Summary
Vi præsenterer en in vitro vaskulær sygdom model til at undersøge fuldblods interaktioner med patient-afledt endotel. Dette system gør det muligt at studere trombogen egenskaber af primære endotelceller under forskellige omstændigheder. Metoden er specielt velegnet til at evaluere in situ trombogenicity og antikoagulationsbehandling under forskellige faser af koagulation.
Abstract
Dannelsen af blodpropper indebærer komplekse interaktioner mellem endotelceller, deres underliggende matrix, forskellige blodlegemer, og proteiner. Endotelet er den primære kilde til mange af de store hæmostatiske molekyler, der styrer blodpladesammenlægning, koagulation og fibrinolyse. Selv om mekanismen for trombose er blevet undersøgt i årtier, in vitro undersøgelser primært fokusere på situationer med vaskulære skader, hvor subendotel matrix bliver udsat, eller på interaktioner mellem celler med enkelt blodkomponenter. Vores metode gør det muligt at studere interaktioner mellem fuldblod og en intakt, sammenløbet vaskulære celle netværk.
Ved at udnytte primære humane endotelceller, denne protokol giver en enestående mulighed for at studere indflydelsen af endotelceller på trombe dynamik og giver værdifuld indsigt i patofysiologi af trombotisk sygdom. Brugen af skræddersyede mikrofluidiske flowkanaler gør det muligt at anvende sygdomsspecifikke vaskulære geometrier og modelspecifikke morfologiske vaskulære ændringer. Udviklingen af en trombe registreres i realtid og kvantitativt karakteriseret ved trombocyt vedhæftning og fibrin deposition. Effekten af endotelfunktionen i ændret trombedynamik bestemmes ved postanalyse gennem immunfluorescensfarvning af specifikke molekyler.
De repræsentative resultater beskriver den eksperimentelle opsætning, dataindsamling og dataanalyse. Afhængigt af forskningsspørgsmål, parametre for hver sektion kan justeres, herunder celletype, forskydning satser, kanal geometri, medicinsk behandling, og postanalyse procedurer. Protokollen valideres ved at kvantificere trombedannelse på lungearterien endotel af patienter med kronisk tromboembolisk sygdom.
Introduction
Endotel danner det indre cellulære lag af blodkar og adskiller blod fra det omgivende væv. Det er blevet beskrevet som et dynamisk organ, der aktivt regulerer sin mikro-miljø og reagerer på eksterne stimuli1. På grund af sin direkte kontakt med strømmende blod, endotel er afgørende i kontrollen af hæmostase og trombose og er den primære kilde til mange af de store regulerende molekyler, der styrer blodplade sammenlægning, koagulation, og fibrinolyse2. Sunde, ikke-aktive endotelceller (EF) producerer flere molekyler, der modvirker kopladeaktivering og forhindrer koagulation og trombedannelse for at opretholde blodgennemstrømningen, såsom prostacyclin, trombomodulin eller vævsfaktorvejshæmmer (TFPI)2,3. Dette forhindrer vedhæftning af blodplader, blodpladesammenlægning, og trombe dannelse. Beskadigelse eller aktivering af karvæggen resulterer i en prokoagulerende endotelfænotype, der initierer lokaliseret trombocyt vedhæftning ogblodpropformation 2,4. Ved endotelaktivering klæber blodplader til von Willebrand Factor (VWF), et multimerisk protein, der frigives fra EC'er, eller til udsatte bindingssteder i den underliggende subendotelmatrix. Efterfølgende initieres molekylære ændringer i blodplader og eksponering for vævsfaktor (TF) aktiveringen af koagulationssystemet, hvilket fremkalder trombedannelse ved fibrinpolymerisering5,6. Tilsammen danner den resulterende blodprop grundlag for sårlukning ved re-endoalisering7. Forstyrrelser af koagulationssystemet kan resultere i blødningsforstyrrelser, såsom von Willebrand sygdom, hæmofili, eller trombose, der ofte skyldes en dysregulated pro- og antithrombotisk balance af endotel hæmostatisk vej2,3.
Processen med hæmostase forekommer i både arteriel og venøs cirkulation. Men de mekanismer, der ligger til grund for arteriel og venøs trombose er fundamentalt forskellige. Mens arteriel trombose, som det ses i iskæmisk hjertesygdom, er for det meste drevet af brud på en aterosklerotisk plaque under forhold med høj forskydning stress, venøs trombose meste udvikler sig i mangel af endotel skade i en tilstand af stasis8,9,10. En dyb vene trombe kan embolisere og rejse mod lungearterier, hvor det forårsager en lungeemboli. Dette kan resultere i kroniske vaskulære forhindringer, der fører til signifikant nedsat funktionel kapacitet, der kan fremme udviklingen af chonic lungesygdomme, herunder udvikling af kronisk tromboembolisk pulmonal hypertension (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH er karakteriseret ved forhøjet lungetryk på grund af obstruktioner af lungearterierne ved tromboembolisk materiale efter mindst tre måneders antikoagulationsbehandling15. Ud over lunge emboli, Er det postuleret, at lungeendotel giver en prothrombotic miljø i CTEPH, der letter in situ trombose og kroniske forhindringer af lungearterierne, forårsager stigningen i blodtrykket, der i sidste ende kan resultere i hjertesvigt, hvis ubehandlet16,17.
