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Immunology and Infection

इन विट्रो माइक्रोफ्लुइडिक रोग मॉडल वास्तविक समय में पूरे रक्त-एंडोथेलियल इंटरैक्शन और रक्त क्लॉट डायनामिक्स का अध्ययन करने के लिए

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/61068
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 1, 3, 1, 1,5,6
1Department of Pulmonary Diseases, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, Amsterdam Cardiovascular Sciences (ACS), 2BIOS Lab-on-a-Chip group, University of Twente, 3Applied Stem Cell Technologies Group, University of Twente, 4Department of Cardio-thoracic Surgery, Amsterdam UMC, VU University Medical Center, 5Institute of Physiology, Charité-Universitätsmedizin, 6German Heart Center

Summary

हम रोगी-व्युत्पन्न एंडोथेलियम के साथ पूरे रक्त इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक इन विट्रो वैस्कुलर रोग मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रणाली विभिन्न परिस्थितियों में प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं के थ्रोम्बोजेनिक गुणों के अध्ययन की अनुमति देती है। विधि विशेष रूप से जमावट के विभिन्न चरणों के दौरान सीटू थ्रोम्बोजेनिटी और एंटीकोगुलेशन थेरेपी में मूल्यांकन करने के लिए अनुकूल है।

Abstract

रक्त के थक्के के गठन में एंडोथेलियल कोशिकाओं, उनके अंतर्निहित मैट्रिक्स, विभिन्न रक्त कोशिकाओं और प्रोटीन के बीच जटिल बातचीत शामिल है। एंडोथेलियम कई प्रमुख हीमोस्टेटिक अणुओं का प्राथमिक स्रोत है जो प्लेटलेट एकत्रीकरण, जमाव और फाइब्रिनोलिसिस को नियंत्रित करते हैं। यद्यपि दशकों से थ्रोम्बोसिस के तंत्र की जांच की गई है, इन विट्रो अध्ययन मुख्य रूप से संवहनी क्षति की स्थितियों पर ध्यान केंद्रित करते हैं जहां उपएंडोथेलियल मैट्रिक्स उजागर हो जाता है, या एकल रक्त घटकों के साथ कोशिकाओं के बीच बातचीत पर। हमारी विधि पूरे रक्त और एक बरकरार, कंफ्लूएंंट वैस्कुलर सेल नेटवर्क के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देती है।

प्राथमिक मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके, यह प्रोटोकॉल थ्रोम्बस गतिशीलता पर एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रभाव का अध्ययन करने का अनूठा अवसर प्रदान करता है और थ्रोम्बोटिक रोग के रोगविज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि देता है। कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह चैनलों का उपयोग रोग-विशिष्ट संवहनी ज्यामिति और मॉडल विशिष्ट रूपात्मक संवहनी परिवर्तनों के अनुप्रयोग की अनुमति देता है। थ्रोम्बस का विकास वास्तविक समय में दर्ज किया जाता है और मात्रात्मक रूप से प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन जमाव की विशेषता होती है। परिवर्तित थ्रोम्बस गतिशीलता में एंडोथेलियल फ़ंक्शन का प्रभाव विशिष्ट अणुओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से पोस्टएनालिसिस द्वारा निर्धारित किया जाता है।

प्रतिनिधि परिणाम प्रयोगात्मक सेटअप, डेटा संग्रह और डेटा विश्लेषण का वर्णन करते हैं। अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, हर अनुभाग के लिए मापदंडों को सेल प्रकार, कतरनी दरों, चैनल ज्यामिति, दवा चिकित्सा और पोस्टएनालिसिस प्रक्रियाओं सहित समायोजित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल क्रोनिक थ्रोम्बोलिक रोग के साथ रोगियों के फेफड़े की धमनी एंडोथेलियम पर थ्रोम्बस गठन की मात्रा निर्धारित करके मान्य है।

Introduction

एंडोथेलियम रक्त वाहिकाओं की आंतरिक सेलुलर परत बनाता है और रक्त को आसपास के ऊतकों से अलग करता है। इसे एक गतिशील अंग के रूप में वर्णित किया गया है जो सक्रिय रूप से अपने सूक्ष्म वातावरण को नियंत्रित करता है और बाहरी उत्तेजनाओं का जवाब देता है1। बहते रक्त के साथ इसके सीधे संपर्क के कारण, एंडोथेलियम हेमेसिस और थ्रोम्बोसिस के नियंत्रण में निर्णायक है और प्लेटलेट एकत्रीकरण, जमाव और फाइब्रिनोलिसिस 2 कोनियंत्रितकरने वाले कई प्रमुख नियामक अणुओं का प्राथमिक स्रोत है। स्वस्थ, गैर-सक्रिय एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) कई अणुओं का उत्पादन करती हैं जो प्लेटलेट सक्रियण का प्रतिकार करते हैं और रक्त प्रवाह को बनाए रखने के लिए जमाव और थ्रोम्बस गठन को रोकते हैं, जैसे प्रोस्टेसाइक्लिन, थ्रोम्बोमोडुलिन, या ऊतक कारक मार्ग अवरोधक(टीएफपीआई) 2,,3। यह प्लेटलेट्स, प्लेटलेट एकत्रीकरण और थ्रोम्बस गठन के आसंजन को रोकता है। पोत की दीवार की चोट या सक्रियता के परिणामस्वरूप प्रोकोगुलैंट एंडोथेलियल फेनोटाइप होता है जो स्थानीय प्लेटलेट आसंजन और थक्का2,4शुरू करता है । एंडोथेलियल एक्टिवेशन प्लेटलेट्स पर वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ), ईसीएस से जारी एक बहुमेरिक प्रोटीन, या अंतर्निहित सबेंडोथेलियल मैट्रिक्स की बाध्यकारी साइटों को उजागर करने का पालन करते हैं। इसके बाद, प्लेटलेट्स में आणविक परिवर्तन और ऊतक कारक (टीएफ) के संपर्क में आने से जमाव प्रणाली की सक्रियता शुरू होती है, जो फाइब्रिन बहुलीकरण5,,6द्वारा थ्रोम्बस गठन को प्रेरित करती है। साथ में, परिणामी थक्का7को फिर से एंडोथेलियलाइजेशन द्वारा घाव बंद करने का आधार प्रदान करता है। जमावट प्रणाली के क्षुद्रता के परिणामस्वरूप वॉन विलेब्रांड रोग, हीमोफीलिया या थ्रोम्बोसिस जैसे रक्तस्राव विकार हो सकते हैं, जो अक्सर एंडोथेलियल हीमोस्टेटिक मार्ग2,,3के एक डिस्रिथेलाइड प्रो-और एंटीथ्रोम्बोटिक संतुलन से होते हैं।

हेमेसिस की प्रक्रिया धमनी और विषैले दोनों परिसंचरण में होती है। हालांकि, धमनी और शिराओं थ्रोम्बोसिस अंतर्निहित तंत्र मौलिक रूप से अलग हैं। जबकि धमनी थ्रोम्बोसिस, जैसा कि इस्कीमिक हृदय रोग में देखा जाता है, ज्यादातर उच्च कतरनी तनाव की स्थितियों के तहत एक एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका के टूटने से प्रेरित होता है, वेनस थ्रोम्बोसिस ज्यादातर स्टैसिस8,,9,,10की स्थिति में एंडोथेलियल चोट के अभाव में विकसित होता है। एक गहरी नस थ्रोम्बस फेफड़े की धमनियों की ओर एम्बोलाइज और यात्रा कर सकती है, जहां यह फेफड़े के एम्बोलिज्म का कारण बनती है। इसके परिणामस्वरूप पुरानी संवहनी बाधाएं उत्पन्न हो सकती हैं जिससे महत्वपूर्ण बिगड़ी कार्यात्मक क्षमताएं हो सकती हैं जो क्रोनिक थ्रोम्बॉम्बोलिक पल्मोनरी हाइपरटेंशन (सीटीईपीएच)11 , 12,13,,14के विकास सहित क्रोनिक फेफड़ों की बीमारियोंकेविकास को बढ़ावा दे सकती हैं ।14 सीटीईएच की विशेषता है कि फेफड़े की धमनियों में बाधाओं के कारण थ्रोम्बोलिक सामग्री द्वारा कम से कम तीन महीने की एंटीकोगुलेशन थेरेपी15के बाद होती है । फेफड़ों के एम्बोली के अलावा, यह पोस्ट किया जाता है कि पल्मोनरी एंडोथेलियम सीटीईपीएच में एक प्रोथ्रोम्बोटिक वातावरण प्रदान करता है जो सीटू थ्रोम्बोसिस और फेफड़े की धमनियों के पुराने अवरोधों में सुविधा प्रदान करता है, जिससे रक्तचाप में वृद्धि होती है जो अंततः दिल की विफलता में परिणाम दे सकती है, यदि अनुपचारित16,,17।

