Summary
Vi presenterar en in vitro Vaskulär sjukdom modell för att undersöka helblod interaktioner med patient-härledda endotel. Detta system gör det möjligt att studera trombogena egenskaper av primära endotelceller under olika omständigheter. Metoden är särskilt lämpad för att utvärdera in situ-trombogenicitet och antikoagulationsterapi under olika faser av koagulering.
Abstract
Bildandet av blodproppar innebär komplexa interaktioner mellan endotelceller, deras underliggande matris, olika blodkroppar, och proteiner. Endotelet är den primära källan till många av de stora hemostatiska molekyler som styr trombocytaggregation, koagulering och fibrinolys. Även om mekanismen för trombos har undersökts i årtionden, in vitro-studier främst inriktas på situationer av vaskulär skada där subendothelial matris blir utsatt, eller på interaktioner mellan celler med enstaka blodkomponenter. Vår metod tillåter att studera interaktioner mellan helblod och ett intakt, konfluent vaskulärcellsnätverk.
Genom att utnyttja primära mänskliga endotelceller, ger detta protokoll den unika möjligheten att studera påverkan av endotelceller på trombdynamik och ger värdefulla insikter i patofysiologi av trombotisk sjukdom. Användningen av skräddarsydda mikrofluidiska flödeskanaler möjliggör tillämpning av sjukdomsspecifika vaskulära geometrier och modell specifika morfologiska vaskulära förändringar. Utvecklingen av en tromb registreras i realtid och kvantitativt kännetecknas av trombocytadhesion och fibrin nedfall. Effekten av endotelfunktion i förändrad trombusdynamik bestäms genom postanalys genom immunofluorescensfärgning av specifika molekyler.
De representativa resultaten beskriver den experimentella inställning, datainsamling och dataanalys. Beroende på forskningsfrågan kan parametrar för varje avsnitt justeras inklusive celltyp, skjuvhastighet, kanalgeometri, läkemedelsbehandling och postanalysförfaranden. Protokollet valideras genom att kvantifiera trombusbildning på pulmonell gatan endotelet av patienter med kronisk tromboembolic sjukdom.
Introduction
Endotelet bildar det inre cellulära lagret av blodkärl och separerar blod från den omgivande vävnaden. Det har beskrivits som ett dynamiskt organ som aktivt reglerar sin mikro-miljö och svarar på yttre stimuli1. På grund av dess direkt kontakt med flödande blod, är endotelet pivotal i kontrollen av hemostas och trombos och är den primära källan för många av de stora reglerande molekyler som styr trombocytaggregation, koagulation, och fibrinolys2. Friska, icke-inaktiverade endotelceller (EC) producerar flera molekyler som motverkar trombocytaktivering och förhindrar koagulation och trombbildning för att upprätthålla blodflödet, såsom prostacyklin, trombomodulin, eller vävnadsfaktorväghämmare (TFPI)2,3. Detta förhindrar vidhäftning av trombocyter, trombocyaggregation, och trombbildning. Skada eller aktivering av kärlväggen resulterar i en prokoagulant endotel phenotyp som initierar lokaliserad trombocytadhesion och proppbildning2,4. Vid endotelaktivering trombocyter ansluta sig till von Willebrand Factor (VWF), ett multimeriskt protein som frigörs från ECs, eller till exponerade bindningsställen av den underliggande subendothelial matris. Därefter initierar molekylära förändringar i trombocyter och exponeringen för vävnadsfaktor (TF) aktiveringen av koagulationssystemet, vilket inducerar trombbildning genom fibrinpolymerisering5,6. Tillsammans ger den resulterande proppen grunden för sårförslutning genom återdotialisering7. Perturbationer av koagulationssystemet kan resultera i blödningsrubbningar, såsom von Willebrands sjukdom, blödarsjuka, eller trombos, som ofta är följden av en dysreglerad pro- och antitrombotisk balans av den endotel hemostatiska vägen2,3.
Processen för hemostas sker i både arteriell och venös cirkulation. Mekanismerna bakom kranskärlens och venös trombos är dock fundamentalt olika. Medan arteriell trombos, som ses i ischemisk hjärtsjukdom, är mestadels drivs av bristning av en aterosklerotisk plack under förhållanden av hög skjuvning stress, venös trombos mestadels utvecklas i avsaknad av endotel skada i ett tillstånd av stasis8,9,10. En djup ven tromb kan embolize och resa mot lungartärerna, där det orsakar en lungemboli. Detta kan resultera i kroniska vaskulära hinder som leder till betydande nedsatt funktionsförmåga som kan främja utvecklingen av chonic lungsjukdomar inklusive utveckling av kronisk tromboembolic pulmonell hypertoni (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH kännetecknas av förhöjt lungtryck på grund av hinder i lungartärerna av tromboembolikt material efter minst tre månaders antikoagulationsbehandling15. Förutom lungemboli, det är postulerat att pulmonell endothelium ger en prothrombotic miljö i CTEPH som underlättar in situ trombos och kroniska hinder i lungartärerna, orsakar ökningen av blodtrycket som i slutändan kan resultera i hjärtsvikt, om obehandlad16,17.
