Summary
Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o- cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.
Abstract
la recherche sur le traitement des infections pulmonaires progresse vers des modèles in vitro prédictifs de grande complexité. La présence multiforme de bactéries dans les modèles pulmonaires peut ré-adapter l’arrangement épithélial, tandis que les cellules immunitaires coordonnent une réponse inflammatoire contre les bactéries dans le microenvironnement. Bien que les modèles in vivo aient été le choix pour tester de nouveaux anti-infectieux dans le contexte de la mucoviscidose, ils n’imitent toujours pas avec précision les conditions in vivo de ces maladies chez l’homme et les résultats du traitement. Des modèles in vitro complexes des voies respiratoires infectées à base de cellules humaines (épithéliales et macrophages bronchiques) et des agents pathogènes pertinents pourraient combler cet écart et faciliter la traduction de nouveaux anti-infectieux dans la clinique. À cette fin, un modèle de coculture de la lignée épithéliale de la fibrose kystique humaine CFBE41o- et des macrophages dérivés du monocyte THP-1 a été établi, imitant une infection de la muqueuse bronchique humaine par P. aeruginosa à des conditions d’interface air-liquide (ALI). Ce modèle est mis en place en sept jours, et les paramètres suivants sont simultanément évalués : intégrité de barrière épithéliale, transmigration de macrophage, survie bactérienne, et inflammation. Le présent protocole décrit un système robuste et reproductible pour évaluer l’efficacité des médicaments et les réponses de l’hôte qui pourrait être pertinent pour découvrir de nouveaux anti-infectieux et optimiser leur livraison d’aérosols aux poumons.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène pertinent dans la mucoviscidose (CF) qui contribue à l’affaiblissement des tissus pulmonaires1. La production de polysaccharides, tels que l’alginate et d’autres exopolysaccharides mucoïdes, coordonne la progression de la maladie, qui conduit à l’observance bactérienne tenace, limite la livraison d’antibiotiques aux bactéries et protège les bactéries contre le système immunitaire hôte2. La transition de P. aeruginosa de l’étape planctonique à la formation de biofilm est un problème critique dans ce contexte, facilitant également l’apparition de la tolérance aux antibiotiques.
Dans le contexte des FC, la souris a été principalement utilisée comme modèle. Les souris, cependant, ne développent pas spontanément cette maladie avec l’introduction des mutations de CF3. La plupart des études sur le biofilm bactérien et la susceptibilité aux médicaments ont été réalisées sur des surfaces abiotiques, comme les boîtes de Pétri. Toutefois, cette approche ne représente pas la complexité in vivo. Par exemple, d’importantes barrières biologiques sont absentes, y compris les cellules immunitaires ainsi que l’épithélium muqueuse. Bien que P. aeruginosa soit très toxique pour les cellules épithéliales, certains groupes ont réussi à co-cultiver un biofilm P. aeruginosa plus tôt avec des cellules bronchiques humaines. Ces cellules provenaient de patients atteints de mucoviscidose présentant une mutation CFTR (CFBE41o- cellules)4 et ont permis d’évaluer l’efficacité des antibiotiques5 ou d’évaluer la correction de la protéine CFTR pendant l’infection6. Un tel modèle a été montré pour améliorer la prévisibilité de l’efficacité des médicaments, en plus de permettre la caractérisation des problèmes avec les médicaments qui ont échoué dans les phases ultérieures du développement de médicaments7.
Cependant, dans le poumon, l’épithélium muqueuse est exposé à l’air. En outre, les cellules immunitaires présentes dans les voies respiratoires, comme les macrophages tissulaires, jouent un rôle essentiel contre les agents pathogènes inhalés ou les particules8. Les macrophages migrent à travers les différentes couches cellulaires pour atteindre le lumen bronchique et combattre l’infection. En outre, les médicaments inhalés doivent également faire face à la présence de mucus comme un élément non cellulaire supplémentaire de la barrière pulmonaire air-sang9. En effet, plusieurs modèles in vitro tridimensionnels complexes (3D) ont été développés, dans le but d’accroître la pertinence in vivo. Les systèmes de coculture augmentent non seulement la complexité des systèmes in vitro pour la découverte de médicaments, mais permettent également d’étudier les interactions cellule-cellule. Une telle complexité a été abordée dans des études sur la migration des macrophages10, la libération de peptides antimicrobiens par les neutrophiles11, le rôle du mucus dans l’infection9, et la réaction épithéliale des cellules aux dommages excessifs12. Cependant, un modèle in vitro fiable infecté par les FC qui présente la mutation génétique dans la FIBROSE, qui est exposée à l’air (condition physiologique accrue), et intègre les cellules immunitaires fait encore défaut.
Pour combler cet écart, nous décrivons un protocole pour la co-culture humaine stable 3D des voies respiratoires infectées. Le modèle est constitué de cellules et de macrophages épithéliales bronchiques cf humaine, infectées par P. aeruginosa et capables de représenter à la fois une barrière diffusionnelle et immunologique. Dans le but de tester des anti-infectieux à un débit raisonnablement élevé, cette co-culture a été établie sur la membrane filtrante perméable des inserts de plaque de puits, à l’aide de deux lignées cellulaires humaines : CFBE41o- et macrophages dérivés de monocytes THP-1. En outre, pour étudier éventuellement le dépôt d’anti-infectieux aérosols13, le modèle a été établi à l’interface air-liquide (ALI) plutôt que dans des conditions couvertes par le liquide (LCC).
