实。当引入狭窄时，观察到这一点，其中内皮细胞显示比平行微流体通道（图1D）更拉长的表型。商业流室的表面面积更大，细胞可以绑定到。这需要更少的单元格数来播种。
为了研究内皮细胞-血液相互作用，整个血液被注入内皮单层。在实验当天和灌注重新计算之前，就采集了滴血。细胞在灌注前30分钟用组胺刺激诱导VF释放和血小板粘附（图1E）34，35。34,35Figure 1E由于体积小，定制的微流体通道允许使用较小的血液量。
数据采集
为了研究PAECs上的血栓形成，在2.5戴恩/厘米2（图2A+C）中，钙蛋白AM-红色荧光标记血细胞和Alexa488结合纤维蛋白被注入5分钟。粘附血细胞和沉积纤维蛋白被量化。图像每 30 s 获取一次，并用 ImageJ 进行量化。必须减去背景，以消除非粘合血小板的自荧光。阈值的三角形算法已用于定义最小背景。它允许测量小血小板聚合体（图2D）。
预期，在未刺激的条件下，血小板和纤维蛋白没有与内皮结合。为了促进 VWF 释放和血小板结合，PAECs 受到组胺的刺激，导致血小板附着力在 2.5 分钟后立即达到高原。此时，血小板开始分泌导致血小板聚集和纤维蛋白原裂变成纤维蛋白的自理因子。纤维蛋白在3分钟后沉积，4分钟后形成血小板稳定聚集体（图2E）。
为了调查这种效应是否可以通过直接口服抗凝剂（DOAC）抑制，血液被10nM达比加特兰治疗。Dabigatran 被添加到血液稀释中，在凝血途径中抑制因子 IIa，并防止纤维蛋白原的裂解形成纤维蛋白纤维。当达比加特兰治疗的血液被刺激的PAECs中注入时，凝块的形成可以通过延迟纤维蛋白沉积直接抑制（图2F）。
数据分析
为了研究各种内皮源对血栓形成的影响，分析了5分钟血液灌注的细胞变化。内皮被固定，粘附血小板在共声显微镜下成像前用CD42b标记。这为血小板和纤维蛋白的凝固提供了详细的分析，这可能表明血液中的凝血因子功能失调。EC对凝块形成的影响由标准免疫荧光染色决定。内皮细胞接触得到维持，VE-卡德林染色证实，表明血块形成于内皮单层顶部，而不是在内皮间隙之间的基础基质上（图3）。此外，使用不同的细胞源导致内皮形成不同的血栓形成模式。HUVECs是静脉内皮细胞，与健康的PAEC相比，CTEPH患者的病原PAEC具有有限的血小板粘附和纤维素沉积。这表明，CTEPH患者的内皮表现出更高的反应性血管活化，导致血栓形成增加。
图 1：协议的原理图概述。 （A） 分离和培养各种来源和不同类型的内皮细胞，用于微流体流通道的灌注实验。具有不同类型内皮细胞的亮场图像。比例杆 = 50 μm. （B） 分离细胞的特点是免疫荧光染色，以确认内皮表型。比例杆 = 50 μm. （C） 细胞可以在商业流滑或定制微流体通道中播种。（D） 代表 HUVEC 的亮场图像生长在不同的通道几何形状中。比例杆 = 50 μm. （E） 血液灌注实验的实验设置.采集滴血，用盐水缓冲液稀释，用注射器泵在内皮细胞上吸血。这个数字中的肺和脐静脉由 Servier 医学艺术公司修改，根据创意共同归因 3.0 通用许可证获得许可。http://smart.servier.com/ 请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2：血栓形成的图像采集和定量。 （A） 连续的钙素 AM-Red 标记血小板的具有代表性的延时成像，并在全血灌注后 1、3 和 5 分钟内将 Alexa488-结合纤维蛋白沉积在 1、3 和 5 分钟，超过未刺激的PAECs （B）和超过组胺刺激 PAECs。（C） 血小板附着力和纤维素沉积在灌注1、3和5分钟的代表性延时图像，全血在组胺刺激的PAECs上孵育与达比加特兰。比例线 = 50 μm. （D） 图像 J 中图像量化的示意图概述。（E） 每30 s对未刺激的血小板粘附和纤维蛋白沉积进行定量，组胺刺激内皮。（F） 通过血小板附着力和纤维素沉积量化的达比加特兰对血栓形成的影响的定量。数据表示为 SD ± n = 3 的均值。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：流动实验的代表性共生图像，以表征血小板附着力和内皮细胞纤维素沉积的血栓形成特征。 内皮细胞接触以VE-cadherin为特征，在控制PAECs、患者衍生的CTEPHPAECs和HUVEC中测量。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
凝固是内皮和血液成分之间复杂和时间控制相互作用的结果。 这种体外 测定提出了一种实时研究内皮细胞血栓形成特性的方法。可以使用各种类型的原发性人类内皮细胞， 促进器官 和患者特定方式的原位血栓形成。在这项研究中，我们说明了本协议的使用，比较了从健康捐赠者分离的PAECs与CTEPH患者的血栓生成特性。活血栓的形成通过健康受试者对组胺激活内皮的全血灌注进行了研究，而 DOAC 的效果则被测试为抗血栓剂。