Under de senaste åren har olika studier lett till utveckling av analyser för att undersöka trombbildning genom att mäta trombocytfunktion och koagulering18. Emellertid, de flesta av dem antingen studera samspelet av helblod med enda extracellulära matris komponenter som kollagener eller fibriner, eller endotelfunktion i samspel med enstaka blodkomponenter, såsom endotel-trombocyt eller endotel-leukocyte interaktion19,20,21,22. Dessa analyser är vanligast utförs med mänskliga navelsven endotelceller (HUVEC), eftersom dessa celler är lätt erhållas. Hemostatiska gener uttrycks dock på ett differentiellt sätt över kärlträdet, kärltyper och organsystem23,24, som gör användningen av HUVECs för att representera endotelceller som är involverade i arteriell trombos eller lungemboli problematiska23.
Förutom EC plasticitet, sjukdomsspecifika hemodynamic förändringar och förändringar i vaskulär morfologi kan främja trombbildning vid den normala endotel25. Högre skjuvhastighet, på grund av lokal vasokonsttriktion eller förändringar i exempelvis kärlgeometri, kan resultera i akut trombbildning, vilket orsakar en stenos som påskyndar upphörande av blodflödet26. Användningen av skräddarsydda mikroengineered flödeskanaler gör det möjligt att specifikt utforma vaskulära geometrier som är representativa för (patho)biologi. På så sätt är det möjligt att studera effekten av lokala biomekaniska krafter på friska eller sjuka EC27.
Det finns antikoagulationsterapier tillgängliga för att rikta olika faser och molekyler i koagulationskaskaden, som alla utgör särskilda risker och fördelar som kan vara specifika för vissa sjukdomar. Tillvägagångssättet för sjukdom modellering som beskrivs i detta dokument är särskilt lämpad att testa effekterna av olika antikoagulation och antiplatelet terapier på trombus dynamik.
Syftet är att presentera en modell för trombos som omfattar primära ECs, vilket ger en mångsidig modell som lämpar sig för analys av olika former av trombos beroende på vilken typ av primära ECs som används. Som en illustration använde vi pulmonal arteriell endotel celler från CTEPH patienter i samspel med hela humant blod som innehåller alla komponenter som deltar i tromb bildas (trombocyter, leukocyter, erytrocyter, koagulationsproteiner och cofactors). Detta tillvägagångssätt kan tillämpas i kommersiella parallella flödeskanaler eller i specialtillverkade mikrofluidiska flödeskanaler med en specifik kärldesign. Som sådan kan modellen så småningom användas i studien av trombbildning och upplösning, för bedömning av inflammatoriska reaktioner vid sjukdomsmodellering, för trombon eller antikoagulationsterapi, och slutligen för personlig medicin.
Denna studie beskriver isolering av primära mänskliga pulmonell gatan endotelceller. För isolering av andra primära mänskliga endotel celltyper, hänvisar vi till tidigare publicerade metoder, inklusive pulmonell mikrovaskulära endotelceller25, mänskliga naveln endotelceller28, och blod cirkulerande endotel koloni bildar celler Figur 1A29.
Protocol
Denna studie har godkänts av den institutionella Medical Ethical Review Board i VU Medical Center Amsterdam, Nederländerna (METC VUmc, NL69167.029.19). Primär cellisolering och blodinsamling av försökspersoner utfördes efter att skriftligt informerat samtycke inhämtats i enlighet med Helsingforsdeklaration.
1. Isolering och kultur av primära humana lungarteriella endotelceller (PAEC)
- Varmt komplett endothelialcellmedium (cECM) kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S), 1% endotelcelltillväxttillägg (ECGS), och 1% nonessential aminosyror (NEAA), i ett vattenbad vid 37 °C. Sterilisera kirurgisk sax, tång, och en skalpell med antingen en 120 °C värme sterilisator eller 70% etanol. Utför isoleringen av PAEC i ett laminärflödesskåp under sterila förhållanden.
- Bestryka en cellbindning med hög affinitet 60 mm cellodling (se Tabell över material) med 2 mL på 5 μg/mL fibronectin och inkubera vid 37 °C i minst 15 min.
- Få pulmonell artär (PA) vävnad från kirurgi (t.ex., lobektomi eller lung endarterectomy), förvara i 4 °C kall sladdbuffert (4 mM kaliumklorid, 140 mM natriumklorid, 10 mM HEPES, 11 mM D-glukos, och 1% P/S, pH = 7.3), och hålla på is tills isolering.
- Isolera endotelceller från PA inom 2 h efter vävnadsborttagning. Ta PA med tärnor och lägg den i en 10 cm Petriskål att tvätta med PBS. Om PA är fortfarande en ring, skär lungartären öppen med sax. Var mycket försiktig så att du inte rör vid kärlets innersta skikt med verktygen, eftersom endotelet lätt skadas och/eller tas bort.
- Ta bort fibronectin från cellodlingsfatet och tillsätt 4 mL cECM medium.
- Ta PA vävnaden med tens och placera den i mediet. Under tiden skrapa försiktigt det inre lagret av kärlet i mediet med en skalpell. Ofta kan lipidansamlingar ses i kärlväggen. Försök att utelämna dessa, eftersom de kommer att påverka cell utväxt.
- Håll cellerna i kultur tills små kolonier av endotelceller börjar dyka upp.
- Byt ut mediet varannan dag. Om fibroblaster förorenar kulturen, rena den med magnetisk affinitet cellseparation för CD144 med en sats, i enlighet med tillverkarens instruktioner (se Tabell över material). Använd tvåkolumnsmetoden för den initiala reningen och enkolonnesmetoden för varje på varandra följande rening. Generellt definieras en kultur ren när flödescytometri detekterar ≤10% förorenande celler.