I løbet af de seneste år har forskellige undersøgelser ført til udvikling af analyser for at undersøge trombedannelse ved at måle blodpladefunktion og koagulation18. Men de fleste af dem enten studere samspillet mellem fuldblod med enkelt ekstracellulære matrix komponenter som kollagner eller fibriner, eller endotelfunktion i samspil med enkelt blodkomponenter, såsom endotel-blodplader eller endotel-leukocyt interaktion19,20,21,22. Disse analyser er mest almindeligt udført med menneskelige navlestrengsceller endotelceller (HUVEC), da disse celler er let opnås. Men, hæmostatiske gener er differentieret udtrykt på tværs af vaskulære træ, fartøjstyper, og organsystemer23,24, som gør brugen af HUVECs til at repræsentere endotelceller involveret i arteriel trombose eller lungeemboli problematisk23.
Ud over EF-plastitet kan sygdomsspecifikke hæmodynamiske ændringer og ændringer i vaskulær morfologi fremme trombedannelse ved den normale endotel25. Højere forskydningshastigheder, på grund af lokal vasokonstriktion eller ændringer i kargeometri, for eksempel, kan resultere i akut trombedannelse, hvilket forårsager en stenose, der fremskynder ophør af blodgennemstrømningen26. Brugen af skræddersyede mikroengineered flow kanaler gør det muligt specifikt at designe vaskulære geometrier, der er repræsentative for (pato)biologi. På denne måde er det muligt at undersøge virkningen af lokale biomekaniske kræfter på sunde eller syge EF27.
Der er antikoagulation behandlinger til rådighed for målretning forskellige faser og molekyler i koagulation kaskade, som alle udgør særlige risici og fordele, der kan være specifikke for visse lidelser. Tilgangen af sygdom modellering beskrevet i dette papir er specielt velegnet til at teste virkningerne af forskellige antikoagulation og antiplatelet behandlinger på trombe dynamik.
Målet er at præsentere en model af trombose, der omfatter primære EC'er, hvilket giver en alsidig model egnet til analyse af forskellige former for trombose afhængigt af typen af primære EC anvendes. Som illustration brugte vi lungepulsåre endotelceller fra CTEPH-patienter i samspil med fuldblod, der indeholdt alle komponenter, der var involveret i trombedannelse (blodplader, leukocytter, erythrocytter, koagulationsproteiner og cofaktorer). Denne fremgangsmåde kan anvendes i kommercielle parallelle flowkanaler eller i skræddersyede mikrofluidiske flowkanaler med et specifikt vaskulært design. Som sådan, modellen kan i sidste ende anvendes i studiet af trombe dannelse og opløsning, til vurdering af inflammatoriske reaktioner i sygdom modellering, for antiplatelet eller antikoagulation terapi, og i sidste ende for personlig medicin.
Denne undersøgelse beskriver isolering af primære humane lungepulsåren endotelceller. Til isolering af andre primære humane endotelcelletyper henviser vi til tidligere offentliggjorte metoder, herunder lungemikrovaskulære endotelceller25, humane navlestrengens endotelceller28og blodcirkulationende endotelkoloni, der danner celler Figur 1A29.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle Medical Ethical Review Board under VU Medical Center Amsterdam, Holland (METC VUmc, NL69167.029.19). Primær celleisolering og blodtapning af forsøgspersoner blev udført efter skriftligt informeret samtykke blev indhentet i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen.
1. Isolation og kultur af primære humane lungearteriale endotelceller (PAEC)
- Varm komplet endotelcellemedium (cECM) suppleret med 5% føtalt kvægserum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S), 1% endotelcellevækst kosttilskud (EGS) og 1% nonessential aminosyrer (NEAA), i et vandbad ved 37 °C. Steriliser kirurgisk saks, stænde og en skalpel med enten en 120 °C varmesili sterilisator eller 70% ethanol. Udfør isoleringen af PAEC i et laminar flowkabinet under sterile forhold.
- Der anbringes en høj affinitetscelle, der binder 60 mm cellekulturskål (se Materialetabel)med 2 ml 5 μg/ml fibronectin, og inkuberes ved 37 °C i mindst 15 min.
- Der opnås lungepulsåren (PA) væv fra kirurgi (f.eks., lobektomi eller lungeendearterektomi), opbevares i 4 °C koldklinkbuffer (4 mM kaliumchlorid, 140 mM natriumchlorid, 10 mM HEPES, 11 mM D-glucose og 1% P/S, pH = 7,3), og opbevares på is indtil isolation.
- Isoler endotelceller fra PA inden for 2 timer efter fjernelse af væv. Tag PA med scer og læg den i en 10 cm petriskål til at vaske med PBS. Hvis PA er stadig en ring, skære lungepulsåren åben med en saks. Vær meget omhyggelig med ikke at røre ved fartøjets inderste lag med værktøjet, da endotel let kan beskadiges og/eller fjernes.
- Fjern fibronectin fra cellekulturskålen og tilsæt 4 ml cECM-medium.
- Tag PA væv med stænt og læg det i mediet. I mellemtiden omhyggeligt skrabe det indre lag af fartøjet i mediet med en skalpel. Ofte, lipid ophobninger kan ses i karvæggen. Prøv at udelade disse, da de vil påvirke celle udvækst.
- Hold cellerne i kultur, indtil små kolonier af endotelceller begynder at dukke op.
- Udskift mediet hver anden dag. Hvis fibroblaster forurener kulturen, renses den med magnetisk affinitetscelleadskillelse for CD144 med et sæt i overensstemmelse med producentens anvisninger (se Tabel over Materialer). Brug metoden med to kolonner til den første rensning og metoden med en kolonne for hver efterfølgende rensning. Generelt defineres en kultur ren, når flowcytometri detekterer ≤10% forurenende celler.
- Opdelte celler i forhold på 1:3 til 1:4, indtil der dyrkes tilstrækkelige PAECs til eksperimentel brug. Når PAECs er klar til brug, skal du fortsætte med næste trin.