Comme nous le rapportons ici, ce modèle permet d’évaluer non seulement la survie bactérienne sur un traitement antibiotique, mais aussi la cytotoxicité cellulaire, l’intégrité de barrière épithéliale, la transmigration de macrophage, et les réponses inflammatoires, qui sont des paramètres essentiels pour le développement de drogue.
Ce protocole combine deux types de cellules pertinents pour la thérapie par inhalation des voies respiratoires pulmonaires : les macrophages et l’épithélium bronchique de CF. Ces cellules sont ensemencées sur les côtés opposés des inserts de support perméables, ce qui permet l’exposition cellulaire à l’air (appelé l’interface air-liquide (ALI) conditions). Cette co-culture des cellules hôtes est par la suite infectée par P. aeruginosa. Les deux lignées cellulaires hôtes sont d’origine humaine : les cellules épithéliales représentent l’épithélium bronchique de la fibrose kystique, avec une mutation sur le canal CF (CFBE41o-), et les cellules THP-114 sont une lignée cellulaire bien caractérisée comme un macrophages. Une couche épithéliale confluente est d’abord autorisée à se former sur le côté supérieur des inserts de plaque de puits avant que les cellules macrophage-like soient ajoutées au compartiment opposé. Une fois que la co-culture est établie à ALI, le système est inoculé avec P. aeruginosa du côté apical. Ce système de coculture infecté est ensuite utilisé pour évaluer l’efficacité d’un antibiotique, par exemple la tobramycine. Les points d’extrémité suivants sont analysés : intégrité des barrières épithéliales en termes de résistance électrique transépithéliale (TEER), visualisation des interactions cellule-cellule et cellule-bactériose par microscopie à balayage laser confocale (CLSM), survie bactérienne en comptant les unités de formation de colonies (CFU), survie des cellules hôtes (cytotoxicité) et libération de cytokine.
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Protocol
1. Croissance et différenciation des cellules dans les inserts de support perméables
- Cultiver CFBE41o- dans une fiole T75 avec 13 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10% de sérum fœtal de veau (FCS), 1% d’acides aminés non essentiels et 600 mg/L de glucose à 37 °C avec 5 % d’atmosphère CO2. Ajouter un milieu frais aux cellules tous les 2 à 3 jours.
- Détachez les cellules après avoir atteint 70% de confluence dans la fiole avec 3 ml d’acide trypsine- éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 37°C pendant 15 min. Ajouter 7 mL de MEM frais et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 4 min à température ambiante (RT). Jeter le supernatant et ajouter de nouveaux 10 mL de MEM tout en perturbant les amas en faisant doucement des tuyaux de haut en bas.
- Comptez les cellules à l’installation d’un compteur cellulaire automatisé ou d’une chambre d’hémocytomètre. Cellules de graines avec une densité de 2 x 105 cellules/puits dans des plaques de 12 puits avec des supports perméables (taille des pores de 3 μm, voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Le compteur cellulaire automatisé détermine le nombre de cellules, la répartition de la taille et la viabilité des cellules (voir tableau des matériaux). Des supports perméables d’une taille de pore de 0,4 μm pourraient être utilisés ici; cependant, les macrophages, dans cet état, devraient être ajoutés directement au côté apical, et leur migration transcellulaire ne sera pas évaluée dans ce cas. - Cellules de semences à condition liquide-liquide (LLC) en ajoutant 500 μL de la suspension cellulaire sur le côté apical du support perméable et 1,5 mL de milieu frais dans le côté basolatéral. Incuber ensuite les cellules à 37°C sous 5% de CO2,pendant 72 h.
- Pour passer à la culture de l’interface air-liquide (ALI), le troisième jour après l’ensemencement, retirer le milieu du côté basolatéral d’abord, puis du côté apical. Pour le côté basolatéral, ajouter 500 μL de MEM frais et changer le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules forment une monocouche confluente.
NOTE: Pour les conditions utilisées dans ce protocole, le CFBE41o- les cellules sont généralement confluentes après 3-7 jours en culture. - Évaluer les propriétés de la barrière épithéliale le jour 7 en incubant CFBE41o- cellules avec 500 μL de cellules moyennes dans le côté apical et 1,5 mL dans le côté basolatéral pendant 1 h, à 37°C sous 5% DE CO2.
- Mesurer les propriétés de la barrière par résistance électrique transépithéliale (TEER), avec une électrode de baguette STX2 et un volt-ohmmètre épithélial; après 7 jours, c’est plus de 300 Ω×cm².
REMARQUE : Finalement, dans certains inserts membranaires, les cellules ont un TEER faible. Par conséquent, les inserts perméables avec TEER < 300 Ω×cm² ne sont pas utilisés.
- Pour cultiver les cellules THP-1, les cultiver dans une fiole T75 en utilisant 13 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen complété par 10% FCS, et incuber à 37°C sous 5% DE CO2. Fractionner les cellules tous les deux jours en ensemencement de 2 cellulesde 6 cellules/mL dans une nouvelle fiole T75.
REMARQUE : Les cellules THP-1 non différenciées sont cultivées sous forme de monocytes en suspension.- Différencier les cellules THP-1 comme suit. Teneur en centrifugeuse d’un T75 à 300 x g pendant 4 min. Jeter le supernatant, resuspender le granulé dans un milieu frais et mettre dans un nouveau T75. Ajouter 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) incubatig les cellules dans RPMI pour 48 h à 37 °C et 5% CO2 atmosphère15.
