Summary
我们描述了一个协议,一个三维共培养模型的感染气道,使用CFBE41o- 细胞,THP-1 巨噬细胞,和伪多莫纳斯aeruginosa,建立在空气-液体接口。该模型提供了一个新的平台,同时测试抗生素疗效,上皮屏障功能和炎症标记。
Abstract
f治疗肺部感染的Drug研究正在向高复杂性 的预测体外 模型发展。细菌在肺模型中的多方面存在可以重新适应上皮排列,而免疫细胞则协调对微环境中细菌的炎症反应。 虽然在囊性 纤维化的背景下,体内模型一直是测试新的抗感染药物的选择,但它们仍然 不能准确地模仿人类 此类疾病的体内条件和治疗结果。基于 人类细胞 (支气管上皮和巨噬细胞)和相关病原体的受感染气道的复杂体外模型可以弥补这一差距,并有助于将新的抗感染药物转化为临床。为此,建立了人类囊性纤维化支气管细胞系CFBE41o和 THP-1单细胞衍生巨噬细胞的共同培养模型,模拟 了P.aeruginosa 在空气-液体界面(ALI)条件下感染人类支气管粘膜。该模型在七天内建立,并同时评估以下参数:上皮屏障完整性、巨噬细胞迁移、细菌存活和炎症。本协议描述了一个强大且可重复的系统,用于评估药物疗效和宿主反应,该系统可能与发现新的抗感染药物和优化其气溶胶输送到肺部有关。
Introduction
伪多多多酸菌是 囊性纤维化(CF)中的相关病原体,有助于肺组织损伤1。多糖的生产,如藻酸盐和其他粘液外聚糖,协调疾病的进展,这导致顽强的细菌坚持,限制抗生素向细菌的输送,并保护细菌免受宿主免疫系统2。在这种情况下 ,P. aeruginosa从 浮游生物期过渡到生物膜形成是一个关键问题,也促进了抗生素耐受性的发生。
在 CF 的上下文中,鼠标主要用作模型。然而,小鼠不会自发地发展这种疾病与CF突变3的引入。大多数细菌生物膜开发和药物易感性研究是在非生物表面进行的,如培养皿。但是,此方法并不表示体内的复杂性。例如,重要的生物屏障是不存在的,包括免疫细胞以及粘膜上皮。虽然P.aeruginosa对上皮细胞相当有毒,但一些团体已经成功地与人类支气管细胞共同培育了早期的P.aeruginosa生物膜。这些细胞起源于囊性纤维化患者与CFTR突变(CFBE41o-细胞)4,并允许评估抗生素疗效5或评估感染期间CFTR蛋白的纠正6。这种模式被证明可以提高药物疗效的可预测性,此外还能够对药物在药物开发后期阶段失败的问题进行定性。
然而,在肺,粘膜上皮暴露在空气中。此外,存在于气道中的免疫细胞,如组织巨噬细胞,对吸入的病原体或颗粒8起起至关重要的作用。巨噬细胞通过不同的细胞层迁移,到达支气管流明并对抗感染。此外,吸入的药物还必须应付粘液的存在作为肺气血屏障9的附加非细胞元素。事实上,已经开发了几个复杂的三 维 (3D)体外模型,旨在提高 体内的相关性 。联合培养系统不仅增加了药物发现 体外 系统的复杂性,而且能够研究细胞-细胞相互作用。这种复杂性在有关巨噬细胞迁移10、中性粒细胞释放11、粘液在感染中的作用9、上皮细胞对过度损伤的反应等研究中已经得到解决。然而,一个可靠的CF感染 体外 模型,功能在CF的基因突变,暴露在空气中(增加的生理条件),并整合免疫细胞仍然缺乏。
为了弥补这一差距,我们描述了一个协议,用于稳定受感染气道的人类3D共培养。该模型由人类CF支气管上皮细胞和巨噬细胞组成,感染了 P.aeruginosa, 能够代表扩散和免疫屏障。以在相当高的通量下测试抗感染物为目的,利用两种人类细胞系:CFBE41o和 THP-1单细胞衍生巨噬细胞,在井板插入物的渗透滤膜上建立了这种共培养物。此外,为了最终研究气溶胶抗感染剂13的沉积,该模型是在空气-液体界面(ALI)而不是液体覆盖条件(LCC)建立的。
正如我们在这里报告,这个模型不仅允许评估抗生素治疗的细菌生存,而且允许评估细胞毒性,上皮屏障完整性,巨噬细胞转运和炎症反应,这些都是药物开发的基本参数。
该协议结合了两种相关的细胞类型,用于肺气道的吸入治疗:巨噬细胞和CF支气管上皮。这些细胞在可渗透支撑刀片的对面播种,允许细胞暴露在空气中(称为空气-液体接口(ALI)条件)。这种宿主细胞的共培养随后感染了 P.aeruginosa。两个宿主细胞系都是人类起源的:上皮细胞代表囊性纤维化支气管上皮,在CF通道(CFBE41o-)上发生突变,THP-114 细胞是一个特征良好的巨噬细胞状细胞系。在将巨噬细胞样细胞添加到相反的隔间之前,首先允许在井板插入物的上侧形成汇合上皮层。一旦在ALI建立共同培养,系统就接种 了P.aeruginosa。 然后,这种受感染的联合培养系统用于评估抗生素的疗效,例如去布拉霉素。分析了以下终点:跨皮质电阻(TEER)、细胞和细胞-细菌相互作用的可视化、共生激光扫描显微镜(CLSM)、通过计数菌群形成单位(CFU)、宿主细胞生存(细胞毒性)和细胞因子释放的细菌存活率。