- Efter rensningen skal primære endotelceller karakteriseres for tilstedeværelsen af EF-specifikke markører(f.eks.VE-cadherin, CD31, TIE2) og for fravær af glatte muskelceller (α-SMA), fibroblast (vimentin) og epitelmarkører (figur1B).
2. Forberedelse af flowkamre og PAEC-monolag
BEMÆRK: Afhængigt af hypotesen skal du enten bruge de kommercielt tilgængelige strømningskamre (se Materialetabel og Figur 1C Mulighed A,trin 2.1 i protokollen) eller et specialfremstillet mikrofluidisk strømningskammer (Figur 1C Mulighed B, trin 2.2 i protokollen).
- Cellesåning af endotelmonsmer i kommercielt tilgængelige mikroskredser
BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige flowkamre er nemme at bruge og giver et laminar flowmønster i hele kanalen, der kan bruges ved høje forskydningshastigheder. Disse mikroskredse er designet til at tillade multikanal parallelle kørsler og giver en nøjagtig og reproducerbar flow profil. Fordi de er optimeret til omvendt mikroskopi, er det muligt at fange lysstofrør af høj kvalitet. Desuden er forskellige dimensioner af flow kamre fås i forskellige kanal størrelser eller geometrier. De 6-brønd flow kanaler foretrækkes for denne analyse, fordi disse microslides har små dimensioner og tillade multiparallel kører.- Til at belægge en kanal med en 6-brønd flowslide (3,5 mm bredde x 0,4 mm højde x 17 mm længde) skal der anvendes 30 μL gelatine pr. kanal og inkuberes ved 37 °C i mindst 15 min.
- At frø en kanal, trypsinize 10 cm2 af sammenløbet PAECs og drej ned ved 300 x g i 7 min ved stuetemperatur (RT).
- PaeCs suspenderes i 600 μL cECM og pipette 100 μL (1,5 cm2) celleaffjedring i én kanal. Dette dækker mikroslide gennem kapillær handling. Hvis det går for langsomt, vil luftbobler dannes. Undgå dannelsen af luftbobler ved hjælp af en lille smule mere kraft, når pipettering.
BEMÆRK: Celletætheden påvirker endotelfenfonotype. I alt 1,5 cm2 sammenløbsceller pr. kanal er overanfald, fordi kanalen har et overfladeareal på 0,6 cm2. Før du starter eksperimentet, skal disse celler dyrkes i yderligere 6 dage inden for kanalerne, indtil de når maksimal sammenløbet. - Der tilsættes yderligere 50 μL cECM til kanalen for at give tilstrækkeligt medium til inkubation natten over ved 37 °C, 5 % CO2. Skift mediet næste dag for at vaske ubundne celler væk.
- Cellerne opbevares i kultur i 6 dage ved 37 °C, 5% CO2, så PAEC'en kan danne et fast, sammenløbet monolag. Skift mediet hver anden dag med 150 μL cECM.
- På dag 7 behandles PAEC med 100 μL 1 μM histamin i ECM og 1% FBS uden andre tilsætningsstoffer i 30 min før analysen. Stimulus kan vælges ad libitum. For eksempel, TNF-α er blevet almindeligt anvendt som en inflammatorisk aktivator.
- Forberedelse af specialfremstillede mikrofluidiske flowkamre
BEMÆRK: Specialfremstillede flowkamre er tilpasset brugerens behov, fordi dimensionerne og geometrierne let kan ændres til præference. For eksempel, at efterligne en mere fysiologisk relevant fartøj, en stenose kan indføres (Figur 1D). Denne fremgangsmåde gør det muligt at bruge meget små blodmængder som det ses i mikrovaskulær sygdom.- Blød litografi af polydimethylsiloxan (PDMS) ved hjælp af mønstrede wafere
- Kombiner PDMS hærdningsmiddel og prepolymer på en microbalance på en 1:10 forholdet og grundigt blandes med en generel formål lab mixer.
- For at fjerne de resulterende luftbobler skal DU afgas PDMS'en i en ekssiccator i ca. 1 time.
- Line et glas petriskål med aluminiumsfolie og tilsæt et par dråber vand, før du placerer wafer i foret Petriskål. Waferen fungerer som formen for den skræddersyede kanal.
BEMÆRK: Wafere eller forme leveres af renrumsfaciliteterne. Negativ fotoresist er mønstret på wafere for at skabe fremspringende kanallignende funktioner med følgende typiske dimensioner: 300 μm bredde x 270 μm højde x 14 mm længde. - Hæld degasserede PDMS på wafer placeret i et glas Petriskål.
- Degas PDMS hældes på wafer i en ekssiccator i yderligere 15 min at fjerne eventuelle bobler, der måtte have dannet under støbning.
- Petriskålen, der indeholder formen og PDMS, fjernes fra ekssiccatoren, og den i en 60 °C ovn i mindst 4 timer for at krydsforkoere PDMS'en.
- Forberedelse af tværbundet PDMS til limning til glasdias
- Fjern mug og tværgående PDMS fra ovnen og flyt til en cross-flow hætte for støvfri håndtering af PDMS.
- Fjern eventuelle PDMS fra bunden af formen ved hjælp af en skalpel og fjerne den øverste plade af de tværgående PDMS fra formen.
- Line den eksponerede mønstrede PDMS plade med tape for at forhindre eventuelle støvpartikler til at komme i kontakt med PDMS kanaler.
- Skær PDMS chips til størrelse og punch 1 mm diameter indløb og forretninger ved hjælp af en biopsi punch.