पिछले वर्षों में, विभिन्न अध्ययनों ने प्लेटलेट फ़ंक्शन और जमाव18को मापकर थ्रोम्बस गठन की जांच करने के लिए परख का विकास किया है। हालांकि, उनमें से अधिकांश या तो कोलेजन या फाइब्रिन जैसे एकल एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स घटकों के साथ पूरे रक्त की बातचीत का अध्ययन करते हैं, या एकल रक्त घटकों जैसे एंडोथेलियल-प्लेटलेट या एंडोथेलियल-ल्यूकोसिट इंटरैक्शन19,20,,,21,,22के साथ बातचीत में एंडोथेलियल फ़ंक्शन। ये परख सबसे अधिक मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVEC) के साथ किया जाता है, क्योंकि इन कोशिकाओं को आसानी से प्राप्त किया जाता है। हालांकि, हीमोस्टेटिक जीन को 23,,24के संवहनी वृक्ष, पोत प्रकार और अंग प्रणालियों में अलग-अलग व्यक्त कियाजाताहै, जो धमनी थ्रोम्बोसिस या पल्मोनरी एम्बोलिज्ममेंशामिल एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए एचयूवीसी का उपयोग करता है।

ईसी प्लास्टिसिटी के अलावा, रोग-विशिष्ट हेमोडायनामिक परिवर्तन और संवहनी आकृति विज्ञान में परिवर्तन सामान्य एंडोथेलियम25पर थ्रोम्बस गठन को बढ़ावा दे सकते हैं। उदाहरण के लिए, स्थानीय वासोकों की ज्यामिति या परिवर्तन के कारण, उच्च कतरनी दरों के परिणामस्वरूप तीव्र थ्रोम्बस गठन हो सकता है, जिससे एक स्टेनोसिस हो सकता है जो रक्त प्रवाह26की समाप्ति को तेज करता है। कस्टम-निर्मित माइक्रोइंजीनियर्ड फ्लो चैनलों का उपयोग विशेष रूप से वैस्कुलर ज्यामिति डिजाइन करने की अनुमति देता है जो (पाथो) जीव विज्ञान के प्रतिनिधि हैं। इस तरह, स्वस्थ या रोगग्रस्त ईसी27पर स्थानीय जैव यांत्रिक बलों के प्रभाव का अध्ययन करना संभव है।

जमावट झरना में विभिन्न चरणों और अणुओं को लक्षित करने के लिए एंटीकोगुलेशन उपचार उपलब्ध हैं, जो सभी विशेष जोखिम और लाभ पैदा करते हैं जो कुछ विकारों के लिए विशिष्ट हो सकते हैं। इस पेपर में वर्णित रोग मॉडलिंग का दृष्टिकोण विशेष रूप से थ्रोम्बस गतिशीलता पर विभिन्न एंटीकोगुलेशन और एंटीप्लेटलेट उपचारों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए अनुकूल है।

इसका उद्देश्य थ्रोम्बोसिस का एक मॉडल पेश करना है जिसमें प्राथमिक ईसीएस शामिल हैं, जो उपयोग किए गए प्राथमिक ईसीएस के प्रकार के आधार पर थ्रोम्बोसिस के विभिन्न रूपों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त बहुमुखी मॉडल है। एक उदाहरण के रूप में, हमने पूरे मानव रक्त के साथ बातचीत में सीटीईएच रोगियों से फेफड़े की धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग किया जिसमें थ्रोम्बस गठन (प्लेटलेट्स, ल्यूकोसाइट्स, एरिथ्रोसाइट्स, क्लॉटिंग प्रोटीन और कोफैक्टर) में शामिल सभी घटक शामिल थे। इस दृष्टिकोण को वाणिज्यिक समानांतर प्रवाह चैनलों में या कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह चैनलों में एक विशिष्ट संवहनी डिजाइन के साथ लागू किया जा सकता है। जैसे, मॉडल अंततः थ्रोम्बस गठन और संकल्प के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है, रोग मॉडलिंग में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के आकलन के लिए, एंटीप्लेटलेट या एंटीकोगुलेशन थेरेपी के लिए, और अंततः व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए।

यह अध्ययन प्राथमिक मानव फेफड़े की धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है। अन्य प्राथमिक मानव एंडोथेलियल सेल प्रकारों के अलगाव के लिए, हम पहले प्रकाशित तरीकों का उल्लेख करते हैं, जिनमें पल्मोनरी माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं25,मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाएं28और रक्त परिसंचारी एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाली कोशिकाएं चित्र 1 ए29शामिल हैं।

Protocol

इस अध्ययन को वीयू मेडिकल सेंटर एम्स्टर्डम, नीदरलैंड (मेटसी वीयूएमसी, एनएल69167.029.19) के संस्थागत मेडिकल एथिकल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार लिखित सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद मानव विषयों का प्राथमिक सेल अलगाव और रक्त संग्रह किया गया था।

1. प्राथमिक मानव फेफड़े की धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं की अलगाव और संस्कृति (PAEC)

  1. गर्म पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम (सीईसीएम) 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस), 1% एंडोथेलियल सेल ग्रोथ सप्लीमेंट (ईसीजीएस), और 1% गैरजरूरी अमीनो एसिड (एनईएए) के साथ पूरक, ३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में । सर्जिकल कैंची, संदंश, और एक स्केलपेल को या तो 120 डिग्री सेल्सियस गर्मी स्टरलाइजर या 70% इथेनॉल के साथ स्टरलाइज करें। बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में PAEC के अलगाव प्रदर्शन करते हैं।
  2. कोट एक उच्च आत्मीयता सेल बाध्यकारी 60 मिमी सेल संस्कृति पकवान (सामग्री की मेजदेखें) 5 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन के 2 मिलील के साथ और कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. सर्जरी से पल्मोनरी धमनी (PA) ऊतक प्राप्त करें(जैसे,लोबेक्टॉमी या पल्मोनरी एंडआर्टेक्टॉमी), 4 डिग्री सेल्सियस कोल्ड कॉर्ड बफर (4 एमएमएम पोटेशियम क्लोराइड, 140 mum सोडियम क्लोराइड, 10 mm HEPES, 11 mM D-ग्लूकोज, और 1% पी/एस, पीएच = 7.3) में स्टोर करें, और आइसिकेशन तक रखें।
  4. ऊतक हटाने के बाद 2 घंटे के भीतर पीए से एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करें। पीए को संदंश के साथ लें और पीबीएस से धोने के लिए 10 सेमी पेट्री डिश में डाल दें। यदि पीए अभी भी एक अंगूठी है, तो कैंची से खुली फेफड़े की धमनी को काट लें। उपकरणों के साथ पोत की अंतरतम परत को न छूने के लिए बहुत सावधान रहें, क्योंकि एंडोथेलियम आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाता है और/या हटा दिया जाता है ।
  5. सेल कल्चर डिश से फाइब्रोनेक्टिन निकालें और सीईसीएम मीडियम का 4 एमएल डालें।
  6. पीए टिश्यू को संदंश के साथ लें और मीडियम में रखें। इस बीच, ध्यान से एक स्केलपेल के साथ माध्यम में पोत की भीतरी परत परिमार्जन । अक्सर, पोत की दीवार में लिपिड संचय देखा जा सकता है। इन्हें छोड़ने की कोशिश करें, क्योंकि वे सेल वृद्धि को प्रभावित करेंगे।
  7. कोशिकाओं को संस्कृति में तब तक रखें जब तक कि एंडोथेलियल कोशिकाओं की छोटी उपनिवेश दिखाई देने लगें।
  8. हर दूसरे दिन माध्यम को बदलें। यदि फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति को दूषित करते हैं, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक किट के साथ CD144 के लिए चुंबकीय आत्मीयता सेल अलगाव के साथ इसे शुद्ध करें (सामग्री की तालिकादेखें)। प्रारंभिक शुद्धि के लिए दो कॉलम विधि और हर लगातार शुद्धि के लिए एक कॉलम विधि का उपयोग करें। आम तौर पर, एक संस्कृति को शुद्ध परिभाषित किया जाता है जब प्रवाह साइटोमेट्री कोशिकाओं को दूषित करने वाले ≤10% का पता लगाता है।
  9. 1:3 से 1:4 के अनुपात में विभाजित कोशिकाओं जब तक पर्याप्त पैक्स प्रयोगात्मक उपयोग के लिए बड़े हो रहे हैं । जब पैक्स उपयोग करने के लिए तैयार हों, तो अगले चरण के साथ जारी रखें।
  10. शुद्धिकरण के बाद, प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को ईसी विशिष्ट मार्कर(जैसे,वीई-कैडेरिन, सीडी 31, टीवाई 2) की उपस्थिति के लिए और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (α-SMA), फाइब्रोब्लास्ट (विमेंटिन), और एपिथेलियल (साइटोकेरटिन) मार्कर(चित्रा 1B)की उपस्थिति के लिए विशेषता की आवश्यकता होती है।