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Protocol
1. 渗透支持插入中细胞的生长和分化
- 培养 CFBE41o- 在 含有 10% 胎儿小牛血清 (FCS)、1% 非必需氨基酸和 600 mg/L 葡萄糖的 T75 烧瓶中,其最低基本介质 (MEM) 含有 5% 的 CO2 气氛。每2~3天向细胞中加入新鲜介质。
- 在37°C下用3 mPin-乙二胺四聚氰胺四聚氰胺酸(EDTA)在烧瓶中达到70%汇合后分离细胞,15分钟。加入 7 mL 的新鲜 MEM,在室温 (RT) 下以 300 x g 离心 4 分钟。丢弃上流水液,并添加新的 10 mL 的 MEM,同时通过轻轻上下移液来破坏团块。
- 使用自动细胞计数器或血细胞计室计算细胞。密度为 2 x 105 细胞/孔的种子细胞,在 12 孔板中具有渗透性支架(孔径为 3 μm, 参见材料表)。
注:自动单元格计数器确定单元格的数量、大小分布和单元格的可行性(参见 材料表)。孔径为0.4 μm的渗透支架可在此使用;然而,在这种情况下,巨噬细胞应直接添加到脂肪侧,在这种情况下,不会评估其跨细胞迁移。 - 在液体条件下的种子细胞 (LLC), 在渗透支撑的渗透侧添加 500 μL 的细胞悬浮液, 在基础侧添加 1.5 mL 的新鲜介质。然后在37°C下孵育细胞,在5%CO2下2,72小时。
- 要转移到空气-液界面(ALI)培养,在播种后的第三天,先从基底面取出介质,然后从基础侧移除介质。在基础侧,加入500μL的新鲜 MEM,并每隔两天更换介质,直到细胞形成汇合单层。
注:对于该协议中使用的条件,CFBE41o- 细胞通常在培养3-7天后汇合。 - 通过孵育CFBE41o评估第7天的上皮屏障特性- 在基础侧具有500μL细胞培养基和在基础侧具有1.5 mL的细胞,在5%CO2下在37°C下1小时。
- 使用 STX2 筷子电极和上皮伏特欧姆表,通过跨皮电阻 (TEER) 测量屏障性能;7 天后,这高于 300 °cm2。
注:最终,在某些膜插入中,细胞具有低TEER。因此,不使用带 TEER < 300 μ cm2 的渗透刀片。
- 为了培养THP-1细胞,使用罗斯韦尔公园纪念研究所(RPMI)1640培养基,辅以10%FCS,在37°C下孵育5%CO2的T75烧瓶中。每两天通过播种2 x 106个 细胞/mL细胞在一个新的T75烧瓶中分裂细胞。
注:非分化THP-1细胞在悬浮液中作为单核细胞生长。- 区分THP-1细胞,如下所示。T75 的离心机内容为 300 g x g,4 分钟。丢弃上一杯,在新鲜介质中重新暂停颗粒,并放入新的T75。在37°C和5%CO2大气中加入10纳克/mL Phorbol 12-myristate 13-醋酸(PMA)在RPMI中的细胞中吸收48小时,2持续48小时。
注:与PMA分化后,细胞不再增殖并附着在烧瓶上。 - 要分离THP-1巨噬细胞,在37°C下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次,用含有0.5 mM EDTA的3 mL细胞分离溶液(如高分酶)孵育10分钟。
- 在倒置显微镜下检查细胞,以查找细胞分离。加入 7 mL 的新鲜介质,在 RT 时以 300 x g 的离心机 4 分钟。
注: 巨噬细胞也可以与尝试性-EDTA分离,37°C20分钟。然而,与所选的细胞分离溶液(参见材料表)对巨噬细胞的试管更 苛刻。 - 取出上清液后,将THP-1介质中3 mL的巨噬细胞重新悬浮到15 mL锥形管中,如1.1.2所述,计算细胞数。并在 37 °C 下孵育 1 小时,低于 5% CO2, 然后再建立共培养。
注:悬架中的THP-1细胞可以染色于活力染料,以进一步成像共培养。在此步骤中,使用下面的过程(步骤 1.2.5)。 - 用10μM的细胞活力染料染色巨噬细胞(基于细胞内酯的转化,见 材料表),其中3μL的细胞活力染料应用于细胞悬浮液。在37°C下孵育细胞20分钟,CO25%,然后用PBS 37°C洗涤1x,去除染料。