- Sterilisering og limning af PDMS mikrofluidiske kanaler og glasdias
- Rengør glasmikroskopiglassene ved grundigt at skylle med ethanol efterfulgt af en isopropylalkohol, der skylles. Efter hver skylning tørres objektglassene grundigt med en nitrogenpistol.
BEMÆRK: Alternativt kan følgesedler anvendes, hvis analysen udføres ved hjælp af et konfokalt mikroskop. - Åbn plasmakammeret, og indlæs de rensede mikroskopiske slides og mikrofluidiske spåner uden beskyttelsesbåndet.
- Luk kammeret, fjern med nitrogen i 1 min. og fyld kammeret med filtreret luft, indtil et tryk på 500 mTorr er nået.
- Udsæt glasdias og PDMS-chips til plasmaet i 40 s ved hjælp af en effekt på 50 W og en frekvens på 5 kHz.
- Efter udsættelse for plasmaet, straks lim glasset dias og microfluidic chips. Opbevar enhederne i sterile petriskåle.
- Rengør glasmikroskopiglassene ved grundigt at skylle med ethanol efterfulgt af en isopropylalkohol, der skylles. Efter hver skylning tørres objektglassene grundigt med en nitrogenpistol.
- Blød litografi af polydimethylsiloxan (PDMS) ved hjælp af mønstrede wafere
- Cellesåning af endotelmonologer i mikrofluidiske kanaler
- Den specialfremstillede mikrokanal belægges ved at pipettere 10 μL af 0,1 mg/ml kollagen Type I eller 0,1% gelatine pr. kanal og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Til frø fire mikrokanaler, trypsinize 25 cm2 af sammenløbet PAECs og drej ned på 300 x g i 7 min på RT.
BEMÆRK: Kun en lille procentdel af cellerne vil klæbe til overfladen. Derfor er det nødvendigt at bruge et overskud af celler for at opnå et sammenflydende monolag. - PaeCs suspenderes i 20 μL cECM, og der skal anvendes 5 μL cellesuspension til hver kanal. På grund af de små kanaldimensioner vil kapillærkræfterne fylde mikroskredsen og forhindre luftbobledannelse.
- Skift medium efter 3-4 timer for at vaske ubundne celler.
- Hold cellerne i kultur i 6 dage, så PAEC'en kan danne et fast, sammenløbet monolag. På grund af det lille volumen skal mediet skiftes hver dag med 150 μL cECM. Lad pipettespidsen være fyldt med medium i indløbet, og sæt en tom spids i stikkontakten. Dette vil tjene som et reservoir, der giver tilstrækkelige næringsstoffer og vækstfaktorer til cellerne og forhindre diaset i at tørre ud.
- Plette kernerne i de levende celler med Hoechst (1:5.000 i cECM) plettes i højst 10 min ved 37 °C og 5% CO2.
- Vask omhyggeligt 3x med cECM og behandles med 1 μM histamin i ECM + 1% FBS i 30 min før analysen. Stimulus kan vælges ad libitum. For eksempel, TNF-α er blevet almindeligt anvendt som en inflammatorisk aktivator.
- Brug 90° vinklede stik i rustfrit stål med en diameter på 1,27 mm til at forbinde pdms-spånernes udløb med slangen.
3. Fremstilling af fuldblod fra mennesker
- Tegn venøst blod fra forsøgspersoner i 0,109 M natriumcitrat antikoagulerende middel. Dette kan være fra raske eller syge forsøgspersoner, der ikke får antikoagulationsbehandling. Inverter forsigtigt rørene for at blande. Den samlede mængde blod, der kræves til et eksperiment, afhænger hovedsageligt af den valgte strømningshastighed. Med en strømningshastighed på 25 ml/h, i ibidi 6-brøndsdias, er et samlet volumen på 2 ml med lidt overskydende til at fylde bøjer og flowkanal tilstrækkeligt.
- Overfør blodet til et 50 ml rør og tilsæt Calcein AM (1:10.000) for at fluorescerende mærke blodlegemer og Alexa488-fibrinogen (15 μg/ml) til konjugere autolog fibrinogen. Lad blodet inkubere ved 37 °C i 15 minutter for at tillade fuldstændig absorption.
- Blod 1:1 fortyndes med genberegningsbuffer (154 mM natriumchlorid, 10,8 mM trinatriumcitrat, 2,5 mM calciumchlorid og 2 mM magnesiumchlorid) umiddelbart før forsøgets start.
BEMÆRK: Hemodilution med højst 50 % påvirkede ikke koagulationsreaktionstiden30. Desuden kan humant blod indeholde virus og andre stoffer. Arbejde med blodprøver, derfor indebærer en risiko for infektion. Det anbefales på det kraftigste at anvende passende sikkerhedsforanstaltninger og håndtere materialet med forsigtighed.
4. Samling af flowsystemet
- Før slangen tilsluttes, skylle flowrørene med en 20 ml sprøjte fyldt med vaskepude (36 mM citronsyre, 103 mM natriumchlorid, 5 mM kaliumchlorid, 5 mM EDTA og 0,35% wt/vol bovine serum albumin [BSA], pH = 6.5) for at forhindre koagulation af blodet i rørene.
- Brug en ny sprøjte til at fylde flowrørene med HEPES-buffer (132 mM natriumchlorid, 20 mM HEPES, 6 mM kaliumchlorid, 1 mM magnesiumchlorid, 1% BSA og 5,5 mM D-glucose, pH = 7,4) og forbindes forsigtigt med et albueformet Luer-stik til mikroskredsen fyldt med EF i medium. Mens du sætter stikkene fast på mikrokanalerne, skal du forsøge at forhindre dannelsen af luftbobler i diaset. Bobler vil beskadige endotelet og påvirke resultaterne af dit eksperiment. Fjern vask buffer helt og lad ikke buffer komme i kontakt med cellerne, da dette vil hæmme koagulation.