- Dela celler i förhållanden 1:3 till 1:4 tills tillräckliga PAECs odlas för experimentell användning. När PAECs är färdiga att använda fortsätter du med nästa steg.
- Efter rening behöver primära endotelceller karakteriseras för förekomst av EG-specifika markörer (t.ex., VE-kadherin, CD31, TIE2) och för frånvaron av glatta muskelceller (α-SMA), fibroblast (vimentin), och epitel (cytokeratin) markörer (Figur 1B).
2. Beredning av flödeskammare och PAEC-monoskikt
OBS: Använd beroende på hypotesen antingen de kommersiellt tillgängliga flödeskamrarna (se Tabell över material och figur 1C Alternativ A, steg 2.1 i protokollet) eller en specialtillverkad mikrofluidisk flödeskammare (figur 1C Alternativ B, steg 2.2 i protokollet).
- Cellsådd av endotelmonolager i kommersiellt tillgängliga mikroslider
OBS: Kommersiellt tillgängliga flödeskammare är enkla att använda och ger ett laminär flödesmönster i hela kanalen som kan användas vid höga skjuvhastigheter. Dessa mikroslider är utformade för att möjliggöra flerkanaliga parallella körningar och ger en korrekt och reproducerbar flödesprofil. Eftersom de är optimerade för inverterad mikroskopi, är det möjligt att fånga högkvalitativa fluorescerande bilder. Vidare finns olika dimensioner av flödeskammare i olika kanalstorlekar eller geometrier. De 6-väl flödeskanaler är att föredra för denna analys eftersom dessa microslides har små dimensioner och tillåter multiparallel körningar.- För att belägga en kanal av en 6-brunnsflödessply (3,5 mm bredd x 0,4 mm höjd x 17 mm längd) använd 30 μL av 0,1% gelatin per kanal och inkubera vid 37 °C i minst 15 min.
- För att så en kanal, trypsinize 10 cm2 av confluent PAECs och snurra ner på 300 x g för 7 min vid rumstemperatur (RT).
- Suspendera PAECs i 600 μL av cECM och pipetter 100 μL (1,5 cm2 ) av cellupphängning i en kanal. Detta täcker mikroskred genom kapillärverkan. Om det går för långsamt, kommer luftbubblor bildas. Undvik bildandet av luftbubblor genom att använda lite mer kraft vid pipettering.
OBS: Celldensitet påverkar endotel fenotyp. Totalt 1,5 cm2 av konfluenta celler per kanal är överkonfluens, eftersom kanalen har en yta på 0,6 cm2. Innan du startar experimentet, kultur dessa celler för ytterligare 6 dagar inom kanalerna tills de når maximal konfluency. - Tillsätt ytterligare 50 μL cECM till kanalen för att ge tillräckligt medium för inkubation över natten vid 37 °C, 5 % CO2. Ändra mediet nästa dag för att tvätta bort obundna celler.
- Håll cellerna i kultur i 6 dagar vid 37 °C, 5% CO2 så att PAEC att bilda en fast, konfluent monolayer. Byt medium varannan dag med 150 μL cECM.
- Vid dag 7, behandla PAEC med 100 μL av 1 μM histamin i ECM och 1% FBS utan några andra tillsatser i 30 min före analysen. Den stimulans kan väljas ad libitum. TNF-α till exempel vanligt förekommande som inflammatorisk aktivator.
- Beredning av specialtillverkade mikrofluidiska flödeskammare
OBS: Specialtillverkade flödeskammare är anpassade efter användarens behov eftersom dimensionerna och geometrierna enkelt kan ändras till preferens. För att efterlikna ett mer fysiologiskt relevant kärl kan till exempel en stenos införas (Figur 1D). Detta tillvägagångssätt möjliggör användning av mycket små blodvolymer som ses vid mikrovaskulär sjukdom.- Mjuklitografi av polydimetylsiloxan (PDMS) med hjälp av mönstrade rån
- Kombinera PDMS härdningsmedel och prepolymer på en mikrobalans vid förhållandet 1:10 och blanda noggrant med en labbmixer för allmänna ändamål.
- För att ta bort de resulterande luftbubblorna avgasar du PDMS-na i en exsiccator i ungefär 1 h.
- Linje ett glas Petriskål med aluminiumfolie och tillsätt några droppar vatten innan du placerar wafer i den fodrade Petriskålen. Rånen fungerar som mögel för den skräddarsydda kanalen.
OBS: De rån eller formar tillhandahålls av renrum anläggningar. Negativ fotoresist är mönstrad på wafers för att skapa utskjutande kanalliknande funktioner med följande typiska mått: 300 μm bredd x 270 μm höjd x 14 mm längd. - Häll de avgasade PDMS på rån placeras i ett glas Petriskål.
- Degas PDMS hällde på wafer i en desiccator för ytterligare 15 min för att ta bort eventuella bubblor som kan ha bildats under gjutning.
- Ta bort Petri-skålen som innehåller formen och PDMS från exsiccator och placera den i en 60 °C ugn i minst 4 h för att korslänka PDMS.
- Beredning av tvärbunden PDMS för bindning till glasglas
- Ta bort mögel och tvärkopplade PDMS från ugnen och flytta till en tvärflödeshuva för dammfri hantering av PDMS-na.
- Ta bort alla PDMS från botten av formen med hjälp av en skalpell och ta bort den översta platta av tvärlänkade PDMS från formen.
- Linje den exponerade mönstrade PDMS-plattan med tejp för att förhindra att dammpartiklar kommer i kontakt med PDMS-kanalerna.