REMARQUE : Après la différenciation avec la PMA, les cellules ne prolifèrent plus et ne s’attachent plus à la fiole. - Pour détacher les cellules de type macrophage THP-1, lavez-le une fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C et incuber avec 3 mL de solution de détachement cellulaire (p. ex. accutase) contenant 0,5 mM EDTA pendant 10 min à température ambiante.
- Inspectez les cellules au microscope inversé pour rechercher le détachement cellulaire. Ajouter 7 mL de milieu frais et la centrifugeuse à 300 x g pendant 4 min à RT.
REMARQUE : Les macrophages peuvent également être détachés avec la trypsine-EDTA, 37 °C pendant 20 min. Toutefois, la trypsie est plus sévère pour les macrophages que la solution de détachement cellulaire choisie (voir tableau des matériaux). - Après avoir enlevé le supernatant, re-suspendre les cellules macrophage dans 3 ml de THP-1 moyen dans un tube conique de 15 mL, compter les cellules comme décrit dans 1.1.2. et incuber pendant un maximum de 1 h à 37 °C sous 5 % de CO2 avant de mettre en place la coculture.
NOTE: Les cellules THP-1 en suspension peuvent être tachées de colorants de viabilité pour l’image de la co-culture plus loin. À cette étape, utilisez la procédure ci-dessous (étape 1.2.5). - Macrophages de tache avec 10 μM d’un colorant de viabilité cellulaire (basé sur la conversion des moiètes d’acétate par estérases intracellulaires, voir tableau des matériaux)dans lequel 3 μL du colorant de viabilité cellulaire est appliqué à la suspension cellulaire. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 °C, 5 % de CO2,puis laver 1x avec pbs 37°C pour enlever le colorant.
REMARQUE : Centrifugez les cellules pour enlever le colorant à 300 x g pendant 4 min à température ambiante (RT).
- Différencier les cellules THP-1 comme suit. Teneur en centrifugeuse d’un T75 à 300 x g pendant 4 min. Jeter le supernatant, resuspender le granulé dans un milieu frais et mettre dans un nouveau T75. Ajouter 10 ng/mL Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) incubatig les cellules dans RPMI pour 48 h à 37 °C et 5% CO2 atmosphère15.
2. Mise en place d’une co-culture épithéliale-macrophage sur supports perméables
- Utilisez CFBE41o- monocouches à ALI avec TEER ≥ 300 Ω×cm² (étape 1.1.6.). Retirez le milieu de la chambre inférieure, inversez soigneusement le support à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre stérile (50 mm x 200 mm) et retirez les cellules envahies par les pores membranaires du côté inférieur de la membrane à l’aide d’un grattoir cellulaire.
REMARQUE : En raison de la taille des pores de 3 μm, les cellules épithéliales ont tendance à se développer à travers les pores vers le côté basolateral. Par conséquent, il faut les enlever avant d’ajouter les macrophages de ce côté. CFBE41o- les cellules épithéliales pulmonaires peuvent être tachées à cette étape. La procédure à l’étape 1.2.5 peut être utilisée; toutefois, au lieu d’une suspension cellulaire, la solution de colorant dans MEM est appliquée (500 μL côté apical seulement) sur les cellules adhérentes sur le support perméable. - Utilisez 2 x 105 cellules/puits (en 200 μL de RPMI) à partir de la suspension cellulaire des macrophages THP-1 différenciés par LA PMA et placez les cellules sur le côté basolatéral des inserts inversés.
- Fermez soigneusement les plats Petri et incuber pendant 2 h à 37 °C sous 5% DE CO2.
- Remettre les inserts dans les microplaques de 12 puits et ajouter 500 μL de mem moyen dans le côté basolatéral de l’insert perméable pour maintenir les conditions d’ALI. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’infection.
3. Infection par P. aeruginosa
REMARQUE : Toutes les étapes suivantes à partir d’ici doivent être effectuées dans un laboratoire de niveau 2 (BSL2) de biosécurité.
- Inoculer 15 ml de bouillon de lysogenie (LB) complété par une ampicilline de 300 μg/mL dans une fiole Erlenmeyer (50 ml) avec une seule colonie de P. aeruginosa PAO1-GFP.
NOTE: D’autres souches de P. aeruginosa pourraient également être utilisées ici, par exemple, pao1 type sauvage, PA14, ou souches cliniques, suivant leurs propres protocoles de culture. - Incuber les bactéries pendant 18 h à 37°C, en secouant à 180 tr/min.
- Transférer le contenu après le 18 h à un tube conique de 50 mL et la centrifugeuse à 3850 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant et ajouter 10 mL de PBS stérile à 37°C.
- Mesurer la densité optique sur un spectrophotomètre à 600 nm de longueur d’onde et ajuster la concentration de bactéries utilisant le milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 2 x 105 CFU/mL. Cela correspond à une multiplicité d’infection (MOI) d’une bactérie par cellule épithéliale.
- Ajouter 100 μL de suspension bactérienne au côté apical du support perméable (étape 2.4.) et incuber à 37 °C sous 5% de CO2 pendant 1 h, pour permettre l’attachement des bactéries aux cellules. Ensuite, retirez soigneusement le liquide apical à l’aide d’une pipette pour rétablir les conditions d’ALI. Gardez certains échantillons non infectés comme un contrôle.