- Konfigurer flowsystemet som vist i figur 1E. Der skal være 2 ml vaskepuffer i en 20 ml sprøjte, og skyl for at undgå koagulation, når blodet kommer ind i sprøjten. Sæt den tomme sprøjte i sprøjtepumpen, og tilslut udløbsrøret med et vis luer-stik til denne sprøjte. Sæt indløbsrøret i en beholder, der indeholder det forberedte menneskeblod.
- Tænd sprøjtepumpen, og beregn strømningshastigheden. Flowprofiler følger et parabolsk mønster i højden. Antages det, at blodet fungerer som en newtonsk væske, skal du bruge følgende formel til at beregne strømningshastigheden.
(Ligning 1)
Hvor
τ = forskydningsstress
η = dynamisk hætteglasse
Q = volumetrisk strømningshastighed
h = kanalhøjde
w = kanalbredde
BEMÆRK: For lungearterialgennemstrømning med blod i de kommercielle 6-kanals mikroskredse med rektangulære dimensioner med 0,4 mm højde og 3,5 mm bredde blev der anvendt en volumetrisk strømningshastighed på 25 ml/h i 5 min. På grund af forskellene i dimensionerne af de skræddersyede flowkanaler vil disse dynamikker også ændre sig. Juster variablerne for at sikre, at forskydningsbelastningen er ens. - Definer diameteren af 20 ml sprøjten til 19,05 mm og indstille programmet til attrække . Trække blodet gennem cellen-belagt kanal ved anvendelse af et undertryk vil garantere konstant forskydning satser og minimal skade på cellelaget.
(Ligning 1)
5. Opsætning af mikroskopet til billedopkøb
- Brug en 20x mål og placere mikroskred på scenen af den omvendte fase kontrast fluorescerende mikroskop. Start mikroskopsoftwaren for at flytte scenen i Z-retningen for at fokusere på cellemonstologen.
- Vælg et interesseområde (ROI) i begyndelsen, midten og slutningen af hver flowkanal. Begyndelsen og enden skal være mindst 3 mm væk fra kanalens indløb og udløb. Indstil de blå, grønne og røde lysstofrør med en lasereffekt og lysintensitet, der viser minimal baggrund.
6. Perfusion af fuldblod over PAECs
- Når alt er tilsluttet som i figur 1E, og mikroskopet er klar til optagelse, skal du trykke på Start for at optage en video. Skub Start på sprøjtepumpen for at gennemgå blodet over endotelet.
- Så snart blodet begynder at flyde over endotelet, erhverve billeder med de forudvalgte aktive kanaler og ROI positioner hver 15 s i 5 min.
- Efter 5 minutters perfusion skal du afslutte optagelsen og stoppe sprøjtepumpen. Demonter strømningskammeret og fjern forsigtigt slangen. Ofte vil en luftboble dannes, hvis dette gøres med for meget kraft. Prøv at forhindre dette, fordi dette vil skylle væk endotel.
7. Fiksering og efteranalyse
BEMÆRK: For at udelukke falsk positiv trombocyt ved ved endotelskade som følge af perfusionseksperimentet er det nødvendigt at karakterisere endotelcellerne for deres mellemrumsdannelse og monolag. Dette kan gøres ved regelmæssig immunfluorescens farvning for VE-cadherin.
- Efter perfusion og demontering af slangen vaskes den mikrofluidiske kanal med HEPES. Pipette HEPES ind i kanalen, så det vil skubbe blodet til stikkontakten. Fjern det overskydende med en anden pipette.
- Eventuelt vaskes kanalen med PBS++ (med 0,5 mM magnesiumchlorid og 0,9 mM calciumchlorid) for at forhindre udfældning af proteinsupernatant. Dette reducerer baggrunden. Men, en ekstra vask skridt kan ændre cellulære adfærd og morfologi, der kan påvirke post-analyse billeddannelse.
- Fjern HEPES og fastgør endotelet med påsatte blodplader, og der deponeres fibrin ved at pipettere 37 °C opvarmet 4% paraformaldehyd (PFA) i kanalen og inkuberes i 15 min.
BEMÆRK: Vær ekstra forsigtig, når du fastgør de specialfremstillede mikrofluidics, da disse kanaler er endnu mindre, hvilket forårsager højere forskydningskræfter i kanalen under hvert håndteringstrin. - Fjern PFA fra kanalen og vask 3x med PBS. Mikroskrederne er nu klar til en standardfarvning protokol til at karakterisere endotelcelle markører såsom VE-cadherin, CD31, P-selectin eller integrins, CD42b for klæbende blodplader, eller CD45 for leukocytter.
- Efter farvning, tage mindst fem billeder med en regelmæssig konfokal mikroskop til at karakterisere colocalization.
8. Billedanalyse
- Åbn et flowanalysebillede, der indeholder enten fluorescerende mærkede blodplader eller fluorescerende fibrin i ImageJ. Træk billedet af valg til ImageJ.
- Billedet er taget i RGB farve. Til analyse foretrækkes et 8-bit billede, så omdan billedet til 8-bit: Billede | Type | 8-bit.
- For at minimere baggrunden skal du trække med en glidende paraboloid, hvor en rullende kugle lokalt beregner og trækker baggrundspixel fra det oprindelige billede: Proces | Trække baggrund | Rullekugleradius = 50 pixel | Glidende Paraboloid.