注:在室温 (RT) 下,将细胞离心 ,以 300 x g 去除染料 4 分钟。
- 区分THP-1细胞,如下所示。T75 的离心机内容为 300 g x g,4 分钟。丢弃上一杯,在新鲜介质中重新暂停颗粒,并放入新的T75。在37°C和5%CO2大气中加入10纳克/mL Phorbol 12-myristate 13-醋酸(PMA)在RPMI中的细胞中吸收48小时,2持续48小时。
2. 在可渗透支架上建立上皮-巨噬细胞共培养
- 使用 CFBE41o- ALI 的单层,TEER = 300°cm2(步骤 1.1.6.)。从下腔室中去除介质,小心地将无菌玻璃培养皿内的支撑物反转(50 mm x 200 mm),并使用细胞刮刀去除通过膜底部膜孔隙过度生长的细胞。
注:由于孔径为3μm,上皮细胞往往通过孔隙向基底侧生长。因此,在添加这边的巨噬细胞之前,需要移除它们。CFBE41o- 肺上皮细胞可以在此步骤染色.可以使用步骤 1.2.5 中的过程;然而,MEM 中的染料溶液不是细胞悬浮液,而是应用于可渗透支持上的粘附细胞上(仅 500 μL 的阳一面)。 - 使用 2 x 105 细胞/井(在 200 μL RPMI 中)从 PMA 分化 THP-1 巨噬细胞的细胞悬浮液中放置细胞,并将细胞放在倒置刀片的基底侧。
- 小心关闭培养皿,在37°C下孵育2小时,低于5%CO2。
- 将刀片放回 12 孔微孔板中,并在可渗透刀片的基底侧添加 500 μL 的 MEM 介质,以保持 ALI 条件。细胞现在已准备好感染。
3. 感染 P. aeruginosa
注:以下所有步骤必须在生物安全级别 2 (BSL2) 实验室完成。
- 接种 15 mL 的 Lysogeny 肉汤 (LB) 辅以 300 μg/mL 氨基林在 Erlenmeyer 烧瓶 (50 mL) 与 P. aeruginosa PAO1-GFP 的单一殖民地。
注:其他 菌株的P.aeruginosa 也可以在这里使用,例如,PAO1野生类型,PA14,或临床菌株,按照自己的栽培协议。 - 在37°C下孵育细菌18小时,在180转/小时时摇晃。
- 18 h 后将内装物转移到 50 mL 锥形管,以 3850 x g 的离心机 传输 5 分钟。丢弃上一液,在37°C下加入10mL的无菌PBS。
- 测量波长为 600 nm 的分光光度计上的光学密度,并使用细胞培养基调整细菌浓度,最终浓度为 2 x 105 CFU/mL。这对应于每个上皮细胞的一种细菌的多重感染 (MOI)。
- 将100μL的细菌悬浮液加入渗透支撑的渗透侧(步骤2.4.),在37°C下孵育,在5%CO2 下孵育1小时,使细菌附着在细胞上。然后,用移液器小心地去除液体,以恢复ALI条件。将一些样品作为控制保持未感染。
注:在此阶段,附着的细菌应镀在LB agar中(见步骤5.4/5.5),以确定初始细菌的菌分。 - 在细胞中细菌粘附后孵育感兴趣的药物。对于治疗实验,将500μL的细胞培养中稀释的药物溶液(本协议中使用6μg/mL)添加到细胞侧。加入1,500μL的细胞培养基,在基底面不带药物。
注:该模型也可以适应气溶胶沉积,而不是将药物作为溶液注入。出于此类目的,ALI 的细胞从基底端以 500 μL 的细胞培养基进行喂养。然后,药物首先被雾化,并允许通过适当的装置沉积在雾室中(此处未说明)。可以检查受感染和经过处理的样本是否检查第 4-7 节中概述的端点。从这一步开始,渗透支持可用于创建图像(第4节)或获得细菌生长和哺乳动物细胞生存能力的结果,等等(第5-7节)。
4. 共声激光扫描显微镜(CLSM)的样品制备
- 建立共同培养,感染和药物治疗后,去除所有媒介从药方和基础侧。在 37°C 下用 PBS 清洗 1x,然后用 3% 半甲醛 (PFA) 将细胞在 RT(300 μL 上,在基础体上 300 μL/600 μL)固定 1 小时。细胞核在室温下用5微克/mL的DAPI-PBS染色30分钟。
注意:PFA 是危险的。 - 使用手术刀切割膜,并使用安装介质将它们放在两个 12 mm 显微镜盖幻灯片之间( 参见材料表)。在 4 °C 储存之前,让它在流量台内干燥 30 分钟。 通过共和扫描显微镜进行可视化。