REMARQUE : À ce stade, les bactéries attachées doivent être plaquées dans l’agar LB (voir les étapes 5.4/5.5) pour déterminer les bactéries initiales inoculum. - Incuber le médicament d’intérêt après l’adhérence bactérienne dans les cellules. Pour les expériences de traitement, ajouter 500 μL d’une solution médicamenteuse diluée dans le milieu cellulaire (dans ce protocole tobramycine 6 μg/mL a été utilisé) au côté apical. Ajouter 1 500 μL de milieu cellulaire sans drogue du côté basolatéral.
REMARQUE : Au lieu d’inculquer les médicaments comme solution, le modèle peut également être adapté au dépôt d’aérosols. À cette fin, les cellules d’ALI sont alimentées du côté basolatéral avec 500 μL de milieu cellulaire. Le médicament est ensuite d’abord nébulisé et autorisé à être déposé dans le compartiment apical par un dispositif approprié (non décrit ici). L’échantillon infecté et traité peut être vérifié pour les critères d’évaluation décrits aux sections 4 à 7. À partir de cette étape, des supports perméables peuvent être utilisés pour créer des images (section 4) ou pour obtenir des résultats de la croissance des bactéries et de la viabilité des cellules des mammifères, entre autres (sections 5 à 7).
4. Préparation d’échantillons pour la microscopie à balayage laser confocale (CLSM)
- Après l’établissement de la co-culture, l’infection et le traitement médicamenteux, retirer tous les milieux du côté atical et basolatéral. Laver 1x avec pbs à 37°C, puis fixer les cellules avec 3% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 h à RT (300 μL sur apical/600 μL sur basolatéral). Les noyaux cellulaires sont tachés de 5 μg/mL de DAPI-PBS pendant 30 min à température ambiante.
ATTENTION: PFA est dangereux. - Couper les membranes à l’aide d’un scalpel et les placer entre deux lames de couverture de microscopie de 12 mm à l’aide d’unsupport de montage (voir tableau des matériaux). Laissez sécher à l’intérieur du banc d’écoulement pendant 30 min avant d’être stocké à 4 °C. Visualisez par microscopie à balayage confocal.
NOTE : Après la co-culture et avant le montage, l’immunostaining de jonctions serrées peut être exécuté. Pour cela, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde 3% pendant 30 min, lavées à nouveau avec pbs, et permeabilisées avec de la saponine 0,05%/BSA 1% dans PBS. Dans ce protocole, la protéine zonula occlus (ZO-1) a été détectée par l’intermédiaire de la souris anticorps anti-humain ZO-1 (1:400, incubation à 4 °C pendant la nuit). Les échantillons ont ensuite été incubés pendant 2 h à RT avec l’anticorps anti-souris de chèvre Alexa Fluor 633 (1:2000 en rouge). Les noyaux ont été tachés avec du DAPI (1 μg/mL) et montés avec un support de montage sur des couvercles. - Utilisez un microscope confocal pour l’imagerie des membranes stockées. Choisissez des objectifs d’immersion aquatique 25x ou 63x et des lasers à 405, 488, 505 ou 633 nm pour la détection. Les images doivent avoir une résolution de 1024 x 1024 pixels.
REMARQUE : Les lasers sont choisis en fonction de la tache utilisée. - Acquérir des vues apical et transversales et utiliser le mode de stack zeta (10–15 piles) pour la construction d’un modèle tridimensionnel à l’aide d’un logiciel d’imagerie.
5. Mesure de la prolifération bactérienne par l’intermédiaire d’unités de formation de colonies (CFU)
- Recueillir le milieu atical et basolatéral (contenant des bactéries) pour évaluer l’EC des bactéries non attachées. Recueillir 500 μL sur les côtés apical et basolatéral et les mettre en commun.
REMARQUE : Utilisez cette suspension directement pour compter les bactéries (étape 5.4) ou la centrifugeuse à 21 250 x g pendant 10 min pour évaluer la déshydrogénase lactate (LDH) du supernatant (section 6) et/ou re-suspendue dans pbs pour compter les bactéries extracellulaires (étape 5.4). - Évaluer la survie des bactéries attachées et/ou intériorisées dans les cellules en ajoutant 500 μL d’eau froide déionisée stérile dans chaque compartiment du support perméable. Incuber les cellules pendant 30 min à température ambiante.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être plaqués sur un agar LB (voir étape 5.4) ou congelés (comme plaque d’insertion entière) à -20 °C pour le placage plus tard. - Pour l’évaluation de l’UC des bactéries adhérentes/intériorisées, décongeler des échantillons à 37°C pendant 10 min (s’ils sont congelés). À l’aide de pointes de pipette pour chaque puits, grattez la surface de la membrane et la pipette de haut en bas pour enlever tout le contenu adhérent.
REMARQUE : À cette étape, toutes les cellules épithéliales sont lysées et les bactéries adhérentes/intériorisées sont disponibles sous forme de suspension à plaquer. - Avec la suspension bactérienne des deux fractions, effectuer une dilution en série 1/10 en utilisant Tween-80 0,05% dans PBS et plaquer les bactéries sur les plaques d’agar LB.
REMARQUE : Des dilutions entre 1 et 10 sont recommandées. Les bactéries doivent être comptées dans la dilution la plus élevée, où les colonies uniques sont identifiées pour la première fois. - Incuber les plaques d’agar à 30°C pendant 16 à 72 h pour compter les colonies, et calculer l’UC en conséquence.
REMARQUE : Une température de 30 °C au moment de l’incubation des plaques est essentielle pour les échantillons traités et pour observer la croissance retardée des colonies.