BEMÆRK: Billedstørrelsen er defineret i pixel. Men for at måle området er det nødvendigt at fastsætte skalaen. Når billederne er taget med en 20x mål med en numerisk blænde på 0,45, mikroskopet har en skala på 2 pixels pr μm. Det meste af tiden de nødvendige oplysninger til at indstille skalaen er gemt i metadata af billedet og kan automatisk bruges af ImageJ: Analysér | Angiv skalering. - Angiv en grænse for at definere klæbede blodplader eller deponeret fibrin. Brug trianglemetoden, og tærsklen justeres automatisk: Billede | Juster | Tærskel.
- Analysér det område, der er dækket af blodpladerne eller fibrin med kommandoen Analyser partikler. Angiv størrelse ved 2-Uendelighed, da den minimale størrelse af en blodplade er 2 μm: Analysér | Analysér partikler.
- Resultaterne vil give det samlede areal i μm2, med gennemsnitlig størrelse af aggregaterne i μm2 og procentdelen af dækket areal.
Representative Results
De repræsentative resultater kan opdeles i tre dele, der hver repræsenterer de respektive trin i eksperimentel opsætning, dataindsamling og dataanalyse. Afhængigt af forskningsspørgsmålet kan parametre for hvert trin ændres. De fremlagte data anvendes til at undersøge endotelets indflydelse på trombedannelse.
Eksperimentel opsætning
Det er veletableret, at endotelceller er meget heterogene i struktur og funktion, afhængigt af placering og tid, under sundhed og sygdom23. Forskellige kilder til endotelceller kan anvendes til at studere endotel-blod interaktion, som i dette tilfælde var kommercielt tilgængelige HUVECs og PAECs (Figur 1A). HUVECs har været de mest almindeligt anvendte i laboratoriemodeller, mens PAECs er patient-afledte isolerede celler fra lungearterierne. Desuden findes der veletablerede protokoller til isolering af mikrovaskulære endotelceller (MVEC) fra lungecirkulationen eller blodcirkulationen, der cirkulerer endotelkoloni (ECFC)25,28,29.
Efter isolation, endotelceller var karakteriseret ved VE-cadherin, CD31, og TIE2 farvning for at bekræfte en endotel fænotype. Karakterisering for tilstedeværelse af αSMA og cytokeratin indikerede fraværet af en fibroblast eller epitellignende fænotype (Figur 1B). Efter at have fået en meget ren population af EC'er blev passage 3-5 celler anvendt til at frø enten et kommercielt mikroslid eller skræddersyede mikrofluidiske flowkanaler (Figur 1C). Mens de kommercielt tilgængelige mikroskredse primært er parallelle flowkamre, eller Y-formede kanaler med specifikt definerede parametre i højde eller bifurcation vinkel, brugen af mikrofluidiske dias gør det muligt at tilpasse de eksperimentelle parametre til in vivo fartøj geometri og blodgennemstrømning dynamik31. Men, skræddersyede mikrofluidiske størrelser er mindre og har tendens til at begrænse cellespredning og fremkalde mere celledød32,33. Ved hjælp af et overskud af celler kompenserer for det faktum, at kun en lille procentdel af celler vil overholde. Dette blev observeret, da en stenose blev indført, hvor endotelceller viste en mere aflang fænotype sammenlignet med en parallel mikrofluidickanal (Figur 1D). Kommercielle flowkamre har et større overfladeareal, som celler kan binde sig til. Dette kræver færre cellenumre til såning.
For at studere endotelcelle-blod interaktion, fuldblod blev perfunderet over en endotel monolag. Citrerede blod blev indsamlet på dagen for forsøget og umiddelbart før perfusion genberegnet. Cellerne blev stimuleret med histamin for at fremkalde VWF-frigivelse og trombocyt vedhæftning 30 min før perfusion (figur 1E)34,35. På grund af de små dimensioner, de skræddersyede mikrofluidic kanaler tilladt brug af mindre blod mængder.
Dataindsamling
For at undersøge trombedannelse på PAECs blev Calcein AM-Red fluorescerende mærket blodlegemer og Alexa488-konjugeret fibrin perfunderet i 5 minutter ved 2,5 dyne/cm2 (Figur 2A–C). Klæbende blodlegemer og deponeret fibrin blev kvantificeret. Billeder blev erhvervet hver 30 s og kvantificeret med ImageJ. Det var vigtigt at trække baggrunden for at fjerne autofluorescens af ikke-vedhæftige blodplader. Trekantalgoritmen for tærskelværdier er blevet brugt til at definere minimal baggrund. Det gjorde det muligt at måle små trombocyt aggregater (Figur 2D).
På grund af ikkestimulerede forhold var der forventet ingen binding af blodplader og fibrin til endotelet. For at fremme VWF frigivelse og trombocytbinding, PAECs blev stimuleret med histamin, hvilket resulterede i en øjeblikkelig stigning i blodplade vedhæftning nå et plateau efter 2,5 min. På dette tidspunkt, blodplader begyndte at udskille autokrine faktorer, der inducerede blodplade sammenlægning og fibrinogen spaltning i fibrin. Fibrin blev deponeret efter 3 min og dannede en stabil aggregat med blodplader efter 4 min (Figur 2E).
For at undersøge, om denne virkning kunne hæmmes af et direkte oralt antikoagulerende middel (DOAC), blev blod behandlet med 10 nM dabigatran. Dabigatran blev tilføjet til blodfortyndingen, hvor det hæmmer faktor IIa i koagulationsvejen, og forhindrede kavalergang af fibrinogen til at danne fibrin fibre. Når dabigatranbehandlet blod blev perfunderet over stimulerede PAECs, kan dannelse af blodprop være direkte hæmmet ved at forsinke fibrindeposition (Figur 2F).