注:在共培养和安装之前,可以进行紧密的结免疫污染。为此,细胞用甲状甲醛3%固定30分钟,用PBS再次清洗,用PBS用皂素0.05%/BSA 1%渗透。在该协议中,通过小鼠抗人类ZO-1抗体(1:400,在4°C下孵育过夜)检测出区黄素蛋白(ZO-1)。然后,在RT中用山羊抗小鼠IgG抗体Alexa Fluor 633(红色1:2000)孵育样品2小时。核沾有DAPI(1 μg/mL),安装在盖玻片上安装介质。 - 使用共和显微镜对存储的膜进行成像。选择 25 倍或 63 倍水浸目标和激光器,在 405、488、505 或 633 nm 进行检测。图像的分辨率应为 1024 x 1024 像素。
注:激光器根据使用的污渍进行选择。 - 获取截面和横截面视图,并使用 Zeta 堆栈模式 (10~15 堆栈) 使用成像软件构建三维模型。
5. 通过形成菌落的单位(CFU)测量细菌扩散
- 收集非附着细菌的CFU和基础介质(含细菌)。从面和基波拉特面收集 500 μL 并池化它们。
注:直接使用此悬浮液对细菌进行计数(步骤 5.4)或在 21,250 x g 下离心 10 分钟,以评估上清液中的乳酸盐脱氢酶 (LDH)和/或在 PBS 中重新悬浮以计数细胞外细菌(步骤 5.4)。 - 通过添加 500 μL 无菌脱越冷水,评估细胞内附和/或内化细菌的生存。在室温下孵育细胞30分钟。
注:样品可以镀在LB agar(见步骤5.4)上,也可以在-20°C下冷冻(作为整个插入板),供以后电镀。 - 为评估粘附细菌/内化细菌的CFU,在37°C下解冻样品10分钟(如果冷冻)。使用每孔的移液器尖端,刮膜表面和移液器上下,以去除所有粘附的内容。
注:在此步骤中,所有上皮细胞都得到粘液和粘附/内化细菌作为悬浮液进行镀。 - 使用两个分数的细菌悬浮液,使用 Tween-80 0.05% 的 PBS 进行 1/10 序列稀释,并在 LB agar 板上对细菌进行镀膜。
注:建议在 1 到 10 之间稀释。细菌应计数在最高的稀释,其中单菌落首先被识别。 - 在30°C下孵育加糖板16~72小时,以计数菌落,并相应地计算CFU。
注:在板孵化时,温度为30°C对于处理样品和观察菌落的延迟生长至关重要。
6. 通过乳酸脱氢酶测定对细胞细胞毒性的评价
- 使用含有细菌的受感染细胞的上因(见步骤5.1)进行LDH测定16的细胞生存能力评估。将上能液在21,250 x g 下离心10分钟,以对细菌进行颗粒化,并最终使细胞的其余部分产生。使用无细菌的上一液测量LDH释放。
注:在通过此测定测量LDH之前,不应冻结上一液。 - 将上液的 100 μL 转移到 96 井板中,并加入 100 μL 的 LDH 测定溶液( 参见材料表)。在室温下在黑暗中孵育5分钟,然后在492纳米时读取吸收。
7. 评估人类细胞因子的释放
- 有关细胞因子定量,请使用 ELISA 或细胞测量珠阵列免疫测定17(参见材料表)。为此,从步骤 5.1 的离心机 5.1 以 21,250 x g进行 10 分钟测量,或立即测量或储存 -80°C 长达 15 天,直到分析。
- 使用市售的 ELISA 套件评估超级钠。
注:该程序遵循制造说明,包括带捕获抗体的板涂层、样品(100 μL)和细胞因子标准的添加、孵化、洗涤和检测抗体的添加,以提供细胞因子存在的色度测量。或者,流式细胞仪可用于通过市售试剂盒测量细胞因子(参见 材料表)。
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Representative Results
图1A 显示了在渗透支架的渗透支架的渗透侧和基础侧生长24小时后,人类支气管上皮细胞和巨噬细胞共同培养的形态。上皮屏障完整性由较高的TEER(834°cm2)和CLSM通过免疫固结蛋白ZO-1(图1B)显示。在未感染的CFBE41o的屏障完整性方面观察到的相同结果- 单一培养可以在未受感染的上皮-巨噬细胞共培养物中看到。
为了模拟细菌感染,P. aeruginosa在CFBE41o细胞上接种了1:1的多种感染(MOI)。感染后6小时(图2A),在共培养的一侧观察到巨噬细胞。感染后,TEER从834°cm 2下降至250°cm2,表明上皮屏障受损,ZO-1染色也显示(图2B)。
图3 显示了巨噬细胞通过可渗透膜毛孔和细菌吸收的THP-1细胞在脂肪侧。样品经独立实验固定在1、3和6小时孵育后。在THP-1单培养(图3A+C)中,巨噬细胞迁移被观察到早在1小时,而在共培养(图3D+F),这是3小时感染后看到的。THP-1中的细菌吸收在感染3小时后,在单一培养和共培养中观察到。CFBE41o - 未看到细菌吸收。横截面视图被放置,使渗透膜支撑位于中间,作为截面和基础室的分离。