6. Évaluation de la cytotoxicité cellulaire par l’essai de déshydrogénase de lactate
- Utiliser le supernatant des cellules infectées contenant des bactéries (à partir de l’étape 5.1) pour l’évaluation de la viabilité cellulaire pour l’essai16de LDH . Centrifuge le supernatant à 21 250 x g pendant 10 min pour granuler les bactéries et éventuellement le reste des cellules. Utilisez le supernatant sans bactéries pour mesurer la libération de LDH.
NOTE: Le supernatant ne doit pas être congelé avant de mesurer la LDH par ce test. - Transférer 100 μL du supernatant dans une plaque de 96 puits et ajouter 100 μL de la solution d’analyse LDH (voir le tableau des matériaux). Incuber à température ambiante pendant 5 min dans l’obscurité, puis lire l’absorption à 492 nm.
7. Évaluation de la libération de cytokines humaines
- Pour la quantification de la cytokine, utilisez l’immunoassay17elisa ou cytométrique de tableau de perles (voir le tableau des matériaux). Pour cela, le supernatant de centrifugeuse de l’étape 5.1 à 21.250 x g pendant 10 min et mesurer soit immédiatement ou stocker -80 °C pendant jusqu’à 15 jours jusqu’à l’analyse.
- Évaluez les supernatants avec un kit ELISA disponible dans le commerce.
REMARQUE : La procédure suit les instructions de fabrication, qui comprennent le revêtement des plaques avec l’anticorps de capture, l’ajout des échantillons (100 μL) et les normes de cytokine, l’incubation, le lavage et l’ajout d’anticorps de détection pour fournir une mesure colorimétrique de la présence de cytokine. Alternativement, la cytométrie de flux peut être employée pour mesurer des cytokines par l’intermédiaire des kits disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux).
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Representative Results
La figure 1A montre la morphologie de la coculture par rapport aux cellules épithéliales bronchiques humaines et aux macrophages après avoir augmenté à la fois pendant 24 h sur le côté atical et basolateral des supports perméables, respectivement. L’intégrité de la barrière épithéliale est démontrée par teer plus élevé (834 Ω×cm2) et CLSM par immunostaining pour la protéine de jonction serrée ZO-1 (Figure 1B). Les mêmes résultats observés en termes d’intégrité des barrières de CFBE41o non infecté- la monoculture pourrait être observée dans les co-cultures épithéliales-macrophages non infectées.
Pour modéliser une infection bactérienne, P. aeruginosa a été inoculé à une multiplicité d’infection (MOI) de 1:1 sur CFBE41o- cellules. Six heures aprèsl’infection ( figure 2A),des macrophages ont été observés sur le côté apical de la co-culture. Après l’infection, le TEER est passé de 834 à 250 Ω×cm2, ce qui indique une barrière épithéliale compromise, comme l’a également visualisé la coloration ZO-1 (Figure 2B).
La figure 3 montre la transmigration des macrophages à travers les pores de membrane perméables et l’absorption des bactéries par les cellules THP-1 du côté apical. Les échantillons ont été fixés à 1, 3 et 6 h après l’incubation d’expériences indépendantes. Dans les monocultures THP-1(figure 3A–C),la migration des macrophages a été observée dès 1 h, tandis que dans la co-culture (figure 3D–F), cela a été vu après l’infection de 3 h. L’absorption de bactéries dans THP-1 a été observée après 3 h d’infection, à la fois en monoculture et en co-culture. Aucune absorption bactérienne par CFBE41o- n’a pu être vue. Des vues transversales ont été placées de telle sorte que le support de membrane perméable était au milieu comme une séparation du compartiment apical et basolateral.
La figure 4 montre des images de microscopie laser à balayage confocal de co-cultures infectées (CFBE41o- + THP-1) traitées avec ou sans tobramycine pendant 6 h (figure 4A, B) ou 20 h ( Figure4C,D). Sans traitement, les cellules épithéliales et les macrophages sont morts après 20 h d’infection (figure 4C). Cependant, sur le traitement de la tobramycine, les cellules hôtes sont préservées après 20 h; encore, certaines bactéries peuvent être observées dans la culture. Bien qu’elles aient été observées après 6 h de traitement dans les images de microscopie (figure 4B),la bactérie n’a pas proliféré comme on l’a observé dans les tests de l’ECC dans la figure 4E. Néanmoins, après un traitement de 20 h, la bactérie a récupéré la capacité de prolifération, comme le voient les colonies dans le test de l’ECT (Figure 4F). Le protocole de lyse cellulaire avec de l’eau froide et le grattage peut libérer des bactéries attachées et éventuellement intériorisées dans les cellules. Dans le même temps, les cellules sont détruites (Figure supplémentaire S1A, B). Les étapes de centrifugation utilisées dans cet article pour les cellules épithéliales (300 x g) ou les bactéries (21 250 x g)n’ont pas entravé la viabilité des deux (Chiffres supplémentaires S1C, D). Tous les tests de l’UC ont été effectués en gelant les échantillons à -20°C, suivis de dégel et de placage. Cette procédure a réduit le nombre de bactéries de 2 grumes, par rapport aux échantillons frais (Figure supplémentaire S1E). Comme cette procédure se fait simultanément pour tous les groupes expérimentaux (traités et non traités) à différents moments, cette réduction sera incorporée dans les résultats finaux (figure supplémentaire S1E). En outre, la concentration de tobramycine utilisée ici n’a montré aucune toxicité pour les cellules non infectées (Figure supplémentaire S2A) et aussi aucune autre réponse inflammatoire (Figure supplémentaire S2B). Cependant, il était dans la gamme de la concentration inhibitrice minimale pour tuer P. aeruginosa.