- Skär PDMS-spånen till storlek och stansa 1 mm diameter inlopp och utlopp med hjälp av en biopsistans.
- Sterilisering och bindning av PDMS mikrofluidiska kanaler och glasglas
- Rena glasmikroskopiglas genom att skölja noggrant med etanol följt av en isopropylalkoholsköljning. Efter varje sköljning torkar du noggrant objektglasen med en kvävepistol.
OBS: Alternativt kan täckslir användas om analysen utförs med hjälp av konfokalmikroskop. - Öppna plasmakammaren och ladda de rengjorda mikroskopipjälorna och mikrofluidiska spånor utan skyddstejpen.
- Stäng kammaren, rensa med kväve i 1 min, och fyll kammaren med filtrerad luft tills ett tryck på 500 mTorr nås.
- Exponera glasglasen och PDMS-chipsen för plasman i 40 s med hjälp av en effekt på 50 W och en frekvens på 5 kHz.
- Efter exponering för plasma, omedelbart binda glaset diabilder och mikrofluidiska chips. Förvara enheterna i sterila petriskålar.
- Rena glasmikroskopiglas genom att skölja noggrant med etanol följt av en isopropylalkoholsköljning. Efter varje sköljning torkar du noggrant objektglasen med en kvävepistol.
- Mjuklitografi av polydimetylsiloxan (PDMS) med hjälp av mönstrade rån
- Cellsådd av endotelmonolager i mikrofluidiska kanaler
- Bestryk den specialtillverkade mikrokanalen genom pipettering av 10 μL på 0,1 mg/mL kollagen Typ I eller 0,1% gelatin per kanal och inkubera vid 37 °C i 30 min.
- För att så fyra mikrokanaler, trypsinize 25 cm2 av confluent PAECs och snurra ner på 300 x g för 7 min vid RT.
OBS: Endast en liten andel av cellerna kommer att hålla sig till ytan. Därför är det nödvändigt att använda ett överskott av celler för att uppnå en konfluent monolayer. - Suspendera PAECs i 20 μL av cECM och använd 5 μL cell suspension för varje kanal. På grund av de små kanaldimensionerna kommer kapillärkrafterna att fylla mikroskreden och förhindra luftbubblabildning.
- Byt medium efter 3–4 h för att tvätta obundna celler.
- Håll cellerna i kultur i 6 dagar så att PAEC att bilda en fast, konfluent monolayer. På grund av den lilla volymen, ändra mediet varje dag med 150 μL cECM. Låt pipettspetsen fyllas med medium i inloppet och sätt en tom spets i utloppet. Detta kommer att fungera som en reservoar som ger tillräckligt med näringsämnen och tillväxtfaktorer till cellerna och förhindra att bilden torkar ut.
- På dag 7, färga kärnorna i de levande cellerna med Hoechst (1:5,000 i cECM) och inkubera i högst 10 min vid 37 °C och 5% CO2.
- Tvätta försiktigt 3x med cECM och behandla med 1 μM histamin i ECM + 1% FBS i 30 min före analysen. Den stimulans kan väljas ad libitum. TNF-α till exempel vanligt förekommande som inflammatorisk aktivator.
- Använd 1,27 mm diameter 90° vinklade rostfritt stålkontakter för att ansluta utloppet av PDMS-spånen till slangar.
3. Beredning av humant helblod
- Dra venöst blod från försökspersoner i 0,109 M natriumcitrat antikoaguleringsmedel. Detta kan vara från friska eller sjuka försökspersoner som inte får antikoagulationsbehandling. Försiktigt invertera rören att blanda. Den totala mängden blod som krävs för ett experiment beror huvudsakligen på den valda flödeshastigheten. Med en flödeshastighet på 25 mL/h, i ibidi 6-brunnsglas, räcker det med en total volym på 2 mL med lite överskott för att fylla upp baljor och flödeskanal.
- Överför blodet till ett 50 mL-rör och tillsätt Calcein AM (1:10,000) till fluorescerande märka blodkroppar och Alexa488-fibrinogen (15 μg/mL) för att konjugera autolog fibrinogen. Låt blodet inkubera vid 37 °C i 15 min för att möjliggöra fullständig absorption.
- Späd blodet 1:1 med omberäkningsbuffert (154 mM natriumklorid, 10,8 mM trisodiumcitrat, 2,5 mM kalciumklorid, och 2 mM magnesiumklorid) omedelbart före försökets början.
OBS: Hemodilution med högst 50% påverkade inte koagulation reaktionstid30. Vidare kan humant blod innehålla virus och andra medel. Att arbeta med blodprov, därför medför en risk för infektion. Det rekommenderas starkt att använda lämpliga säkerhetsåtgärder och att hantera materialet med omsorg.
4. Montering av flödessystemet
- Innan du ansluter tuberna, skölj flödesrören med en 20 mL-spruta fylld med tvättbuffert (36 mM citronsyra, 103 mM natriumklorid, 5 mM kaliumklorid, 5 mM EDTA, och 0,35% wt/vol bovint serumalbumin [BSA], pH = 6.5) för att förhindra att blodet i rören koagulerar.
- Använd en ny spruta för att fylla flödesrören med HEPES-buffert (132 mM natriumklorid, 20 mM HEPES, 6 mM kaliumklorid, 1 mM magnesiumklorid, 1% BSA, och 5,5 mM D-glukos, pH = 7.4) och anslut den försiktigt med en armbågsformad Luer-kontakt till mikrosliden fylld med EG i medium. Medan du fäster kontakterna på mikrokanalerna, försök att förhindra bildandet av eventuella luftbubblor i bilden. Bubblor kommer att skada endotelet och påverka resultaten av ditt experiment. Ta bort tvättbuffert helt och låt inte bufferten komma i kontakt med cellerna, eftersom detta kommer att hämma koagulering.