图 4显示了感染共培养物 (CFBE41o- + THP-1) 的共声扫描激光显微镜图片,用或不治疗托布拉霉素 6 小时(图 4A、B)或 20 小时(图4C,D)。如果不进行治疗,上皮细胞和巨噬细胞在感染20小时后死亡(图4C)。然而,在治疗心肌素后,宿主细胞在20小时后保留;然而,在培养中可以观察到一些细菌。尽管在显微镜图片中经过6小时的治疗后,细菌并没有像图4E中的CFU测定所观察到的那么多增。然而,经过20小时的治疗,细菌恢复了增殖能力,如CFU测定的菌落(图4F) 所示。与冷水和刮擦的细胞解解协议可以释放细菌附着,并可能内化在细胞中。同时,细胞被破坏(补充图S1A,B)。本文用于上皮细胞(300 x g)或细菌(21,250 x g)的离心步骤并没有妨碍两者的可行性(补充图S1C,D)。所有 CFU 测定都通过将样品冷冻在 -20°C,然后进行解冻和电镀。与新鲜样品相比,该程序将细菌数量减少了2个原点(补充图S1E)。由于此程序同时对不同时间点的所有实验组(经过治疗和未经治疗)进行,因此此减少将纳入最终结果(补充图 S1E)。此外,这里使用的托布拉霉素浓度显示未感染细胞没有毒性(补充图S2A),也没有进一步的炎症反应(补充图S2B)。然而,它是在最低抑制浓度范围内杀死P.aeruginosa。
图 5 显示了跨膜电阻 (TEER) 和细胞生存能力。 图 5A+B 说明了单一文化和共同文化的 TEER。与单培养(红条)相比,CFBE41o- 具有 THP-1 的细胞的共培养没有诱导上皮屏障完整性的任何变化。感染后,TEER 值下降(绿色条)。感染1小时后,一些样品用抗生素去白霉素(蓝棒)治疗6或20小时。正如较高的TEER所观察到的,该治疗保留了上皮屏障的完整性。 图5C 显示了LDH释放的百分比,作为6小时后感染和心肌素治疗的细胞毒性指示。共同培养本身诱导LDH的释放,这是相同的感染细胞(约20%)。感染20小时后,未检测到LDH信号。为了证明LDH对长期感染的可靠性,PAO1-GFP在有和没有LDH 1 U/mL的介质中孵育,与各自的未感染对联(补充图S2C)相比。LDH信号在长时间孵育(20小时)后与 P.aeruginosa失去,表明LDH只有在受感染培养物的潜伏时间较短时才稳定。
图 6 显示了通过 ELISA 检测到的亲炎细胞因子的动力学。CFBE41o和THP-1细胞的受感染共培养物的优点被观察到了对炎症细胞因子的较高分泌物。 一些亲炎细胞因子的分泌在受感染的共培养物中(图6C)与相应的单培养物(图6A-B)相似(IL-8、TNF-α、IL-1+)。出乎意料的是,THP-1单培养中的一些细胞因子(图6B)在受感染的样品(Il-8、TNF+、IL-1+)中受到降低调节。
图7 显示了通过荧光活性细胞分选(FACS)测量的通过荧光活性细胞分选(FACS)测量的托布拉霉素感染和治疗时单培养物和共培养物中的细胞因子的释放。与单体培养相比,亲炎细胞因子IL-8(图7A)和抗炎细胞因子IL-10(图7F)的分泌在上皮细胞和巨噬细胞的共培养中较高。然而,对于所有其他细胞因子(IL-1+,IL-12p40,IL-23和GM-CSF)(图7B+E),细胞因子分泌水平在共同培养中并不高,在各自的单一培养中。
图1:未感染的上皮巨噬细胞共培养的横截面和同源视图。 (A) 未感染的24小时上皮巨噬细胞共培养的交叉视图。CFBE41o- 染色红色,THP-1巨噬细胞黄色和蓝色核(DAPI)。(B) 未感染的 CFBE41o - 单层免疫染色的 ZO-1(红色)的异种视图。达皮:核。比例线:50 μm。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2:受感染上皮-巨噬细胞共培养的横截面和面体视图。(A) 感染后 6 小时 (hpi) 与P. aeruginosa PAO1-GFP 的上皮-巨噬细胞共培养的交叉视图和 ( B ) 的面视图和(B) 的面视图。CFBE41o-染成红色,THP-1巨噬细胞在黄色,核在蓝色(DAPI)和P.aeruginosaPAO1-GFP在绿色。(B) 6小时感染CFBE41o-单层的单层。比例线:50 μm。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图3:由3D模型的横截面显示巨噬细胞迁移和细菌吸收的动力学。 PAO1-GFP感染动力学在THP-1巨噬细胞(A+C)或共培养(D+F)的单培养中。