La figure 5 montre la résistance électrique transépithéliale (TEER) et la viabilité des cellules. La figure 5A–B illustre le TEER des monocultures et des cocultures. La co-culture de CFBE41o- cellules avec THP-1 n’a pas induit de changement dans l’intégrité de barrière épithéliale par rapport à la monoculture (barres rouges). Lors de l’infection, la valeur TEER a chuté (barre verte). Après 1 h d’infection, certains échantillons ont été traités avec la tobramycine antibiotique (barre bleue), pendant 6 ou 20 h. Le traitement a préservé l’intégrité épithéliale de barrière, comme observé par le TEER supérieur. La figure 5C montre le pourcentage de libération de LDH comme indication de toxicité cellulaire lors de l’infection et du traitement de la tobramycine après 6 h. La co-culture elle-même a induit une libération de LDH, qui était la même pour les cellules infectées (environ 20%). Après 20 h d’infection, aucun signal de LDH n’a pu être détecté. Pour prouver la fiabilité de la LDH pour l’infection à long terme, PAO1-GFP a été incubé en milieu avec et sans LDH 1 U/mL par rapport aux contrôles non infectés respectifs (Figure supplémentaire S2C). Le signal de la LDH a été perdu après une incubation prolongée (20 h) avec P. aeruginosa, ce qui indique que la LDH n’est stable que dans des périodes d’incubation plus courtes dans les cultures infectées.
La figure 6 montre la cinétique des cytokines pro-inflammatoires détectées par l’intermédiaire d’ELISA. L’avantage d’une co-culture infectée des cellules CFBE41o- et THP-1 a été observé avec les sécrétions plus élevées des cytokines pro-inflammatoires. La sécrétion de certaines cytokines pro-inflammatoires était similaire (IL-6) ou plus élevée (IL-8, TNF-α, IL-1β) dans la coculture infectée (figure 6C) que dans les monocultures correspondantes (figures 6A-B). De façon inattendue, certaines cytokines des monocultures THP-1 (figure 6B)sont dérégulations dans des échantillons infectés (Il-8, TNFα, IL-1β).
La figure 7 démontre la libération de cytokines dans les mono- et les co-cultures lors de l’infection et du traitement avec la tobramycine mesurée par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 (Figure 7A) et de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 (Figure 7F)était plus élevée dans les co-cultures des cellules épithéliales et des macrophages, par rapport aux monocultures. Cependant, pour toutes les autres cytokines (IL-1 α, IL-12p40, IL-23 et GM-CSF) (Figures 7B–E), les niveaux de sécrétion de cytokine n’étaient pas plus élevés dans la co-culture que dans les monocultures respectives.
Figure 1 : Sections transversales et vues apiques de la coculture épithéliale-macrophage non infectée. (A) Vues croisées de la co-culture épithéliale-macrophage non infectée de 24 h. CFBE41o- rouge taché, macrophages THP-1 en jaune et noyaux en bleu (DAPI). (B) Vues apical de l’immuno-taché cfbe41o-monocouche non infecté pour ZO-1 (rouge). DAPI: noyaux. Barres d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Sections transversales et vues apiques de la coculture épithéliale-macrophage infectée. (A) Vues croisées et (B) vue apical de la co-culture épithéliale-macrophage à 6 h post-infection (hpi) avec P. aeruginosa PAO1-GFP. CFBE41o- tachés de rouge, les macrophages THP-1 en jaune, les noyaux en bleu (DAPI) et P. aeruginosa PAO1-GFP en vert. (B) Vues apical de la 6 h infectée CFBE41o-monocouche. Barres d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Cinétique de la transmigration des macrophages et de l’absorption des bactéries visualisée par section transversale du modèle 3D. Cinétique de l’infection pao1-GFP dans les monocultures des macrophages THP-1 (A–C) ou de la co-culture (D–F). Les macrophages THP-1 sont tachés en rouge, les noyaux de cellules épithéliales en bleu (DAPI) et P. aeruginosa en vert (GFP). Chaque figure est divisée en côtés atical et basolateral, l’espace entre les deux est considéré comme la membrane, qui est vide ou occupée par le CFBE41o- couche confluente (D–F). Les insertions dans les chiffres montrent l’absorption de bactéries par les macrophages à des moments différents (A–F). Barres d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Caractérisation de la survie pao1-gfp dans le cocultureconfocale traitée par la tobramycine e. (A–D) les micrographes confocals avec ou sans traitement. (A) Co-culture non traitée après 6 h d’infection. (B) Co-culture infectée traitée avec la tobramycine 6 μg/mL (Tob) pendant 6 h. (C) Co-culture non traitée 20 h post-infection, (D) co-culture infectée traitée avec la tobramycine 6 μg/mL pendant 20 h. Noyaux tachés de DAPI (bleu), macrophages (rouge) et P. aeruginosa GFP (vert). (E) Unités de formation de colonies (CFU) de bactéries adhérentes/intériorisées après 6 et (F) 20 h avec traitement à la tobramycine 6 μg/mL. L’insertion de membrane vide a été employée comme substrat abiotique pour développer PAO1-GFP. ANOVA bidirectionnel avec le test de comparaisons multiples de Tukey (# pas de colonies) a été utilisé, *p < 0.05; p < 0,001; p < 0,0001; ns: pas significatif. Les barres d’erreur indiquent l’écart type, n = 9–27 répliques d’expériences indépendantes 3–9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Intégrité des barrières et évaluation de