2. फ्लो चैम्बर्स और पीएईसी मोनोलेयर्स की तैयारी

नोट: परिकल्पना के आधार पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह कक्षों (सामग्री की तालिका और चित्रा 1सी विकल्प ए,प्रोटोकॉल के चरण 2.1) या कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक फ्लो चैंबर(चित्रा 1सी विकल्प बी, प्रोटोकॉल के चरण 2.2) का उपयोग करें।

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्लाइड में एंडोथेलियल मोनोलेयर की सेल सीडिंग
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह कक्षों का उपयोग करना आसान है और पूरे चैनल में एक लैमिनार प्रवाह पैटर्न प्रदान करना है जिसका उपयोग उच्च कतरनी दरों पर किया जा सकता है। इन माइक्रोस्लाइड को मल्टीचैनल समानांतर रन की अनुमति देने और एक सटीक और प्रजनन योग्य प्रवाह प्रोफ़ाइल प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। क्योंकि वे उल्टे माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूलित हैं, उच्च गुणवत्ता वाले फ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर करना संभव है। इसके अलावा, प्रवाह कक्षों के विभिन्न आयाम विभिन्न चैनल आकार या ज्यामिति में उपलब्ध हैं। इस परख के लिए 6-वेल फ्लो चैनल्स को पसंद किया जाता है क्योंकि इन माइक्रोस्लाइड्स में छोटे आयाम होते हैं और मल्टीपारैलेल रन की अनुमति देते हैं ।
    1. 6-वेल फ्लो स्लाइड (3.5 मिमी चौड़ाई x 0.4 मिमी ऊंचाई x 17 मिमी लंबाई) के एक चैनल को कोट करने के लिए प्रति चैनल 0.1% जिलेटिन के 30 μL का उपयोग करें और कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. एक चैनल बीज के लिए, 10 सेमी2 शांत पैक्स की कोशिश करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 7 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें।
    3. एक चैनल में सीसीएम के 600 माइक्रोन में पैक्स और सेल सस्पेंशन के पिपेट 100 माइक्रोन(1.5 सेमी 2) को निलंबित करें। यह केशिका कार्रवाई के माध्यम से माइक्रोस्लाइड को कवर करता है। यदि यह बहुत धीमी गति से चल रहा है, तो हवा के बुलबुले बन जाएंगे। पाइपिंग करते समय थोड़ा और बल का उपयोग करके हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
      नोट: सेल घनत्व एंडोथेलियल फेनोटाइप को प्रभावित करता है। प्रति चैनल कॉन्फ्ल्यूरेंट कोशिकाओं की कुल1.5 सेमी 2 अधिक आत्मविश्वासी है, क्योंकि चैनल में 0.6 सेमी2का सतह क्षेत्र है। प्रयोग शुरू करने से पहले, चैनलों के भीतर एक और 6 दिनों के लिए इन कोशिकाओं संस्कृति जब तक वे अधिकतम मांगता तक पहुंचने ।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर इनक्यूबेशन के लिए पर्याप्त माध्यम प्रदान करने के लिए चैनल में CECM के एक अतिरिक्त 50 μL जोड़ें। अनबाउंड कोशिकाओं को धोने के लिए अगले दिन माध्यम बदलें।
    5. 6 दिनों के लिए संस्कृति में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रखें ताकि पीएईसी को एक फर्म, कॉन्फ्लोटेंट मोनोलेयर बनाने की अनुमति दी जा सके। सीईसीएम के 150 माइक्रोन के साथ हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
    6. 7 दिन में, ईसीएम में 1 माइक्रोन हिस्टामाइन के 100 माइक्रोन और परख से पहले 30 मिनट के लिए किसी अन्य योजक के बिना 1% एफबीएस के साथ PAEC का इलाज करें। उत्तेजना को विज्ञापन लिबिटमचुना जा सकता है। उदाहरण के लिए, टीएनएफ-α को आमतौर पर भड़काऊ एक्टिवेटर के रूप में इस्तेमाल किया गया है।
  2. कस्टम-मेड माइक्रोफ्लुइडिक फ्लो चैम्बर्स की तैयारी
    नोट: कस्टम-निर्मित प्रवाह कक्षों को उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुकूल बनाया जाता है क्योंकि आयामों और ज्यामिति को आसानी से वरीयता में बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक पोत की नकल करने के लिए, एक स्टेनोसिस(चित्रा 1D)पेश किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण माइक्रोवैस्कुलर रोग में देखे गए बहुत छोटे रक्त खंडों के उपयोग की अनुमति देता है।
    1. पैटर्न वाले वेफर्स का उपयोग करके पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) की नरम लिथोग्राफी
      1. पीडीएमएस इलाज एजेंट और प्रीपॉलिमर को 1:10 अनुपात में माइक्रोबैलेंस पर मिलाएं और एक सामान्य उद्देश्य लैब मिक्सर के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
      2. परिणामस्वरूप हवा के बुलबुले को हटाने के लिए, लगभग 1 घंटे के लिए एक डक्षेर में पीडीएमएस को डेगास करें।
      3. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक ग्लास पेट्री डिश लाइन और लाइन पेट्री डिश में वेफर रखने से पहले पानी की कुछ बूंदों जोड़ें । वेफर कस्टम-मेड चैनल के लिए मोल्ड के रूप में कार्य करता है।
        नोट: वेफर्स या मोल्ड साफ कमरे की सुविधाओं द्वारा प्रदान किए जाते हैं। नकारात्मक फोटोरेसिस्ट को निम्नलिखित विशिष्ट आयामों के साथ फैला हुआ चैनल जैसी विशेषताएं बनाने के लिए वेफर्स पर पैटर्न किया गया है: 300 माइक्रोन चौड़ाई x 270 माइक्रोन ऊंचाई x 14 मिमी लंबाई।
      4. एक गिलास पेट्री डिश में रखा वेफर पर degassed PDMS डालो ।
      5. डेगास पीडीएमएस ने कास्टिंग के दौरान बनने वाले किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए अतिरिक्त 15 मिनट के लिए एक डिसिकेटर में वेफर पर डाला।
      6. मोल्ड और पीडीएमएस युक्त पेट्री डिश को डेसिकेटर से निकालें और पीडीएमएस को क्रॉस-लिंक करने के लिए न्यूनतम 4 घंटे के लिए इसे 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    2. कांच की स्लाइड्स में बॉन्डिंग के लिए क्रॉस लिंक्ड पीडीएमएस की तैयारी
      1. ओवन से मोल्ड और क्रॉस-लिंक्ड पीडीएमएस निकालें और पीडीएमएस की धूल मुक्त हैंडलिंग के लिए क्रॉस-फ्लो हुड में जाएं।
      2. किसी भी पीडीएमएस को स्केलपेल का उपयोग करके मोल्ड के नीचे से हटा दें और मोल्ड से क्रॉस-लिंक्ड पीडीएमएस के शीर्ष स्लैब को हटा दें।
      3. किसी भी धूल कणों को पीडीएमएस चैनलों के संपर्क में आने से रोकने के लिए चिपकने वाले टेप के साथ उजागर पैटर्न वाले पीडीएमएस स्लैब को लाइन करें।
      4. एक बायोप्सी पंच का उपयोग कर आकार और पंच 1 मिमी व्यास inlets और दुकानों के लिए PDMS चिप्स काटें ।
    3. पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक चैनल और ग्लास स्लाइड की नसबंदी और बॉन्डिंग
      1. एसोप्रोपिल अल्कोहल कुल्ला के बाद इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करके ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड साफ करें। प्रत्येक कुल्ला के बाद, एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ स्लाइड अच्छी तरह से सूखी।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, कवर स्लिप का उपयोग किया जा सकता है यदि विश्लेषण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जाता है।
      2. प्लाज्मा चैंबर खोलें और सुरक्षात्मक टेप के बिना साफ माइक्रोस्कोपी स्लाइड और माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स लोड करें।
      3. कक्ष को बंद करें, 1 मिनट के लिए नाइट्रोजन के साथ शुद्ध करें, और कक्ष को फ़िल्टर हवा से भरें जब तक कि 500 मीटर्टर का दबाव न पहुंच जाए।
      4. 50 डब्ल्यू की शक्ति और 5 किलोहर्ट्ज की आवृत्ति का उपयोग करके 40 एस के लिए प्लाज्मा के लिए ग्लास स्लाइड और पीडीएमएस चिप्स का पर्दाफाश करें।
      5. प्लाज्मा के संपर्क में आने के बाद, तुरंत ग्लास स्लाइड और माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को बॉन्ड करें। बाँझ पेट्री व्यंजनों में उपकरणों की दुकान।
  3. माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में एंडोथेलियल मोनोलेयर की सेल सीडिंग
    1. कस्टम निर्मित माइक्रोचैनल को 0.1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन टाइप I या 0.1% जिलेटिन प्रति चैनल के 10 माइक्रोचैनल को कोट करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. चार माइक्रोचैनल बीज के लिए, 25 सेमी2 शांत पैक्स की कोशिश करें और आरटी में 7 मिनट के लिए 300 x g पर नीचे स्पिन करें।
      नोट: कोशिकाओं का केवल एक छोटा सा प्रतिशत सतह का पालन करेगा । इसलिए, एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की अधिकता का उपयोग करना आवश्यक है।
    3. सीसीएम के 20 माइक्रोन में पैक्स को निलंबित करें और प्रत्येक चैनल के लिए 5 माइक्रोन सेल निलंबन का उपयोग करें। छोटे चैनल आयामों के कारण, केशिका बल माइक्रोस्लाइड को भरेंगे और हवा के बुलबुले के गठन को रोकेंगे।
    4. अनबाउंड कोशिकाओं को धोने के लिए 3-4 घंटे के बाद माध्यम बदलें।
    5. कोशिकाओं को 6 दिनों के लिए संस्कृति में रखें ताकि पीएईसी को एक फर्म, कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर बनाने की अनुमति दी जा सके। छोटी मात्रा के कारण, सीईसीएम के 150 माइक्रोन के साथ हर दिन माध्यम बदलें। इनलेट में मीडियम से भरी पिपेट टिप छोड़ दें और आउटलेट में एक खाली टिप डाल दें। यह कोशिकाओं को पर्याप्त पोषक तत्व और विकास कारक प्रदान करने वाले जलाशय के रूप में काम करेगा और स्लाइड को सूखने से रोकेगा।
    6. 7 दिन पर, Hoechst (cECM में 1:5,000) के साथ जीवित कोशिकाओं में नाभिक दाग और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर अधिकतम 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    7. सीईसीएम के साथ 3x को ध्यान से धोएं और परख से पहले 30 मिनट के लिए ईसीएम + 1% एफबीएस में 1 माइक्रोन्म हिस्टामाइन के साथ इलाज करें। उत्तेजना को विज्ञापन लिबिटमचुना जा सकता है। उदाहरण के लिए, टीएनएफ-α को आमतौर पर भड़काऊ एक्टिवेटर के रूप में इस्तेमाल किया गया है।
    8. पीडीएमएस चिप्स के आउटलेट को टयूबिंग से जोड़ने के लिए 1.27 मिमी व्यास 90 डिग्री कोण वाले स्टेनलेस स्टील कनेक्टर्स का उपयोग करें।