Dataanalyse
At studere indflydelsen af forskellige endotelkilder på trombe dannelse, de cellulære ændringer på 5 min blodperfusion blev analyseret. Endotelet blev fikseret, og klæbende blodplader blev mærket med CD42b før billeddannelse under et konfokal mikroskop. Dette gav en detaljeret analyse for colocalization af blodplader og fibrin, der kunne indikere dysfunktionelle koagulationsfaktorer i blodet. EF's indflydelse på dannelse af blodprop blev bestemt ved standardimmunfluorescerende farvning. Endotelcellekontakter blev opretholdt, hvilket bekræftes af VE-cadherin-farvning, hvilket indikerer, at de blodpropper, der dannes oven på endotelmonaltlaget, snarere end på den underliggende matrix mellem endotelhuller (figur 3). Desuden resulterede brugen af forskellige cellekilder i forskellige mønstre af trombi, der dannes på endotelet. HUVEC'er er venøse endotelceller og viste begrænset trombocyt vedhæftning og fibrindeposition, mens syge primære PAEC fra CTEPH patienter viste rigelig trombocyt vedhæftning og mere fibrin deposition ved histamin stimulation sammenlignet med sund PAEC. Dette tyder på, at endotel af CTEPH patienter viser højere lydhørhed over for vasoaktivering, der resulterer i øget trombedannelse.
Figur 1: Skematisk overblik over protokollen. (A)Forskellige kilder og forskellige typer af endotelceller blev isoleret og dyrket til brug i en mikrofluidic flow kanal for perfusion eksperimenter. Repræsentative brightfield billeder af forskellige typer af endotelceller. Skalabar = 50 μm. ( B )Isoleredeceller var karakteriseret ved immunfluorescerende farvning for at bekræfte en endotelfænotype. Skalalinje = 50 μm. (C) Celler kan sås i enten kommercielle flowdias eller specialfremstillede mikrofluidiske kanaler. DD) Repræsentative brightfield billeder af HUVEC dyrket i forskellige kanalgeometrier. Skalabar = 50 μm. (E) Eksperimentel opsætning af blodperfusionsforsøg. Citeret blod blev indsamlet, fortyndet med saltvand buffer, og perfunderes over endotelceller med en sprøjte pumpe. Lunge- og navlestrengen i dette tal blev modificeret fra Servier Medical Art, licenseret under en Creative Common Attribution 3.0 Generisk Licens. http://smart.servier.com/ Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Erhvervelse af billeder og kvantificering af trombedannelse. a) Repræsentativ time-lapse-billeddannelse af klæbende Calcein AM-Red-mærkede blodplader og deponerede Alexa488-konjugeret fibrin ved 1, 3 og 5 min efter fuldblodsperfusion over ustimulerede PAECs (B) og over histamin stimulerede PAECs. c) Repræsentative time-lapse-billeder af trombocythæftning og fibrinaflejring ved 1, 3 og 5 min perfusion med fuldblod inkuberet med dabigatran perfunderet over histamin-stimulerede PAECs. Skalalinje = 50 μm. (D) Skematisk oversigt over billedkvantificering i ImageJ. EE) Kvantificering af trombocytvedhæftning og fibrinaflejring for hver 30 sek. F) Kvantificering af dabigatrans virkning på trombusdannelsen kvantificeret ved trombocytvedvedhæftning og fibrinaflejring. Data repræsenteres som middelværdi ± SD, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative konfokale billeder af flowforsøg for at karakterisere trombedannelse i trombocyt vedhæftning og fibrinaflejring på endotelceller. Endotelcellekontakter var karakteriseret ved VE-cadherin og målt i kontrol-PAECs, patientafledte CTEPH PAECs og HUVEC. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Koagulation er et resultat af det komplekse og tidsmæssigt kontrollerede samspil mellem endotel og blodkomponenter. Denne in vitro assay præsenterer en metode til at undersøge trombogen egenskaber endotelceller i realtid. Forskellige typer af primære humane endotelceller kan anvendes, lette in situ trombose i et organ og patient-specifik måde. I denne undersøgelse illustrerede vi brugen af denne protokol, der sammenlignede trombogeniske egenskaber af PAECs isoleret fra raske donorer versus CTEPH patienter. Levende trombedannelse blev undersøgt ved perfusion af fuldblod fra raske forsøgspersoner over histaminaktiveret endotel, mens effekten af en DOAC blev testet som et antithrombotisk middel.
Ud over brugen af kommercielt tilgængelige mikrokanaler, som vist i de repræsentative resultater, muliggør indførelsen af de skræddersyede mikrofluidiske kanaler studiet af vaskulære geometriændringers indflydelse på trombedannelsen. F.eks. resulterer flowreduktioner ved et grenpunkt eller stenose i en stigning i forskydningsstress og mere blodpladeaktivering36. En betydelig begrænsning af disse specialfremstillede mikrofluidiske kanaler er imidlertid kravet om høje celletal for at danne et stabilt monolag af EC'er som beskrevet i trin 2.3.2. Dette kan udgøre en begrænsende faktor, når patient-afledte celler er knappe. Styrkerne ved de kommercielt tilgængelige mikroskredse er, at overfladearealer ændres til cellekultur, og vækstområderne er større, hvilket gør det muligt for EC'er at danne et sammenløb og et stabilt monolag. På den anden side vil et større overfladeareal resultere i en større lumen. Ifølge Equation 1, dette kræver højere blodmængder at nå lignende strømningshastigheder som i de skræddersyede microfluidics.