la viabilité de la monoculture et de la coculture. Les conditions de coculture suivantes ont été évaluées : non infectées (barres grises), infectées (barres vertes) ou infectées et traitées par la tobramycine (barres bleues). (A) Résistance électrique transépithéliale après 6 h et (B) 20 h d’infection dans les monocultures (CFBE41o- et THP-1) et la co-culture. (C) Cytotoxicité de mono- et co-culture mesurée par libération de LDH 6 h post-infection. ANOVA bidirectionnel avec le test de comparaisons multiples de Tukey a été utilisé; *p < 0,05; p < 0,0001; ns: pas significatif. Les barres d’erreur indiquent l’écart type; n = 9 répliques de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Cinétique de la libération de cytokine de supernatants mono- et co-culture non infectés et infectés évalués par l’intermédiaire de l’ELISA. ELISA a été fait selon le protocole du fabricant du kit. (A) CFBE41o-, (B) THP-1 et (C) co-culture libérant IL-8, TNF-α, IL-1β et IL-6. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. n = 6 répliques de 2 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Résultats supernatants du panneau de cytokine mesurés par facs avec et sans tobramycine 6 μg/mL pour 6 h après l’infection. Supernatants de mono- et co-culture après 6 h post-infection utilisé pour analyser les cytokines respectives IL-8 (A), IL-1α (B), IL12p40 (C), IL-23 (D), GM-CSF (E) et IL-10 (F). La barre d’erreur indique l’écart type, n = 9 répliques de 3 expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire S1 : Contrôle des expériences pour les étapes critiques du protocole. (A, B) Micrographes de cellules CFBE41o- dans des plaques de 24 puits cultivées pendant 2 jours à densité de 2 x 105 cellules/puits. (A) CFBE41o- cellules dans PBS pendant 30 min, et (B) cellules traitées à l’eau après 30 min après le grattage avec une pipette. (C) Viabilité des cellules de mammifères après centrifugement. Les cellules CFBE41o- ont été retirées du flacon de culture cellulaire T75 tel que décrit aux étapes 1.1.1 et 1.1.2. 100 μL de suspension cellulaire résultante a été analysé dans la solution isotonique de 10 mL. Un compteur cellulaire automatisé a été utilisé pour évaluer la viabilité des cellules individuelles. Ensuite, les suspensions cellulaires respectives ont été centrifugées à 300 x g pendant 4 min, suspendues de nouveau et comptées à nouveau. Les barres d’erreur indiquent l’écart type, n = 6 flacons différents de 2 expériences individuelles. (D) Viabilité de PAO1-GFP après centrifugement. Les bactéries PAO1-GFP ont été diluées à OD = 0,01 dans le milieu cellulaire. L’UC a été évaluée au moyen d’une rangée de dilution 10 fois et de plaques LB incubées pendant la nuit à 30 °C. Les tubes en plastique respectifs ont été centrifugés à 21 250 x g pendant 10 min et re-suspendus en milieu. L’EC A été évaluée de nouveau en conséquence. T-test de l’étudiant à deux queues, * p < 0,033. La barre d’erreur indique l’écart type, n = 6 des 2 expériences. EE) Viabilité des bactéries après la congélation. Les bactéries PAO1-GFP ont été préparées comme dans (D) et CFU a été analysée, puis les tubes en plastique ont été congelés pendant une journée à -20 °C et décongelés pour évaluer à nouveau l’UC. T-test de l’étudiant à deux queues, *** p < 0,001. Les barres d’erreur indiquent l’écart type, n = 6 des deux expériences. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Expériences de contrôle pour évaluer le comportement et l’influence de la tobramycine. (A) Expérience de contrôle pour évaluer la cytotoxicité après 20 h d’incubation avec 6 μg/mL tobramycine. Mono- et co-culture a été faite comme décrit dans le protocole, mais les cellules ont été cultivées pendant 2 jours sur des plaques de 24 puits et les cellules de THP-1 ont été ensemencées apoly. Les cellules présentant une tobramycine ou des témoins de 6 μg/mL ont été incubées pendant 20 h. One-Way ANOVA, test de comparaisons multiples de Tukey, *** p < 0,001. La barre d’erreur indique l’écart type, n = 6 des 2 expériences (CFBE41o-), n = 3 d’une expérience (THP-1 et co-culture). (B) Contrôle-ELISA des supernatants de mono- et de co-culture avec/sans tobramycine. La culture cellulaire a été faite selon (A) pour montrer aucune libération de cytokine comparée aux contrôles pour toutes les conditions. ELISA a été fait à l’étape 7.1 et 7.2, 10 μg/mL (LPS) a été ajouté comme contrôle, il-8 libération pour les contrôles traités par LPS contenant THP-1 était plus élevé que détectable. ANOVA bidirectionnel, test de comparaisons multiples de Tukey, ns p > 0,12; * p < 0,033; p < 0,001. Les barres d’erreur indiquent l’écart type, n = 6 de deux expériences, n = 3 d’une expérience (contrôle LPS). (C) Dégradation de la LDH due à une prolifération excessive pao1-gfp. LDH a été ajouté à la concentration de 1 U/mL au MEM Medium. Soit le milieu LDH ou le milieu de commande a été utilisé pour diluer les cellules à OD = 0,01 (correspond à 1 x 108 CFU/mL) et ensuite incubé pendant 20 h. LDH test a été fait comme décrit à la section 6. One-Way ANOVA, test de comparaisons multiples de Tukey, ns p > 0,12; p < 0,001. La barre d’erreur indique l’écart type, n = 8–9 de trois expériences individuelles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Cet article décrit un protocole pour une co-culture 3D des voies respiratoires infectées, constitué par la ligne de cellules épithéliales bronchiques de fibrose kystique humaine CFBE41o- et la ligne de cellules macrophages humaines dérivées de monocytes THP-1. Le protocole permet l’évaluation de l’intégrité des barrières épithéliales, de la transmigration des macrophages, de la survie des bactéries et de l’inflammation, qui sont des paramètres importants lors de l’essai simultané de l’efficacité des médicaments et des réponses de l’hôte. La nouveauté du modèle réside dans l’incorporation de cellules épithéliales (c’est-à-dire la lignée cellulaire et les macrophages humains) avec une infection bactérienne aiguë (c.