3. मानव पूरे रक्त की तैयारी

  1. 0.109 मीटर सोडियम साइट्रेट एंटीकोगुलेंट में विषयों से शिरापूर्ण रक्त ड्रा करें। यह स्वस्थ या रोगग्रस्त विषयों से हो सकता है जिन्हें एंटीकोगुलेशन उपचार प्राप्त नहीं होता है। धीरे-धीरे ट्यूबों को मिलाने के लिए उलटा करें। एक प्रयोग के लिए आवश्यक रक्त की कुल मात्रा मुख्य रूप से चयनित प्रवाह दर पर निर्भर करता है। 25 एमएल/एच की फ्लो रेट के साथ आईबिदी 6-वेल स्लाइड्स में टब और फ्लो चैनल को भरने के लिए थोड़ी अतिरिक्त के साथ 2 एमएल की कुल मात्रा पर्याप्त है ।
  2. रक्त को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और फ्लोरोसेंटली लेबल रक्त कोशिकाओं और एलेक्सा488-फाइब्रिनोजेन (15 माइक्रोग्राम/एमएल) को ऑटोलॉगस फाइब्रिनोजेन को संयुग्मित करने के लिए कैल्सेइन एएम (1:10,000) जोड़ें। रक्त को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने दें ताकि पूर्ण अवशोषण की अनुमति दी जा सके।
  3. प्रयोग शुरू होने से तुरंत पहले पुनर्गणना बफर (154 एमएम सोडियम क्लोराइड, 10.8 एमएम ट्राइसोडियम साइट्रेट, 2.5 एमएम कैल्शियम क्लोराइड, और 2 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड) के साथ रक्त को पतला करें।
    नोट: अधिकतम 50% के साथ हेमोडिलेशन ने जमाव प्रतिक्रिया समय30को प्रभावित नहीं किया। इसके अलावा, मानव रक्त में वायरस और अन्य एजेंट हो सकते हैं। रक्त के नमूनों के साथ काम करना, इसलिए, संक्रमण का खतरा होता है। उचित सुरक्षा उपायों का उपयोग करने और देखभाल के साथ सामग्री को संभालने के लिए अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

4. प्रवाह प्रणाली कोडांतरण

  1. टयूबिंग को जोड़ने से पहले, ट्यूब में रक्त के थक्के को रोकने के लिए वॉश बफर (36 एमएम साइट्रिक एसिड, 103 एमएम सोडियम क्लोराइड, 5 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 5 एमएम ईडीटीए, और 0.35% डब्ल्यूटी/वोल्बाइन सीरम एल्बुमिन [बीएसए], पीएच = 6.5) से भरी 20 एमएल सिरिंज के साथ फ्लो ट्यूब्स को कुल्ला करें।
  2. हेप्स बफर (132 mm सोडियम क्लोराइड) के साथ प्रवाह ट्यूबों को भरने के लिए एक नई सिरिंज का उपयोग करें, 20 एमएमएम एचईपीई, 6 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 1 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड, 1% बीएसए, और 5.5 एमएम डी-ग्लूकोज, पीएच = 7.4) और इसे कोहनी के आकार के ल्यूयर कनेक्टर से मध्यम में ईसी से भरे माइक्रोस्लाइड से सावधानीपूर्वक कनेक्ट करें। माइक्रोचैनल से कनेक्टर्स को संलग्न करते समय, स्लाइड में किसी भी हवा के बुलबुले के गठन को रोकने की कोशिश करें। बुलबुले एंडोथेलियम को नुकसान पहुंचाएंगे और आपके प्रयोग के परिणामों को प्रभावित करेंगे। वॉश बफर को पूरी तरह से हटा दें और बफर को कोशिकाओं के संपर्क में न आने दें, क्योंकि इससे जमावट बाधित होगी।
  3. चित्रा 1Eमें दिखाए गए प्रवाह प्रणाली की स्थापना करें । 20 एमएल सिरिंज में वॉश बफर के 2 एमएल लें और सिरिंज में खून घुसने पर थक्के को रोकने के लिए कुल्ला करें । सिरिंज पंप में खाली सिरिंज डालें और आउटलेट ट्यूब को इस सिरिंज से मादा लूयर कनेक्टर से कनेक्ट करें। तैयार मानव रक्त वाले कंटेनर में इनलेट ट्यूब डालें।
  4. सिरिंज पंप पर स्विच करें और प्रवाह दर की गणना करें। फ्लो प्रोफाइल ऊंचाई में एक पैराबोलिक पैटर्न का पालन करें। यह मानते हुए कि रक्त एक न्यूटोनियन तरल पदार्थ के रूप में कार्य करता है, प्रवाह दर की गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें।
    Equation 1 (समीकरण 1)
    कहां
    1 = कतरनी तनाव Equation 2
    η = गतिशील चिपचिपाहट Equation 3
    Q = वॉल्यूमेट्रिक प्रवाह दर Equation 4
    एच = चैनल ऊंचाई Equation 5
    डब्ल्यू = चैनल चौड़ाई Equation 5
    नोट: 0.4 मिमी ऊंचाई और 3.5 मिमी चौड़ाई के साथ आयताकार आयामों के साथ वाणिज्यिक 6 चैनल माइक्रोस्लाइड में रक्त के साथ फेफड़े की धमनी प्रवाह के लिए, 25 एमएल/एच की मात्रा प्रवाह दर 5 मिनट के लिए उपयोग की जाती थी। कस्टम निर्मित प्रवाह चैनलों के आयामों में अंतर के कारण, ये गतिशीलता भी बदल जाएगी। चर समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि कतरनी तनाव बराबर है ।
  5. 20 एमएल सिरिंज के व्यास को 19.05 मिमी तक परिभाषित करें और कार्यक्रम को वापस लेने के लिए सेट करें। एक नकारात्मक दबाव के आवेदन से सेल लेपित चैनल के माध्यम से रक्त खींच लगातार कतरनी दरों और सेल परत को ंयूनतम क्षति की गारंटी होगी ।