THP-1 巨噬细胞被染成红色,上皮细胞核为蓝色 (DAPI),P. aeruginosa为绿色 (GFP)。每个图形被分为一体和基底两侧,其中的空间被认为是膜,这是空的或由CFBE41o- 汇合层(D+F)占用。图中的插入显示巨噬细胞在不同时间(A+F)吸收的细菌。比例线:50 μm。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图4:在托布拉霉素治疗的共培养物中PAO1-GFP存活率的特征(A+D)共生显微图与治疗或无治疗的共生显微图。(A) 感染6小时后未经治疗的共培养。(B) 感染共培养素用心肌素6微克/mL (Tob) 治疗6小时(C) 未经治疗共培养20小时感染后,( D) 感染共培养素用心肌素6微克/mL治疗20小时。核沾染为DAPI(蓝色)、巨噬细胞(红色) 和P.aeruginosaGP( 绿色)。(E) 附着细菌/内化细菌的菌群形成单位(CFU),在6和(F)20h后,用去霉素6μg/mL处理。空膜插入物用作非生物基板,用于生长PAO1-GFP。使用具有 Tukey 多重比较测试(#无菌落)的双向 ANOVA,*p < 0.05;p < 0.001;p < 0.0001;ns: 不重要。误差条指示标准偏差,n = 9×27 复制 3~9 个独立实验。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5:障碍完整性和单一文化和共同文化可行性评估。评估了以下共培养条件:未感染(灰条)、感染(绿色条)或感染和治疗托布拉霉素(蓝条)。(A) 单培养物(CFBE41o- -和THP-1)感染后6小时和(B)20小时感染的透气电电阻,并共同培养。(C) 通过LDH释放6小时感染后测量的单培养和共培养细胞毒性。使用与图基的多重比较测试的双向 ANOVA;*p < 0.05;p < 0.0001;ns: 不重要。错误条指示标准偏差;n = 9 复制三个独立实验。请单击此处查看此图的较大版本。
图6:通过ELISA评估的未感染和感染的单培养超级细胞因子释放的动力学。 ELISA 是按照套件制造商的协议完成的。(A) CFBE41o-, (B) THP-1 和 (C) 共同培养释放 IL-8、TNF-α、IL-1 + 和 IL-6。错误条指示标准偏差。n = 6 个复制 2 个独立实验。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7:细胞因子面板的上一位值率结果,通过FACS测量,带无托布拉霉素6μg/mL,感染后6小时。感染后6小时的单培养和共培养的超级感染者,用于分析各自的细胞因子AIL-8(A)、IL-1+(B)、IL12p40(C)、IL-23(D)、GM-CSF(E)和IL-10(F)。BCDEF错误栏指示标准偏差,n = 9 个独立实验的复制。请单击此处查看此图的较大版本。
补充图 S1:协议关键步骤的控制实验。 (A, B)CFBE41o细胞的显微图在24孔板生长2天,密度为2×105 细胞/孔。(A) PBS中的CFBE41o细胞30分钟,用移液器刮擦30分钟后经过水处理细胞。(C) 离心后哺乳动物细胞的生存能力。CFBE41o- 细胞从T75细胞培养瓶中去除,如步骤1.1.1和1.1.2所述。在10 mL同位素溶液中分析了100μL的产生细胞悬浮液。使用自动细胞计数器来评估单个细胞的可行性。然后,将各细胞悬浮液在300 x g下离心 4分钟,重新悬浮并再次计数。误差条指示标准偏差,n = 2 个单独实验的 6 个不同烧瓶。(D) 离心后PAO1-GFP的生存能力。PAO1-GFP细菌在细胞培养中稀释至OD= 0.01。CFU通过10倍稀释排和LB板在30°C孵育过夜进行评估。 各塑料管以21,250 x g离 心 10分钟,以中等技术重新悬浮。CFU 再次进行了相应的评估。双尾学生 t 考试, * p < 0.033。错误栏指示标准偏差,n = 2 个实验中的 6 个。(E) 冷冻后细菌的生存能力.PAO1-GFP细菌的制好如(D)和CFU分析,然后塑料管在-20°C下冷冻一天,并解冻,再次评估CFU。双尾学生的 t 考试, ***p < 0.001。误差条指示标准偏差,n = 两个实验中的 6。 请点击这里下载此文件。