- Ställ in flödessystemet enligt bild 1E. Ta upp 2 mL tvättbuffert i en 20 mL-spruta och skölj för att förhindra koagulering när blodet kommer in i sprutan. Sätt i den tomma sprutan i sprutpumpen och anslut utloppsröret med en luerkontakt av hona till denna spruta. Lägg inloppsröret i en behållare som innehåller det förberedda mänskliga blodet.
- Slå på sprutpumpen och beräkna flödet. Flödesprofiler följer ett paraboliskt mönster i höjd. Om man antar att blodet fungerar som en newtonsk vätska, använd följande formel för att beräkna flödeshastigheten.
(ekvation 1)
Där
τ = skjuvning stress
η = dynamisk viskositet
Q = volymetrisk flödeshastighet
h = kanalhöjd
w = kanalbredd
OBS: För pulmonell arteriellt flöde med blod i de kommersiella 6 kanals mikrosliderna med rektangulära dimensioner med 0,4 mm höjd och 3,5 mm bredd användes en volymetrisk flödeshastighet på 25 mL/h i 5 min. På grund av skillnaderna i dimensionerna av de skräddarsydda flödeskanalerna kommer även dessa dynamik att förändras. Justera variablerna för att se till att skjuvningsstressen är lika. - Definiera diametern på 20 mL-sprutan till 19,05 mm och ställ in programmet på Withdraw. Att dra blodet genom den cellbelagda kanalen genom applicering av ett undertryck kommer att garantera konstant skjuvhastighet och minimal skada på celllagret.
(ekvation 1)
5. Ställa in mikroskopet för bildförvärv
- Använd en 20x objektiv och placera mikroskred på scenen av inverterad fas kontrast fluorescerande mikroskop. Starta mikroskopet programvara för att flytta scenen i Z-riktning för att fokusera på cellen monolayer.
- Välj en region av intresse (ROI) i början, mitten och slutet av varje flödeskanal. Början och slutet bör vara minst 3 mm från kanalens inlopp och utlopp. Ställ in de blå, gröna och röda lysrörsfiltren med en lasereffekt och ljusintensitet som visar minimal bakgrund.
6. Perfusion av helblod över PAECs
- Efter allt är ansluten som i figur 1E och mikroskopet är redo för inspelning, tryck Start för att spela in en video. Tryck På Start på sprutpumpen för att genomstända blodet över endotelet.
- Så snart blodet börjar flöda över endotelet, förvärva bilder med de förvalda aktiva kanaler och ROI positioner var 15 s för 5 min.
- Efter 5 min perfusion avslutar du inspelningen och stoppar sprutpumpen. Ta isär flödeskammaren och ta mycket försiktigt bort slangen. Ofta kommer en luftbubbla bildas om detta görs med för mycket kraft. Försök att förhindra detta, eftersom detta kommer att spola bort endotelet.
7. Fixering och efteranalys
OBS: För att utesluta falskt positiva trombocytadhesion av endotel skada på grund av perfusion experimentet är det nödvändigt att karakterisera de endotelceller för deras gapbildning och monolayer. Detta kan göras genom regelbunden immunofluorescens färgning för VE-cadherin.
- Efter perfusion och demontering av slangen, tvätta den mikrofluidiska kanalen med HEPES. Pipett HEPES in i kanalen så att den kommer att driva blodet till utloppet. Ta bort överskottet med en annan pipett.
- Tvätta kanalen som tillval med PBS++ (med 0,5 mM magnesiumklorid och 0,9 mM kalciumklorid) för att förhindra utfällning av proteinsupnatant. Detta minskar bakgrunden. Men en extra tvätt steg kan ändra cellulära beteende och morfologi som kan påverka efter analys bildbehandling.
- Ta bort HEPES och fixera endotelet med vidhäftade blodplättar och deponerade fibrin genom pipettering av 37 °C värmd 4% paraformaldehyd (PFA) i kanalen och inkubera i 15 min vid RT.
OBS: Var extra försiktig när du fixar de specialtillverkade mikrofluidikerna eftersom dessa kanaler är ännu mindre, vilket orsakar högre skjuvkrafter i kanalen under varje hanteringssteg. - Ta bort PFA från kanalen och tvätta 3x med PBS. Mikrosliderna är nu redo för ett standardfärgningsprotokoll för att karakterisera endotelcellsmarkörer som VE-kadherin, CD31, P-selectin eller integrins, CD42b för följetade trombocyter eller CD45 för leukocyter.
- Efter färgning, ta minst fem bilder med en vanlig confocal mikroskop för att karakterisera colocalization.
8. Bildanalys
- Öppna en flödesanalysbild som innehåller antingen fluorescerande märkta trombocyter eller fluorescerande fibrin i ImageJ. Dra bild av val till ImageJ.
- Bilden är tagen i RGB-färg. För analys föredras en 8-bitars bild, så omvandla bilden till 8-bitars: Bild | Typ | 8-bitars.
- För att minimera bakgrunden, subtrahera med en glidande paraboloid, där en rullande boll lokalt beräknar och subtraherar bakgrundspixlar från den ursprungliga bilden: Process | Subtrahera Bakgrund | Rullande bollradie = 50 pixlar | Glidande Paraboloid.