5. छवि अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप की स्थापना

  1. 20x उद्देश्य का उपयोग करें और उल्टे चरण के विपरीत फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के चरण पर माइक्रोस्लाइड रखें। सेल मोनोलेयर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए जेड-दिशा में चरण को स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  2. हर प्रवाह चैनल की शुरुआत, मध्य और अंत में ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का चयन करें। शुरुआत और अंत चैनल के इनलेट और आउटलेट से कम से कम 3 मिमी दूर होना चाहिए। एक लेजर शक्ति और प्रकाश तीव्रता है कि ंयूनतम पृष्ठभूमि से पता चलता है के साथ नीले, हरे, और लाल फ्लोरोसेंट फिल्टर सेट करें ।

6. पैक्स पर पूरे खून का परफ्यूजन

  1. सब कुछ चित्रा 1E के रूप में जुड़ा हुआ है और माइक्रोस्कोप रिकॉर्डिंग के लिए तैयार है, एक वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए पुश शुरू करें। एंडोथेलियम पर रक्त को छिद्रित करने के लिए सिरिंज पंप पर पुश स्टार्ट करें।
  2. जैसे ही रक्त एंडोथेलियम पर बहने लगता है, पूर्वचयनित सक्रिय चैनलों और आरओआई के साथ छवियों को प्राप्त करें जो हर 15 एस को 5 मिनट के लिए प्राप्त करते हैं।
  3. 5 मिनट के परफ्यूजन के बाद, रिकॉर्डिंग खत्म करें और सिरिंज पंप को बंद करें। प्रवाह कक्ष को अलग करें और बहुत सावधानी से ट्यूबिंग को हटा दें। अक्सर, एक हवा बुलबुला बनेगी यदि यह बहुत अधिक बल के साथ किया जाता है। इसे रोकने की कोशिश करें, क्योंकि यह एंडोथेलियम को दूर कर देगा।

7. निर्धारण और विश्लेषण के बाद

नोट: पर्फ्यूजन प्रयोग के कारण एंडोथेलियल क्षति द्वारा झूठी सकारात्मक प्लेटलेट आसंजन को बाहर करने के लिए, उनके अंतर गठन और मोनोलेयर के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं की विशेषता होना आवश्यक है। यह वीई-कैडेरिन के लिए नियमित इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा किया जा सकता है।

  1. टयूबिंग के पर्फ्यूजन और अलग होने के बाद, हेप्स के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल धोएं। चैनल में पिपेट HEPES इतना है कि यह दुकान के लिए रक्त धक्का होगा । एक और पिपेट के साथ अतिरिक्त निकालें।
    1. वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन सुपरनेट की वर्षा को रोकने के लिए पीबीएस++ (0.5 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड और 0.9 एमएम कैल्शियम क्लोराइड के साथ) के साथ चैनल धोएं। इससे बैकग्राउंड कम होता है। हालांकि, एक अतिरिक्त धोने का कदम सेलुलर व्यवहार और आकृति विज्ञान को बदल सकता है जो विश्लेषण के बाद इमेजिंग को प्रभावित कर सकता है।
  2. HEPES निकालें और पालन प्लेटलेट्स के साथ एंडोथेलियम को ठीक करें और 37 डिग्री सेल्सियस गर्म 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) को चैनल में और आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके फाइब्रिन जमा करें।
    नोट: कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक्स को ठीक करते समय अतिरिक्त सावधानी बरतें क्योंकि ये चैनल और भी छोटे होते हैं, जो हर हैंडलिंग चरण के दौरान चैनल में उच्च कतरनी बलों का कारण बनता है।
  3. चैनल से पीएफए निकालें और पीबीएस के साथ 3x धो लें। माइक्रोस्लाइड अब एक मानक धुंधला प्रोटोकॉल के लिए तैयार हैं, जैसे कि वीई-कैडेरिन, सीडी31, पी-सेलेक्टिन या इंटीग्रीन, अनुयायी प्लेटलेट्स के लिए सीडी 42b, या ल्यूकोसाइट्स के लिए सीडी 45 जैसे एंडोथेलियल सेल मार्कर की विशेषता है।
  4. धुंधला होने के बाद, कोलोकैलाइजेशन की विशेषता के लिए नियमित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कम से कम पांच छवियां लें।

8. छवि विश्लेषण

  1. एक प्रवाह परख छवि खोलें जिसमें या तो फ्लोरोसेंटी लेबल प्लेटलेट्स या इमेजजे में फ्लोरोसेंट फिब्रिन लेबल किया जाता है। इमेजजे के लिए पसंद की छवि खींचें।
  2. छवि आरजीबी रंग में लिया गया है। विश्लेषण के लिए, एक 8-बिट छवि पसंद की जाती है, इसलिए छवि को 8-बिट में बदलें: छवि । टाइप । 8-बिट।
  3. पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, एक स्लाइडिंग पैराबोलोइड के साथ घटाएं, जहां एक रोलिंग बॉल स्थानीय रूप से मूल छवि से पृष्ठभूमि पिक्सेल की गणना और घटाती है: प्रक्रिया । घटाना पृष्ठभूमि । रोलिंग बॉल रेडियस = 50 पिक्सल । फिसलने पैराबोलॉइड।
    नोट: छवि का आकार पिक्सल में परिभाषित किया गया है। हालांकि, क्षेत्र को मापने के लिए, पैमाने को निर्धारित करना आवश्यक है। जब छवियों को 0.45 के संख्यात्मक अपर्चर के साथ 20x उद्देश्य के साथ लिया जाता है, तो माइक्रोस्कोप में 2 पिक्सल प्रति माइक्रोन का पैमाना होता है। पैमाने को सेट करने के लिए आवश्यक जानकारी अधिकांश छवि के मेटाडेटा में संग्रहीत की जाती है और स्वचालित रूप से इमेजजे द्वारा उपयोग की जा सकती है: विश्लेषण करें । सेट स्केल।
  4. पालन प्लेटलेट्स या जमा फाइब्रिन को परिभाषित करने के लिए एक सीमा निर्धारित करें। त्रिकोण विधि का उपयोग करें और सीमा स्वचालित रूप से समायोजित हो जाएगी: छवि । समायोजित करें । दहलीज।
  5. विश्लेषण कणों कमान के साथ प्लेटलेट्स या फाइब्रिन द्वारा कवर क्षेत्र का विश्लेषण करें। 2-इन्फिनिटी पर आकार सेट करें, क्योंकि प्लेटलेट का न्यूनतम आकार 2 माइक्रोन है: विश्लेषण करें। कणों का विश्लेषण करें।
  6. परिणाम माइक्रोन2में कुल क्षेत्र प्रदान करेगा, जिसमें μm2 में कुल आकार और कवर क्षेत्र का प्रतिशत होगा।