补充图S2:控制实验,以评估LDH行为和对心肌霉素的影响。 (A) 控制实验,用6μg/mL托布拉霉素在20小时孵育后评估细胞毒性。单培养和共培养是按协议所述完成的,但细胞在24孔板上生长了2天,THP-1细胞被分种子。具有6μg/mL的对白霉素或对联的细胞被孵育20小时。单向 ANOVA,Tukey 的多重比较测试,***p < 0.001。错误栏指示标准偏差,n = 6 的 2 个实验(CFBE41o-),n = 3 的一个实验(THP-1 和共培养)。(B) 控制单培养和共培养的超级钠与/无托布拉霉素。细胞培养根据 (A) 进行,以显示没有细胞因子释放相比,所有条件的对等。ELISA 在步骤 7.1 和 7.2 中完成,添加 10 μg/mL (LPS) 作为控制,含有 THP-1 的 LPS 处理控制装置的 IL-8 释放高于可检测值。双向 ANOVA,Tukey 的多重比较测试,ns p > 0.12;* p < 0.033;p < 0.001.误差条指示标准偏差,n = 两个实验中的 6 个,n = 3 个实验(LPS 控制)。(C) 由于PAO1-GFP增殖过多,LDH降解。LDH 在浓度为 1 U/mL 时添加到 MEM 介质中。LDH介质或控制介质用于将细胞稀释至OD = 0.01(对应于1 x 108 CFU/mL),然后孵育20小时。单向 ANOVA ,Tukey 的多重比较测试,ns p > 0.12;p < 0.001.误差条指示标准偏差,n = 8+9 的三个单独实验。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
本文描述了受感染气道的3D共培养方案,由人类囊性纤维化支气管上皮细胞系CFBE41o和人类单细胞衍生巨噬细胞系THP-1组成。该协议允许评估上皮屏障的完整性,巨噬细胞迁移,细菌生存和炎症,这是测试药物疗效和宿主反应时同时的重要参数。模型中的新颖性在于将上皮细胞(即人类CF细胞系和巨噬细胞)与急性细菌感染(即P.aeruginosa)结合在一起。上皮细胞的急性感染证明是由抗生素(即托布拉霉素)控制的。除了使用人类CF细胞系外,整个模型也是在ALI条件下建立,这更接近CF的生理条件。囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)的突变与肺部上皮流体运输的调节失调直接相关。此外,CF基因的突变,如+F508,导致厚粘液,炎症和严重的肺部损伤感染 P.aeruginosa4。这些由功能失调的CFTR引起的病理表现可能涉及自噬损伤,作为与CF肺疾病18的发病机制相关的一种重要的细胞机制。然而, CFBE41o- 不能秘密粘液, 这是这个细胞系的限制.如果打算更具体地研究粘液的作用,则可以使用其他支气管细胞系(例如Calu-3)对协议进行调整。
建立此协议的一个关键步骤是上皮细胞和免疫细胞的组合,以及随后感染 ALI的P.aeruginosa。 CFBE41o的感染- 由P.aeruginosa 在体外已经描述,主要使用流动细胞室,辅以精氨酸在培养基,以提高上皮细胞生存和支持生物膜形成19。本协议旨在采用仅使用人类细胞的新模型,此外,该模型可以在可渗透井板刀片上在ALI上生长,从而提高样品的吞吐量。THP-1分化巨噬细胞作为人类永生细胞系,而不是依赖于从捐赠者那里获得可重复的原细胞,这是我们模型的另一个优势。通过将这些巨噬细胞添加到渗透膜支撑的基底面,观察到巨噬细胞突出并最终向过滤生长的上皮屏障的面侧转运。该协议的一个变化可能是直接在上皮细胞顶部的脂肪侧添加巨噬细胞,正如Kletting 等人所描述的。14.非人类免疫细胞和肺细胞的共培养已经描述过。丁 等人10 个使用小鼠刘易斯肺癌细胞的渗透插入支持与巨噬细胞在基础侧和感染 S.麦哲鲁斯,另一个关键病原体慢性感染的CF患者。然而,在这项研究中,没有关注囊性纤维化或使用共培养作为评估药物疗效的平台。我们的协议可以适应其他细菌感染,如 金黄色葡萄球菌, 脓肿分枝 杆菌, 或杆菌-在CF肺的重要病原体。
另一个关键步骤是通过倒置渗透插入物(第 2 节),将 THP-1 巨噬细胞添加到细胞中。这对于评估巨噬细胞通过井向感染侧迁移至关重要。从具有 z 堆栈的 3D 模型和横截面视图的后期成像过程可以执行,以观察巨噬细胞内部并检测细菌吸收(图3)。在1 hpi 时,在细胞侧应用的细菌通过膜迁移,而巨噬细胞迁移和吸收只发生在 3 hpi。因此,在1小时感染后,应该开始治疗与心肌霉素,并有可能解决宿主细胞和细菌生存长期(20小时)。在协议过程中,由于每个步骤都具有污染风险,因此维持不育是一个关键问题。然而,有经验的细胞培养人员在适当的准备和培训之后将能够遵循此协议。应定期检查细胞介质是否污染,最好在所有关键步骤之后。