OBS: Bildstorleken definieras i pixlar. För att mäta område är det dock nödvändigt att ställa in skalan. När bilderna är tagna med en 20x målsättning med en numerisk bländare på 0,45, mikroskopet har en skala på 2 pixlar per μm. Merparten av tiden den nödvändiga informationen för att ställa in skalan lagras i metadata för bilden och kan automatiskt användas av ImageJ: Analysera | Ange skala. - Ställ in ett tröskelvärde för att definiera vidhäftade trombocyter eller deponerade fibrin. Använd Triangelmetoden så justeras tröskeln automatiskt: Bild | Justera | Tröskelvärde.
- Analysera det område som omfattas av trombocyterna eller fibrin med kommandot Analysera partiklar. Ställ storlek på 2-Infinity, eftersom den minimala storleken på en trombocyt är 2 μm: Analysera | Analysera Partiklar.
- Resultaten kommer att ge den totala areaen i μm2, med medelstorlek på aggregaten i μm2 och andelen täckt yta.
Representative Results
De representativa resultaten kan delas in i tre delar, som var och en representerar respektive steg för experimentell inställning, datainsamling och dataanalys. Beroende på forskningsfrågan kan parametrar för varje steg ändras. De presenterade uppgifterna tillämpas för att studera endotelens påverkan på trombbildning.
Experimentell inställning
Det är väletablerat att endotelceller är mycket heterogena i struktur och funktion, beroende på plats och tid, under hälsa och sjukdom23. Olika källor till endotelceller kan användas för att studera endotel-blod interaktion, som i detta fall var kommersiellt tillgängliga HUVECs och PAECs (Figur 1A). HUVECs har varit de vanligast förekommande i laboratoriemodeller, medan PAECs är patient-derived isolerade celler från lungartärerna. Vidare finns det väletablerade protokoll tillgängliga för att isolera mikrovaskulära endotelceller (MVEC) från lungcirkulationen eller blod cirkulerande endotelkoloni bildar celler (ECFC)25,28,29.
Efter isolering, endoteliala celler kännetecknades av VE-cadherin, CD31 och TIE2 färgning för att bekräfta en endotel fenotyp. Karakterisering för närvaro av αSMA och cytokeratin indikerade frånvaron av en fibroblast eller epitelliknande fenotyp (Figur 1B). Efter att ha erhållit en mycket ren population av ECs, passage 3–5 celler användes för att utsäde antingen en kommersiell microslide eller skräddarsydda mikrofluidiska flödeskanaler (Figur 1C). Medan de kommersiellt tillgängliga mikrosliderna i första hand är parallella flödeskammare, eller Y-formade kanaler med specifikt definierade parametrar i höjd- eller bifurkationsvinkel, gör användningen av mikrofluidiska diabilder det möjligt att anpassa de experimentella parametrarna till in vivo-kärlgeometri och blodflödesdynamik31. Men specialtillverkade mikrofluidiska storlekar är mindre och tenderar att begränsa cellspridning och framkalla mer celldöd32,33. Att använda ett överskott av celler kompenserar för det faktum att endast en liten andel av cellerna kommer att följa. Detta observerades när en stenos infördes, där endotelceller visade en mer långsträckt fenotyp jämfört med en parallell mikrofluidisk kanal (Figur 1D). Kommersiella flödeskammare har en större yta som celler kan binda till. Detta kräver färre cellnummer för sådd.
För att studera endotel cell-blod interaktion, var helblod perfused över en endotel monolayer. Citrated blod samlades på dagen för experimentet och omedelbart före perfusion omberäknas. Celler stimulerades med histamin för att framkalla VWF frisättning och trombocytadhesion 30 min före perfusion (Figur 1E)34,35. På grund av de små dimensionerna tillät de skräddarsydda mikrofluidiska kanalerna användning av mindre blodvolymer.
Datainsamling
För att undersöka trombbildning på PAECs, Calcein AM-Red fluorescerande märkta blodkroppar och Alexa488-konjugerad fibrin var perfunderade i 5 min vid 2,5 dyne/cm2 (Figur 2A–C). Anhängare blodkroppar och deponeras fibrin kvantifierades. Bilder förvärvades var 30:e s och kvantifierades med ImageJ. det var viktigt att subtrahera bakgrunden för att eliminera autofluorescensen av nonadhered trombocyter. Triangelns algoritm för tröskelvärden har använts för att definiera minimal bakgrund. Det tillät mätning av små aggregat med blodplättar (figur 2D).
Förväntande, under icke-timulerade förhållanden, fanns det ingen bindning av trombocyter och fibrin till endotelet. För att främja VWF frisättning och trombocytbindning stimulerades PAECs med histamin, vilket resulterade i en omedelbar ökning av trombocytadhesion nå en platå efter 2,5 min. Vid denna tid började blodplättar att utsöndra autocrine faktorer som inducerade trombocytaggregation och fibrinogen klyvning i fibrin. Fibrin sattes in efter 3 min och bildade ett stabilt aggregat med trombocyter efter 4 min (Figur 2E).
För att undersöka om denna effekt kunde hämmas av ett direkt oralt antikoaguleringsmedel (DOAC), behandlades blod med 10 nM dabigatran. Dabigatran lades till blodutspädningen, där det hämmar faktor IIa i koagulationsvägen, och förhindrade klyvning av fibrinogen att bilda fibrinfibrer. När dabigatranbehandlat blod perfunderades över stimulerade PAECs kunde proppbildningen hämmas direkt främst genom att fibrindepositionen försenas (Figur 2F).