Representative Results

प्रतिनिधि परिणामों को तीन भागों में विभाजित किया जा सकता है, प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटअप, डेटा संग्रह और डेटा विश्लेषण के संबंधित चरणों का प्रतिनिधित्व करता है। शोध प्रश्न के आधार पर, प्रत्येक चरण के लिए मापदंडों को बदला जा सकता है। प्रस्तुत किए गए डेटा को थ्रोम्बस गठन पर एंडोथेलियम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जाता है।

प्रायोगिक सेटअप
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि एंडोथेलियल कोशिकाएं स्वास्थ्य और रोग23के दौरान स्थान और समय के आधार पर संरचना और कार्य में अत्यधिक विषम होती हैं। एंडोथेलियल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों का उपयोग एंडोथेलियल-रक्त संपर्क का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो इस मामले में वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एचयूवीसी और पैक्स(चित्रा 1 ए)थे। HUVECs प्रयोगशाला मॉडल में सबसे अधिक इस्तेमाल किया गया है, जबकि पैक्स फेफड़े की धमनियों से रोगी व्युत्पन्न अलग कोशिकाओं रहे हैं । इसके अलावा, पल्मोनरी सर्कुलेशन या रक्त परिसंचरण एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाली कोशिकाओं (ईसीएफसी)25, 28, 29,से माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एमवीईसी) को अलग करने के लिए अच्छी तरह से,स्थापितप्रोटोकॉल उपलब्ध हैं।28

अलगाव के बाद, एंडोथेलियल कोशिकाओं को एक एंडोथेलियल फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए वीई-कैडेरिन, सीडी 31 और TIE2 धुंधला द्वारा विशेषता थी। αSMA और साइटोकेराटिन की उपस्थिति के लिए लक्षण वर्णन एक फाइब्रोब्लास्ट या एपिथेलियल की तरह फेनोटाइप(चित्रा 1B) कीअनुपस्थिति का संकेत दिया । ECs की अत्यधिक शुद्ध आबादी प्राप्त करने के बाद, मार्ग 3-5 कोशिकाओं का उपयोग या तो एक वाणिज्यिक माइक्रोस्लाइड या कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक फ्लो चैनल(चित्रा 1C)को बीज करने के लिए किया जाता था। जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्लाइड मुख्य रूप से समानांतर प्रवाह कक्ष, या वाई-आकार के चैनल हैं, जो ऊंचाई या विभाजन कोण में विशेष रूप से परिभाषित मापदंडों के साथ हैं, माइक्रोफ्लुइडिक स्लाइड्स के उपयोग से प्रयोगात्मक मापदंडों को वीवो पोत ज्यामिति और रक्त प्रवाह गतिशीलता31में अनुकूलित करना संभव हो जाता है। हालांकि, कस्टम-मेड माइक्रोफ्लुइडिक आकार छोटे होते हैं और सेल के प्रसार को सीमित करते हैं और अधिक सेल डेथ32,,33को प्रेरित करते हैं। कोशिकाओं के अधिशेष का उपयोग इस तथ्य के लिए क्षतिपूर्ति करता है कि कोशिकाओं का केवल एक छोटा प्रतिशत पालन करेगा। यह तब देखा गया था जब एक स्टेनोसिस पेश किया गया था, जहां एंडोथेलियल कोशिकाओं ने समानांतर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल(चित्रा 1D)की तुलना में अधिक विस्तारित फेनोटाइप दिखाया। वाणिज्यिक प्रवाह कक्षों में एक बड़ा सतह क्षेत्र होता है जिसे कोशिकाएं बांध सकती हैं। इसके लिए सीडिंग के लिए कम सेल नंबर की जरूरत होती है।

एंडोथेलियल सेल-रक्त संपर्क का अध्ययन करने के लिए, पूरे रक्त को एंडोथेलियल मोनोलेयर पर लगाया गया था। सिटरेटेड रक्त प्रयोग के दिन एकत्र किया गया था और तुरंत पहले पर्फ्यूजन अड़ियल । कोशिकाओं को हिस्टामाइन के साथ प्रेरित किया गया ताकि परफ्यूजन से 30 मिनट पहले वीडब्ल्यूएफ रिलीज और प्लेटलेट आसंजन को प्रेरित किया जा सके (चित्रा 1E)34, 35,35 छोटे आयामों के कारण, कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों ने छोटे रक्त की मात्रा के उपयोग की अनुमति दी।

डेटा संग्रह
पैक्स पर थ्रोम्बस गठन की जांच करने के लिए, कैल्सेइन एएम-रेड फ्लोरोसेंटली लेबल रक्त कोशिकाओं और Alexa488-conjugated फिब्रिन को 5 मिनट के लिए 2.5 dyne/सेमी 2(चित्रा 2A-C)पर5 मिनट के लिए प्रेरित किया गया।C अनुयायी रक्त कोशिकाओं और जमा फाइब्रिन की मात्रा निर्धारित की गई थी। छवियों को हर 30 एस का अधिग्रहण किया गया था और ImageJ के साथ मात्रा निर्धारित की गई थी। गैर-अध्ययनित प्लेटलेट्स के ऑटोफ्लोरेसेंस को खत्म करने के लिए पृष्ठभूमि को घटाना महत्वपूर्ण था। थ्रेसिंग के लिए त्रिकोण एल्गोरिदम का उपयोग न्यूनतम पृष्ठभूमि को परिभाषित करने के लिए किया गया है। यह छोटे प्लेटलेट समुच्चय(चित्रा 2डी)के माप के लिए अनुमति दी गई ।

अपेक्षित रूप से, गैर-संयोजित परिस्थितियों में, प्लेटलेट्स और फिब्रिन की कोई बाध्यकारी नहीं थी। VWF रिलीज और प्लेटलेट बाध्यकारी को बढ़ावा देने के लिए, पैक्स को हिस्टामाइन के साथ उत्तेजित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप प्लेटलेट आसंजन की तत्काल वृद्धि २.५ मिनट के बाद एक पठार तक पहुंच गई । इस समय, प्लेटलेट्स ने ऑटोक्रिन कारकों को स्रावित करना शुरू कर दिया जो प्लेटलेट एकत्रीकरण और फाइब्रिनोजेन दरार को फाइब्रिन में प्रेरित करते थे। Fibrin 3 मिनट के बाद जमा किया गया था और 4 मिनट(चित्रा 2E)के बाद प्लेटलेट्स के साथ एक स्थिर कुल का गठन किया ।

यह जांच करने के लिए कि क्या इस प्रभाव को प्रत्यक्ष मौखिक एंटीकोगुलैंट (डीओएसी) द्वारा बाधित किया जा सकता है, रक्त का इलाज 10 एनएम डाबीगट्रान के साथ किया गया था। डाबीट्रान को रक्त कमजोर पड़ने में जोड़ा गया था, जहां यह जमाव मार्ग में फैक्टर आईआईए को रोकता है, और फाइब्रिन के दरार को फाइब्रिन फाइबर बनाने के लिए रोका जाता है। जब दाबीगट्रान-इलाज रक्त उत्तेजित पैक्स पर व्याप्त था, तो थक्का गठन को मुख्य रूप से फाइब्रिन जमाव(चित्रा 2F)में देरी करके सीधे बाधित किया जा सकता है।