与任何模型一样,受感染的共培养也有一些局限性;例如,巨噬细胞的整合。在这里,重要的是有巨噬细胞在基础侧;然而,使用先前生长的上皮层对刀片的操纵可能给共培养物早期伤害和干扰。虽然,渗透支持模型提供了高通量特征,这是没有观察到在以前的共培养的CF感染肺20,21。20,因此,进一步的实验需要评估使用THP-1作为巨噬细胞替代品的局限性。虽然这种细胞系被广泛使用,但它对LPS22的响应较少,而且缺乏完全的激活,并且整个种群没有从单细胞到巨噬细胞23的分化。另一个限制是缺乏其他关键成分在CF感染和药物交付。CFBE41o-细胞系不具有西莉亚,也不产生粘液,这通常发生在ALI的细胞培养20-30天。由于CFBE41o细胞系的情况并非如此,我们在形成紧密的上皮屏障后七天使用了细胞。粘膜清除改变了微生物24或药物颗粒9,25的居住9,25条件,体外模型评估肺沉积应考虑到这一点。与其他细胞观察到的不同于,组织培养物插入具有细胞外基质材料(如纤维素或胶原蛋白一)的涂层,对CFBE41o没有显著差异,例如在TEER26中。因此,在该协议中,渗透滤波器没有涂上细胞外基质材料。
与此处描述的协议,单培养和共培养后6小时感染提供足够的细胞因子释放,以用作测量在未来的药物测试。联合培养在模拟免疫反应方面带来了细胞合作的优势。由于并非所有细菌在治疗过程中被消除,因此预计对心肌素在减少炎症方面会降低其效果(图4E,F)。然而,在CF模型中对托布拉霉素的反应建模至关重要,因为托布拉霉素(浓度较高)在P.aeruginosa抑制中是有效的,即使在生物膜19,27,中。进一步使用此协议的一个可能性是将抗炎药物整合到治疗中。关于炎症反应的总体建议是使用短期治疗(6小时),它仍然存在宿主细胞和细菌。在此时间点之后,宿主细胞在未经处理的样品中被破坏。ELISA 和 FACS 都可用于测量细胞因子的释放。最后,如果样品在-80°C下储存时间超过15天,建议使用新鲜样品的正对照(例如,用LPS刺激的细胞)来检查细胞因子的可靠性。
可以对协议进行一些修改。例如,目前的协议可以扩展到雾化药物的应用(步骤3.6)。这是必要的,通过口服吸入的肺药物输送模型。水溶性药物(如托布拉霉素)或核糖核糖药物等纳米载体的星云化,在诊所中经常使用的商用设备相对直接。此外,还有几种商用装置将气溶胶沉积到细胞培养物中。此外,由于此处描述的模型基于可渗透膜支持,因此也可以将其用于一些当代微流体(例如"芯片上的肺")器件,例如,研究呼吸的影响以及相关的机械拉伸和气流变化。此外,根据要解决的科学问题,可以通过增加粘液或由原细胞替换来修改这一协议。另一个有趣的下一步是纳米药物的测试,特别是纳米技术正在取得进展,在开发新的抗感染剂28,CF校正器29 和抗生素和病理拦截器30的共同交付。总体而言,目前的协议可能被认为有助于评估复杂系统中抗生素治疗的细菌存活率,以及一些宿主相关的读数:细胞毒性、上皮屏障完整性、巨噬细胞迁移和炎症反应。这些是药物开发的基本参数。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
根据第642028号H2020-MSCA-ITN-2014、NABBA -设计和开发先进的纳米药物,用于研究、技术开发和示范项目,这项工作得到了欧盟HORIZON 2020计划的资助,以克服生物障碍并治疗严重疾病。我们感谢安娜·科斯塔博士和珍妮·容特克博士对共同文化的发展给予的大力支持,感谢阿尔加·哈特维格为ELISA测定、佩特拉·科尼格、贾娜·韦斯特胡斯博士和基亚拉·德罗西博士提供的科学插图,感谢他们对细胞培养、分析和显微镜的支持。我们也感谢切尔西·索恩校对我们的手稿。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Accutase | Accutase | AT104 | |
Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
Petri dishes | Greiner | 664102 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
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