En forbedring af denne protokol kunne være at undersøge levende EF tab eller ændringer i barriere integritet. EF-skader i denne protokol måles kun ved forsøgets afslutning. Til live-sporing kan ECs mærkes med mCherry VE-cadherin,f.eks. Da dette imidlertid ville kræve en stærkt optimeret protokol med effektiv virus transfection, Electric Cell-substrat Impedance Sensing (ECIS) kunne bruges som et alternativ til at studere endotel integritet og barriere funktion38. Perfusion over særlige ECIS-flowkanaler muliggør overvågning i længderetningen af endotelbarriereintegritet under flow. Disse specifikke ECIS-funktioner giver mulighed for parallelle målinger af endotelbarriereegenskaber og trombedannelse. Alternative måder til parallelle EF-barrieremålinger, især i de skræddersyede arrays, omfatter brugen af fluorescerende dextrans i perfusatet, som spredes ud af lumen, afhængigt af EF-barriereegenskaberne.
En begrænsning af den beskrevne protokol er, at ECs fjernes fra den menneskelige krop og dyrkes på vævskultur plast, som er en stiv, kunstig substrat. Celler tilpasser sig deres biofysiske miljø. Dette kan muligvis påvirke endotelrespons på blodpladeaktivering, da der er en sammenhæng mellem trombocytaktivering og vægstivhed39. På trods af disse tilpasninger til dyrkningsplast har celler sygdomsspecifikke egenskaber, der kan identificeres i direkte sammenligning med EC'er, der stammer fra raske donorer, som vist med kontrol, CTEPH-PAEC og HUVEC, der udøvede forskellige trombocytvedhæftningsmønstre og fibrinaflejring efter 5 min blodperfusion.
I modsætning til andre protokoller bruger dette system fuldblod, mens andre studerer EF-interaktion med en enkelt blodkomponent såsom blodplader og leukocytter19,20,21. Der har været mere avancerede mikrofluidiske modeller udviklet, der gør det muligt at studere endotelfunktion i en vaskulær model med en rund beholdergeometri og blød ekstracellulær matrix. Disse er dog optimeret med HUVECs40,41,42. Det nye ved den beskrevne protokol er brugen af primære EC'er kombineret med fuldblod, der bringer modelleringen af in situ trombose et skridt tættere på in vivo betingelser. Efter at have optimeret protokollen for brug af patient-afledte ECs og patient-afledt blod yderligere optimerer sygdom modellering in vitro, så vurderingen af personlig trombe dannelse og narkotikabehandling.
Den beskrevne protokol kan anvendes til at undersøge effekten af antikoagulationsterapier på patientafledte celler. Mens vi brugte dabigatran til at hæmme trombedannelse, er det muligt at bruge andre antikoagulanter, såsom rivaroxaban, som direkte hæmmer faktor Xa i koagulationkaskade. Direkte blodpladehæmmere som clopidogrel eller aspirin kan undersøges så godt, da disse virker på den primære fase af hæmostase, hvor blodplader binder sig til ECs. I sidste ende kan den trombogeniske kapacitet af patientspecifikke EC'er i samspil med patientens eget blod bruges til at forudsige den personlige virkning af antikoagulationsbehandling på den enkelte patient. Desuden kan en knockdown af specifikke proteiner give yderligere funktionelle oplysninger.
Der er nogle trin i den beskrevne protokol, der er afgørende for et vellykket perfusion-eksperiment. For det første er det under isoleringen af primærceller nødvendigt at opnå en meget ren EF-kultur. For det andet er det vigtigt, at EC danner et stabilt sammenflydende monolag. Hvis dette ikke er tilfældet, kan en lille ændring i forskydningsstress forårsage endotelskader og aktivering af koagulationskskaden, eller blodplader kan begynde at binde sig til kældermembranen, hvilket vil give falske positive resultater. For det tredje er det vigtigt at forhindre luftbobler, da de kan beskadige endotelet og dermed påvirke resultaterne.
Efter genberegning af citrerede blod med calciumchlorid og magnesiumchlorid, er det vigtigt straks at starte perfusion eksperimentet. Genberegningen fremkalder en hurtig reaktion i trombocytaktivering og trombedannelse, hvilket resulterer i hurtig koagulation i prøven.
Afslutningsvis beskriver vi en meget alsidig protokol til at studere fuldblods-endotelcelle interaktioner under trombose.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Jan Voorberg fra Institut for Plasma Proteiner, Sanquin Research og Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Holland, for hans input i dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af den hollandske CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] tildelt Phaedra og Reconnect-konsortiet samt Impulstilskuddet 2018 tildelt Phaedra IMPACT-konsortiet. Disse tilskud omfatter kollektiv finansiering fra Dutch Heart Foundation, Dutch Federation of University Medical Centers, The Netherlands Organization for Health Research and Development og Royal Netherlands Academy of Sciences. Desuden blev dette arbejde finansieret af Det Europæiske Forskningsråd under programmet »VeSCEL« (tilskudsnummer: 669768). XDM er finansieret af et forskningstilskud fra Institut for CardioVascular Research (ICaR-VU) på VU University Medical Center, Amsterdam, Holland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL syringe | BD | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 100244 | |
| Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 2478269 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 106448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
References
- Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. Endothelial cell control of thrombosis. BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130 (2015).
- Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
- Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
- Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
- Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).
- Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
- Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
- Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
- ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
- Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
- Kim, N. H., et al. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915 (2019).
- Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
- Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
- Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
- Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
- Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
- Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
- Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
- Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
- Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
- Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
- Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
- Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
- van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
- Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
- Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
- Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
- McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
- Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
- Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).