डेटा विश्लेषण
थ्रोम्बस गठन पर विभिन्न एंडोथेलियल स्रोतों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, 5 मिनट रक्त परफ्यूजन पर सेलुलर परिवर्तनों का विश्लेषण किया गया। एंडोथेलियम को ठीक किया गया था और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग से पहले पालन प्लेटलेट्स सीडी 42b के साथ लेबल किए गए थे। इसने प्लेटलेट्स और फाइब्रिन के कोलोकैलाइजेशन के लिए एक विस्तृत विश्लेषण प्रदान किया जो रक्त में बेकार जमावट कारकों को इंगित कर सकता है। थक्का गठन में चुनाव आयोग का प्रभाव मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला द्वारा निर्धारित किया गया था। एंडोथेलियल सेल-सेल संपर्कों को बनाए रखा गया था, जैसा कि वीई-कैडेरिन स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई थी, यह दर्शाता है कि एंडोथेलियल अंतराल(चित्रा 3)के बीच अंतर्निहित मैट्रिक्स के बजाय एंडोथेलियल मोनोलेयर के शीर्ष पर बने रक्त के थक्के। इसके अलावा, विभिन्न सेल स्रोतों के उपयोग के परिणामस्वरूप एंडोथेलियम पर थ्रोम्बी के विभिन्न पैटर्न बन गए। HUVECs शिराशील एंडोथेलियल कोशिकाओं रहे है और सीमित प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन बयान दिखाया, जबकि CTEPH रोगियों से रोगग्रस्त प्राथमिक PAEC स्वस्थ PAEC की तुलना में हिस्टामाइन उत्तेजना पर प्रचुर मात्रा में प्लेटलेट आसंजन और अधिक फाइब्रिन बयान दिखाया । इससे पता चलता है कि सीटीईपीएच रोगियों का एंडोथेलियम वासोएक्टिवेशन के प्रति उच्च जवाबदेही दिखाता है जिसके परिणामस्वरूप थ्रोम्बस गठन में वृद्धि होती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। (क)विभिन्न स्त्रोतों और विभिन्न प्रकार के एंडोथेलियल कोशिकाओं को परफ्यूजन प्रयोगों के लिए माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह चैनल में उपयोग के लिए अलग-थलग और सुसंस्कृत किया गया था । विभिन्न प्रकार की एंडोथेलियल कोशिकाओं की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। स्केल बार = 50 माइक्रोन(बी)अलग कोशिकाओं को एंडोथेलियल फेनोटाइप की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग की विशेषता थी। स्केल बार = 50 माइक्रोन (सी)कोशिकाओं को या तो वाणिज्यिक प्रवाह स्लाइड या कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में वरीयता दी जा सकती है। (घ)विभिन्न चैनल ज्यामिति में उगाए जाने वाले एचयूवीईसी की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। स्केल बार = 50 माइक्रोन(ई)रक्त परफ्यूजन प्रयोगों का प्रायोगिक सेटअप। सिटरेट रक्त एकत्र किया गया था, खारा बफर के साथ पतला, और एक सिरिंज पंप के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं पर perfused । इस आंकड़े में फेफड़े और गर्भनाल नस को सर्वियर मेडिकल आर्ट से संशोधित किया गया था, जो क्रिएटिव कॉमन एट्रिब्यूशन 3.0 जेनेरिक लाइसेंस के तहत लाइसेंस प्राप्त था। http://smart.servier.com/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: छवि अधिग्रहण और थ्रोम्बस गठन का परिमाणीकरण। (A)का पालन किए गए कैल्सेइन एएम-रेड लेबल प्लेटलेट्स की प्रतिनिधि समय-चूक इमेजिंग और एलेक्सा488-संयुग्मित फाइब्रिन को 1, 3 और 5 मिनट पर जमा किया गया, जो बिना स्थिर पैक्स(बी)और हिस्टामिन उत्तेजित पैक्स पर पूरे रक्त के बाद पूरे रक्त के प्रसार के बाद है । (ग)प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन जमाव की प्रतिनिधि समय-चूक छवियां 1, 3 और 5 मिनट पर परफ्यूजन के साथ पूरे रक्त के साथ ̈सटमीन के साथ हिस्टामाइन-उत्तेजित पैक्स पर व्याप्त दबी हुई । स्केल बार = 50 माइक्रोन.(D)इमेजजे में छवि क्वांटिफिकेशन का योजनाबद्ध अवलोकन। (ई)एक अउत्तेजित और हिस्टामाइन उत्तेजित एंडोथेलियम पर हर 30 एस के लिए प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन जमाव का मात्राकरण । (च)प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन जमाव द्वारा निर्धारित थ्रोम्बस गठन पर डाबीग्रान के प्रभाव का मात्राकरण। डेटा का प्रतिनिधित्व एसडी, एन = 3 ± मतलब के रूप में किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: एंडोथेलियल कोशिकाओं पर प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन जमाव में थ्रोम्बस गठन की विशेषता के लिए प्रवाह प्रयोगों की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। एंडोथेलियल सेल-सेल संपर्कों को वीई-कैडेरिन द्वारा चित्रित किया गया था और नियंत्रण पैक्स, रोगी-व्युत्पन्न सीटीईएच पैक्स और एचयूवीईसी में मापा गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

जमावट एंडोथेलियम और रक्त घटकों के बीच जटिल और अस्थायी रूप से नियंत्रित परस्पर क्रिया का परिणाम है। यह इन विट्रो परख वास्तविक समय में एंडोथेलियल कोशिकाओं के थ्रोम्बोजेनिक गुणों की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। विभिन्न प्रकार की प्राथमिक मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है, जो एक अंग और रोगी-विशिष्ट तरीके से सीटू थ्रोम्बोसिस में सुविधा प्रदान करते हैं। इस अध्ययन में, हमने इस प्रोटोकॉल के उपयोग को स्पष्ट किया कि स्वस्थ दानदाताओं बनाम सीटीईएच रोगियों से अलग पैक्स के थ्रोम्बोजेनिक गुणों की तुलना की गई है। हिस्टामाइन-सक्रिय एंडोथेलियम पर स्वस्थ विषयों से पूरे रक्त के परफ्यूजन द्वारा लाइव थ्रोम्बस गठन का अध्ययन किया गया था, जबकि एक डोएसी के प्रभाव को एंटीथ्रोम्बोटिक एजेंट के रूप में परीक्षण किया गया था।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोचैनल के उपयोग के अलावा, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की शुरूआत थ्रोम्बस गठन पर संवहनी ज्यामिति परिवर्तनों के प्रभाव के अध्ययन को सक्षम बनाती है। उदाहरण के लिए, एक शाखा बिंदु या स्टेनोसिस पर प्रवाह कम हो जाता है जिसके परिणामस्वरूप कतरनी तनाव में वृद्धि होती है और प्लेटलेट सक्रियण36अधिक होता है। हालांकि, इन कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की एक महत्वपूर्ण सीमा उच्च सेल नंबरों की आवश्यकता है ताकि एसीएस के एक स्थिर मोनोलेयर का निर्माण किया जा सके जैसा कि चरण 2.3.2 में वर्णित है। यह एक सीमित कारक पेश कर सकता है जब रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाएं दुर्लभ होती हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्लाइड की ताकत यह है कि सतह क्षेत्रों को सेल संस्कृति के लिए संशोधित किया जाता है और विकास क्षेत्र बड़े होते हैं, जिससे ईसीएस को एक ढुलमुल और स्थिर मोनोलेयर बनाने की अनुमति मिलती है । दूसरी ओर, एक बड़ी सतह क्षेत्र के परिणामस्वरूप एक बड़ा ल्यूमेन होगा। समीकरण 1के अनुसार, इसके लिए कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक्स की तरह समान प्रवाह दरों तक पहुंचने के लिए उच्च रक्त की मात्रा की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में सुधार लाइव ईसी नुकसान या बाधा अखंडता में परिवर्तन की जांच करने के लिए हो सकता है । इस प्रोटोकॉल में चुनाव आयोग के नुकसान केवल प्रयोग के अंत में मापा जाता है । लाइव ट्रैकिंग के लिए, ईसीएस को एमसीएचरी वीई-कैडेरिन के साथ टैग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए37। हालांकि, चूंकि इसके लिए कुशल वायरस ट्रांसफैक्शन के साथ एक अत्यधिक अनुकूलित प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी, इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट बाधा संवेदन (ईसीआईएस) का उपयोग एंडोथेलियल अखंडता और बाधा कार्य38का अध्ययन करने के विकल्प के रूप में किया जा सकता है। विशेष ईसीआईएस प्रवाह चैनलों पर परफ्यूजन प्रवाह के तहत एंडोथेलियल बैरियर अखंडता की देशांतर निगरानी की अनुमति देता है। ये विशिष्ट ईसीआईएस विशेषताएं एंडोथेलियल बैरियर गुणों और थ्रोम्बस गठन के समानांतर माप के लिए अनुमति देती हैं। समानांतर ईसी बाधा मापन के लिए वैकल्पिक तरीके, विशेष रूप से कस्टम-निर्मित सरणी में परफ्यूसेट में फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस का उपयोग शामिल है, जो ईसी बाधा गुणों के आधार पर ल्यूमेन से बाहर फैलता है।