除了使用市售的微通道外，如代表性结果所示，定制微流体通道的引入使研究血管几何变化对血栓形成的影响。例如，在分支点处流量减少或狭窄会导致剪切应力增加和更多的血小板激活36。然而，这些定制的微流体通道的一个显著限制是要求高细胞数形成一个稳定的单层ECs，如步骤2.3.2所述。当患者衍生细胞稀缺时，这可能成为一个限制因素。市售微滑梯的优点是，为细胞培养和生长区域修改表面积，从而使电子资源形成一个汇合和稳定的单层。另一方面，更大的表面积将导致更大的流明。根据 公式1，这需要更高的血液量达到类似的流速，在定制的微流体。
此协议的改进可能是调查实时 EC 丢失或屏障完整性的变化。本协议中的EC损伤仅在实验结束时进行测量。对于实时跟踪，可以使用 mCherry VE 卡德林标记 2S，例如37。然而，由于这将需要一个高度优化的协议与有效的病毒转染，电细胞基板阻抗感电（ECIS）可以作为一种替代研究内皮完整性和阻隔功能38。通过特殊的 ECIS 流量通道进行灌注，可以纵向监控流中的内皮屏障完整性。这些特定的 ECIS 功能允许平行测量内皮屏障特性和血栓形成。并行 EC 阻隔测量的替代方法，特别是在定制阵列中，包括在香水中使用荧光德克斯特，根据 EC 阻隔特性，从流明中扩散出来。
所述协议的一个限制是，2C从人体中去除，并在组织培养塑料上培养，这是一种僵硬的人造基质。细胞适应其生物物理环境。这可能会影响血小板激活的内皮反应，因为血小板活化和壁面刚度39之间有关联。尽管这些适应培养塑料，细胞保持疾病特异性特征，可以直接比较从健康捐赠者派生的EC，如与控制，CTEPH-PAEC和HUVEC，产生不同的模式血小板粘附和纤维素沉积后，5分钟的血液灌注。
与其他协议相比，该系统使用全血，而其他系统则研究EC与单一血液成分（如血小板和,白细胞19、20、21）19,20的相互作用。已经开发出更先进的微流体模型，允许研究血管模型中的内皮功能与圆形容器几何和软细胞外基质。但是，这些是使用 HUVEC,40,、41、42 进行优化的。所述协议的新颖性是使用原发性 PC 与全血结合，使原位血栓形成模型更接近体内条件。优化了患者衍生的ECs和患者衍生血液的使用方案，进一步优化了体外疾病模型，从而可以评估个性化的血栓形成和药物治疗。
所述方案可用于研究抗凝疗法对患者衍生细胞的影响。虽然我们使用达比加特兰来抑制血栓的形成，但有可能使用其他抗凝剂，如利瓦罗沙班，它直接抑制凝血级联中的因子Xa。直接血小板抑制剂，如氯皮多格雷或阿司匹林，也可以研究，因为这些作用于血小板与ECs结合的血小板的初级阶段。最终，患者特异性ECs与患者自身血液相互作用的血栓生成能力可用于预测抗凝治疗对单个患者的个人影响。此外，分解特定蛋白质可以提供额外的功能信息。
描述的协议中有些步骤对于成功的灌注实验至关重要。首先，在原细胞分离过程中，需要获得高度纯正的EC培养。其次，2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、如果不是这样，剪切应力的轻微变化可能会导致内皮损伤和凝固级联的激活，或血小板可以开始与地下室膜结合，这将提供误报结果。第三，防止气泡至关重要，因为气泡会损害内皮，从而影响结果。
用氯化钙和氯化镁重新计算血液后，立即开始灌注实验。重新计算诱导血小板活化和血栓形成快速反应，导致样品中快速凝固。
最后，我们描述了一个高度通用的协议，用于研究血栓形成期间整个血内皮细胞相互作用。
Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢来自荷兰阿姆斯特丹UMC、学术医学中心的血浆蛋白系、桑金研究和兰德施泰纳实验室的Jan Voorberg，他在这份手稿中的投入。这项工作得到了荷兰心血管联盟（DCVA）[2012-08，2014-11]奖授予费德拉和重新连接财团以及2018年动力赠款授予费德拉影响财团的支持。这些赠款包括荷兰心脏基金会、荷兰大学医学中心联合会、荷兰卫生研究与发展组织和荷兰皇家科学院的集体资助。此外，这项工作由欧洲研究理事会资助，由高级赠款"VESCEL"计划（赠款编号：669768）。XDM由荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心心血管研究所（ICaR-VU）的研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL syringe | BD | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 100244 | |
| Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 2478269 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 106448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
References
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