Dataanalys
För att studera påverkan av olika endotel källor på trombbildning, var de cellulära förändringar på 5 min blod perfusion analyseras. Endotelet var fast och vidhäftande trombocyter var märkta med CD42b innan bildframställning under en confocal mikroskop. Detta gav en detaljerad analys för colocalization av trombocyter och fibrin som kan tyda dysfunktionella koagulationsfaktorer i blodet. Påverkan av EG i clot bildning fastställdes av standard immunofluorescerande färgning. Endothelial cell-cell kontakter bibehölls, vilket bekräftas av VE-cadherin färgning,anger att blodpropparna bildas ovanpå endotel monolayer snarare än på den underliggande matrisen i mellan endotel luckor (Figur 3). Vidare resulterade användningen av olika cellkällor i olika mönster av thrombi bildas på endotelet. HUVECs är venous endotelceller och visade begränsad trombocytadhesion och fibrin nedfall, medan sjuka primära PAEC från CTEPH patienter visade riklig trombocytadhesion och mer fibrin nedfall på histamin stimulering jämfört med friska PAEC. Detta tyder på att endotlet av CTEPH patienter visar högre lyhördhet för vasoactivation som resulterar i ökad tromb bildas.
Bild 1: Schematisk översikt över protokollet. (A) Olika källor och olika typer av endotelceller isolerades och odlade för användning i en mikrofluidisk flödeskanal för perfusionsexperiment. Representativa brightfield bilder av olika typer av endotelceller. Skala bar = 50 μm. (B) Isolerade celler kännetecknades av immunofluorescerande färgning för att bekräfta en endotel fenotyp. Skala bar = 50 μm. (C) Celler kan sås i antingen kommersiella flödesglas eller specialtillverkade mikrofluidiska kanal. (D) Representativa brightfield bilder av HUVEC odlas i olika kanal geometrier. Skala bar = 50 μm. (E) Experimentell inställning av blodperfusion experiment. Citrated blod samlades, späds med saltlösning buffert, och perfused över endotelceller med en spruta pump. Lungan och umbilical ven i denna siffra ändrades från Servier Medical Art, licensierad enligt en Creative Common Attribution 3.0 Generic Licence. http://smart.servier.com/ Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Bildförvärv och kvantifiering av trombbildning. (A) Representativa time-lapse imaging av följs Calcein AM-Red märkta trombocyter och deponeras Alexa488-konjugerade fibrin på 1, 3, och 5 min efter helblod perfusion över ostimulerade PAECs (B) och över histamin stimuleras PAECs. (C) Representativa tidsförloppsbilder av trombocytadhesion och fibrindeposition vid 1, 3, och 5 min perfusion med helblod som inkuberas med dabigatran perfunderad över histaminssockrande PAECs. Skala bar = 50 μm. (D) Schematisk översikt av bildkvantifiering i ImageJ. (E) Kvantifiering av trombocytadhesion och fibrindeposition för varje 30-tal på ett ostimulerat och histaminstimulerat endotel. (F) Kvantifiering av effekten av dabigatran på trombbildning kvantifierad genom trombocytadhesion och fibrindeposition. Data representeras som medelvärde ± SD, n = 3. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa konfokala bilder av flödesexperiment för att karakterisera trombbildning i trombocytadhesion och fibrindeposition på endotelceller. Endothelial cell-cell kontakter kännetecknades av VE-cadherin och mäts i kontroll PAECs, patient-härledda CTEPH PAECs och HUVEC. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
Koagulation är ett resultat av det komplexa och tidsmässigt kontrollerade samspelet mellan endotel och blodkomponenter. Denna in vitro-analys presenterar en metod för att undersöka trombogena egenskaper hos endotelceller i realtid. Olika typer av primära mänskliga endotelceller kan användas, underlätta in situ trombos på ett organ och patient-specifika sätt. I denna studie illustrerade vi användningen av detta protokoll jämföra thrombogenic egenskaper PAECs isolerade från friska givare kontra CTEPH patienter. Levande trombbildning studerades genom perfusion av helblod från friska försökspersoner över histaminaktiverat endotel, medan effekten av en DOAC testades som ett antitrombotiskt medel.
Förutom användning av kommersiellt tillgängliga mikrokanaler, som visas i de representativa resultaten, införandet av de skräddarsydda mikrofluidiska kanaler möjliggör studiet av påverkan av vaskulär geometri förändringar på trombbildning. Till exempel, flöde minskar vid en gren punkt eller stenos resulterar i en ökning av skjuvning stress och mer trombocytaktivering36. En betydande begränsning av dessa specialtillverkade mikrofluidiska kanaler är dock kravet på höga celltal för att bilda ett stabilt monoskikt av EC enligt beskrivningen i steg 2.3.2. Detta kan innebära en begränsande faktor när patient-härledda celler är knappa. De kommersiellt tillgängliga mikroslides styrkor är att ytområden modifieras för cellkultur och tillväxtområden är större, vilket gör det möjligt för ECs att bilda ett konfluent och stabilt enskikt. Å andra sidan kommer en större yta att resultera i en större lumen. Enligt ekvation 1, Detta kräver högre blodvolymer för att nå liknande flödeshastigheter som i den skräddarsydda mikrofluidik.