वर्णित प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि ईसीएस मानव शरीर से हटा दिए जाते हैं और ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर सुसंस्कृत होते हैं, जो एक कठोर, कृत्रिम सब्सट्रेट है। कोशिकाएं अपने जैव भौतिक वातावरण के अनुकूल होती हैं। यह संभवतः प्लेटलेट सक्रियण के लिए एंडोथेलियल प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि प्लेटलेट सक्रियण और दीवार कठोरता39के बीच एक संबंध है। संस्कृति प्लास्टिक के लिए इन रूपांतरों के बावजूद, कोशिकाओं रोग विशिष्ट विशेषताओं है कि नियंत्रण, CTEPH-PAEC, और HUVEC के साथ दिखाया गया है कि रक्त perfusion के 5 मिनट के बाद प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन बयान के विभिन्न पैटर्न डालती के रूप में स्वस्थ दाताओं से प्राप्त ECs के साथ सीधी तुलना में पहचाना जा सकता है रखने के लिए ।

अन्य प्रोटोकॉलों के विपरीत, यह प्रणाली पूरे रक्त का उपयोग करती,है जबकि अन्य प्लेटलेट्स और ल्यूकोसाइट्स19,20,21जैसे एकल रक्त घटक के साथ ईसी इंटरैक्शन का अध्ययन करते हैं।, अधिक उन्नत माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल विकसित किए गए हैं जो एक गोल पोत ज्यामिति और नरम बाहृशल मैट्रिक्स के साथ एक संवहनी मॉडल में एंडोथेलियल फ़ंक्शन के अध्ययन की अनुमति देते हैं। हालांकि, इन्हें एचयूवीसी40,41, 42केसाथ अनुकूलित कियाजाताहै।, वर्णित प्रोटोकॉल की नवीनता प्राथमिक ईसीएस का उपयोग पूरे रक्त के साथ संयुक्त है जो सीटू थ्रोम्बोसिस में मॉडलिंग को वीवो स्थितियों में एक कदम करीब ला रहा है। रोगी-व्युत्पन्न ईसीएस और रोगी-व्युत्पन्न रक्त के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने से विट्रो मेंरोग मॉडलिंग का अनुकूलन होता है, जिससे व्यक्तिगत थ्रोम्बस गठन और दवा उपचार का आकलन होता है।

वर्णित प्रोटोकॉल रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं पर एंटीकोगुलेशन उपचारों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। जब हमने थ्रोम्बस गठन को बाधित करने के लिए डाबीगट्रान का उपयोग किया, तो रिवेरोक्सबान जैसे अन्य एंटीकोगुलेंट का उपयोग करना संभव है, जो सीधे जमाव झरना में कारक Xa को रोकता है। क्लोपिडोग्रेल या एस्पिरिन जैसे प्रत्यक्ष प्लेटलेट अवरोधकों का भी अध्ययन किया जा सकता है, क्योंकि ये हेमेसिस के प्राथमिक चरण पर कार्य करते हैं जहां प्लेटलेट्स ईसीएस से बांधते हैं। अंततः, रोगी के अपने रक्त के साथ बातचीत में रोगी-विशिष्ट ईसीएस की थ्रोम्बोजेनिक क्षमताओं का उपयोग व्यक्तिगत रोगी पर एंटीकोगुलेशन थेरेपी के व्यक्तिगत प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट प्रोटीन का नॉकआउट अतिरिक्त कार्यात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है।

वर्णित प्रोटोकॉल में कुछ कदम हैं जो एक सफल पर्फ्यूजन प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव के दौरान, अत्यधिक शुद्ध ईसी संस्कृति प्राप्त करना आवश्यक है। दूसरा, यह महत्वपूर्ण है कि ईसीएस एक स्थिर कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर बनाते हैं। यदि ऐसा नहीं है, तो कतरनी तनाव में मामूली परिवर्तन एंडोथेलियल क्षति और जमाव झरना की सक्रियता का कारण बन सकता है, या प्लेटलेट्स तहखाने झिल्ली के लिए बाध्यकारी शुरू कर सकते हैं, जो झूठे सकारात्मक परिणाम प्रदान करेगा। तीसरा, हवा के बुलबुले को रोकना आवश्यक है, क्योंकि वे एंडोथेलियम को नुकसान पहुंचा सकते हैं और इस तरह परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं।

कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड के साथ सिटरेटेड रक्त की पुनर्गणना के बाद, तुरंत परफ्यूजन प्रयोग शुरू करना महत्वपूर्ण है। पुनर्गणना प्लेटलेट सक्रियण और थ्रोम्बस गठन में तेजी से प्रतिक्रिया लाती है, जिसके परिणामस्वरूप नमूने में तेजी से थक्का बनता है।

अंत में, हम थ्रोम्बोसिस के दौरान पूरे रक्त-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक बहुमुखी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम प्लाज्मा प्रोटीन, सैनक्विन रिसर्च एंड लैंडस्टीनर प्रयोगशाला, एम्स्टर्डम यूएमसी, अकादमिक चिकित्सा केंद्र, एम्स्टर्डम, नीदरलैंड विभाग से जन Voorberg धन्यवाद, इस पांडुलिपि में अपने इनपुट के लिए। इस काम को डच कार्डियोवैस्कुलर एलायंस (डीसीवीए) [2012-08, 2014-11] द्वारा समर्थन दिया गया था, जो फएड्रा और रिकनेक्ट कंसोर्टियम के साथ-साथ फएड्रा इम्पैक्ट कंसोर्टियम को दिए गए आवेग अनुदान 2018 को सम्मानित किया गया था। इन अनुदानों में डच हार्ट फाउंडेशन, डच फेडरेशन ऑफ यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर्स, नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर हेल्थ रिसर्च एंड डेवलपमेंट और रॉयल नीदरलैंड एकेडमी ऑफ साइंसेज द्वारा सामूहिक फंडिंग शामिल है । इसके अलावा, इस काम को उन्नत अनुदान 'वीईसेल' कार्यक्रम (अनुदान संख्या: 669768) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया था। XDM को नीदरलैंड के एम्स्टर्डम के वीयू विश्वविद्यालय मेडिकल सेंटर में कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (आईसीएआर-वीयू) संस्थान के एक शोध अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Merck 106404
20 mL syringe BD 300613
20X objective Olympus N1492900 LUCPLFLN20XPH/0.45
2-Propanol (IPA) Boom 760514555000
Aladdin Syringe Pump Word Precision Instruments AL-4000
Alexa488-Fibrinogen Invitrogen F13191 15 ug/mL
Alexa647-Goat anti Rabbit Invitrogen A21245 1:100
Biopsy punch 1 mm diameter Ted Pella 15110-10
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647
CaCl2 Sigma-Aldrich 21115
Calcein AM-Red Invitrogen C3099 1:1000
CD42b-APC Miltenyi Biotec 130-100-208 1:100
Citric Acid Merck 100244
Collagen Type I, rat tail Corning 354249 0.1 mg/mL
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish Corning 3295
Cross-flow hood Basan
Desiccator Duran 2478269
D-Glucose Merck 14431-43-7
EDTA Invitrogen 15575020
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell 1001
Fibronectin Human Plasma Sigma-Aldrich F0895
Flow tubing ibidi 10831, 10841
Gelatin Merck 104070 0.1%
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 1:1000
micron-Slide VI 0.4 flow chambers ibidi 80606
ImageJ NIH v1.49
KCl Merck 7447-40-7
Lab oven Quincy 10GC
LS720 Fluorescent microscope Etaluma LS720
Luer connector ibidi 10802, 10825 Male elbow connectors, Female tube connectors
MACS magnetic beads (anti-CD144) Miltenyi Biotec 130-097-857 1:5
MgCl2 Sigma-Aldrich M1028
Microscopy slides, 76 x 26 mm Thermo Scientific AAAA000001##12E
Negative photoresist, SU-8 Microchem
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Lonza 13-114E
Paraformaldehyde (PFA) Merck 818715 4% PFA in PBS
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco 15140-122 1%
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-094 no calcium or magnesium
Plasma chamber, CUTE Femto Science
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 Dow 101697
sodium citrate blood collection tubes BD 363048
trisodium citrate Merck 106448
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-045
VE-Cadherin (D87F2)-XP Cell Signaling 2500 1:300

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