En förbättring av detta protokoll skulle kunna vara att undersöka levande EG-förlust eller förändringar i barriärintegritet. EC-skador i detta protokoll mäts endast i slutet av experimentet. För livespårning kan ECs märkas med mCherry VE-cadherin, till exempel37. Men eftersom detta skulle behöva ett mycket optimerat protokoll med effektiv virustransfektion, elektriska cell-substrat Impedance Sensing (ECIS) skulle kunna användas som ett alternativ för att studera endotel integritet och barriärfunktion38. Perfusion över särskilda ECIS flöde kanaler tillåter längsgående övervakning av endotel barriär integritet under flöde. Dessa specifika ECIS funktioner möjliggör parallella mätningar av endotel barriäregenskaper och trombbildning. Alternativa sätt för parallella EG barriärmätningar, särskilt i de skräddarsydda matriserna inkluderar användning av fluorescerande dextrans i perfusatet, som diffus ut ur lumen, beroende på EG barriäregenskaper.
En begränsning av det beskrivna protokollet är att ECs avlägsnas från människokroppen och odlade på vävnadskulturplast, som är ett styvt, artificiellt substrat. Celler anpassar sig till sin biofysiska miljö. Detta skulle eventuellt kunna påverka endotelrespons på trombocytaktivering, eftersom det finns ett samband mellan trombocytaktivering och väggstyvhet39. Trots dessa anpassningar till kultur plast, celler hålla sjukdomsspecifika egenskaper som kan identifieras i direkt jämförelse med ECs härrör från friska givare som visas med kontroll, CTEPH-PAEC, och HUVEC som utövade olika mönster av trombocytadhesion och fibrin nedfall efter 5 min blodperfusion.
I motsats till andra protokoll använder detta system helblod medan andra studerar EG-interaktion med en enda blodkomponent som blodplättar och leukocyter19,20,21. Det har varit mer avancerade mikrofluidiska modeller som utvecklats som möjliggör studier av endotelfunktion i en kärlmodell med en rund kärlgeometri och mjuk extracellulär matris. Dessa är dock optimerade med HUVECs40,41,42. Det beskrivna protokollets nyhet är användningen av primära EM i kombination med helblod som för modellering av in situ-trombos ett steg närmare in vivo-förhållanden. Efter att ha optimerat protokollet för användning av patient-derived ECs och patient-härledda blod ytterligare optimerar sjukdom modellering in vitro, gör det möjligt att bedömningen av personlig tromb bildas och läkemedelsbehandling.
Det beskrivna protokollet kan tillämpas för att studera effekten av antikoagulationsterapier på patient-härledda celler. Medan vi använde dabigatran för att hämma trombbildningen är det möjligt att använda andra antikoagulantia, såsom rivaroxaban, som direkt hämmar faktor Xa i koaguleringskaskaden. Direkt-trombocythämmare som klpidogrel eller acetylsalicylsyra kan studeras också, eftersom dessa verkar på den primära fasen av hemostas där blodplättar binder till ECs. I slutändan kan den trombogena kapastiteten hos patientspecifika ECs i interaktion med patientens eget blod användas för att förutsäga den personliga effekten av antikoagulationsbehandling på den enskilda patienten. Vidare kan en knockdown av specifika proteiner ge ytterligare funktionell information.
Det finns vissa steg i det beskrivna protokollet som är avgörande för ett lyckat perfusionsexperiment. Först, under isoleringen av primära celler, är det nödvändigt att få en mycket ren EG-kultur. För det andra är det viktigt att de ec bildar ett stabilt konfluent monolayer. Om detta inte är fallet, en liten förändring i skjuvning stress kan orsaka endotel skada och aktivering av koagulering kaskad, eller blodplättar kan börja bindning till källaren membranet, som kommer att ge falska positiva resultat. För det tredje är det viktigt att förhindra luftbubblor, eftersom de kan skada endotelet och därigenom påverka resultaten.
Efter omräkning av det citraterade blodet med kalciumklorid och magnesiumklorid är det viktigt att omedelbart starta perfusionsexperimentet. Omberäkning inducerar ett snabbt svar i trombocytaktivering och trombbildning, vilket resulterar i snabb koagulering i provet.
Sammanfattningsvis beskriver vi en mycket mångsidig protokoll för att studera helblod-endotel cell interaktioner under blodpropp.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Jan Voorberg från institutionen för plasmaproteiner, Sanquin Research och Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Nederländerna, för hans insats i detta manuskript. Detta arbete stöddes av den nederländska CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] som tilldelades Phaedra och Reconnect-konsortiet samt impulsbidraget 2018 som tilldelades Phaedra IMPACT-konsortiet. Dessa bidrag inkluderar kollektiv finansiering av den nederländska Heart Foundation, nederländska federationen för University Medical Centers, Nederländerna Organisationen för hälsoforskning och utveckling, och Royal Netherlands Academy of Sciences. Vidare finansierades detta arbete av Europeiska forskningsrådet inom ramen för programmet Advanced Grant 'VESCEL' (Bidragsnummer: 669768). XDM finansieras av ett forskningsanslag från Institutet för CardioVascular Research (ICaR-VU) vid VU University Medical Center, Amsterdam, Nederländerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL syringe | BD | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 100244 | |
| Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 2478269 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 106448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
References
- Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S.
- Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
- Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
- Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
- Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H.
- Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
- Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
- Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
- ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
- Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
- Kim, N. H., et al.
- Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
- Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
- Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
- Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
- Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
- Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
- Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
- Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
- Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
- Aird, W. C.
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
- Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
- Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
- Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
- van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
- Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
- Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
- Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
- McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
- Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
- Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).