-à-d. p. aeruginosa). L’infection aiguë dans les cellules épithéliales est démontrée pour être contrôlée par un antibiotique (c.-à-tobramycine). Outre l’utilisation d’une lignée cellulaire humaine des FC, l’ensemble du modèle est mis en place dans des conditions d’ALI, ce qui est beaucoup plus proche des conditions physiologiques dans les FC. L’utilisation d’une lignée cellulaire des FC met en œuvre certaines des caractéristiques de la maladie dans le modèle. La mutation du régulateur de conductance transmembrane de mucoviscidose (CFTR) est directement liée à la dysrégulation du transport épithélial de fluide dans les poumons. En outre, les mutations dans le gène de CF, telles que le ΔF508, ont comme conséquence le mucus épais, avec l’inflammation et les dommages graves de poumon sur l’infection avec P. aeruginosa4. Ces manifestations pathologiques causées par le CFTR dysfonctionnel impliquent potentiellement l’affaiblissement d’autophagie comme mécanisme cellulaire important lié à la pathogénie de la maladie pulmonaire de CF18. Cependant, le CFBE41o- ne parviennent pas à secret mucus, qui est une limitation de cette ligne cellulaire. S’il est destiné à étudier plus spécifiquement le rôle du mucus, le protocole peut être adapté en utilisant d’autres lignées cellulaires bronchiques (p. ex., Calu-3).
Une étape critique pour mettre en place ce protocole est la combinaison des cellules épithéliales et immunitaires et l’infection suivante avec P. aeruginosa à ALI. L’infection de CFBE41o- par P. aeruginosa in vitro a déjà été décrite, principalement à l’aide d’une chambre à débit, complétée par de l’arginine dans les milieux de culture, pour améliorer la survie des cellules épithéliales et soutenir la formation de biofilms19. Le protocole actuel visait un nouveau modèle utilisant uniquement des cellules humaines, qui, en outre, pourraient être cultivées à ALI sur des inserts perméables de plaque de puits pour le débit d’échantillon plus élevé. L’inclusion de macrophages différenciés THP-1 comme lignée cellulaire immortalisée par l’homme, au lieu d’être dépendante de l’obtention de cellules primaires reproductibles auprès des donneurs, est un autre avantage de notre modèle. En ajoutant ces macrophages au côté basolatéral du support membranaire perméable, on a observé que les macrophages dépassaient et ont finalement trans migré vers le côté apical de la barrière épithéliale cultivée par filtre. Une variante de ce protocole pourrait être l’ajout de macrophages directement sur le côté apical sur le dessus des cellules épithéliales, comme décrit par Kletting et al. 14. La coculture des cellules immunitaires et pulmonaires non humaines a déjà été décrite auparavant. Ding et coll. 10 cellules de carcinome de poumon de Lewis de souris utilisées sur des appuis perméables d’insertion en combinaison avec des macrophages sur le côté basolateral et infectées par S. aureus, un autre agent pathogène critique de l’infection chronique dans les patients de CF. Cependant, dans cette étude, on ne s’est pas concentré sur la fibrose kystique ou sur l’utilisation de la coculture comme plate-forme pour l’évaluation de l’efficacité des médicaments. Notre protocole peut être adapté pour d’autres infections bactériennes, telles que Staphylococcus aureus, Mycobacterium abcèsus, ou Burkholderia cepacia— agents pathogènes importants dans les poumons de LAFC.
Une autre étape critique est l’ajout de macrophages THP-1 aux cellules en renversant les inserts perméables à l’envers (section 2). Ceci est crucial pour évaluer la transmigration de macrophage par le puits du côté de l’infection. Le processus d’imagerie ultérieur des modèles 3D avec des piles z, et la vue transversale, peut être effectué pour observer l’intérieur des macrophages et détecter l’absorption des bactéries (Figure 3). À 1 hpi, les bactéries appliquées sur le côté apical migrent à travers la membrane, tandis que la migration et l’absorption des macrophages n’ont lieu qu’à 3 hpi. Par conséquent, après 1 h d’infection, il était approprié de commencer le traitement avec la tobramycine et ont la possibilité d’aborder à la fois la survie des cellules hôtes et des bactéries pendant une longue période (20 h). Au cours du protocole, le maintien de la stérilité est un problème critique en raison de la multitude d’étapes qui comportent chacun le risque de contamination. Néanmoins, le personnel expérimenté de la culture cellulaire sera en mesure de suivre ce protocole après une préparation et une formation appropriées. Le milieu cellulaire doit être régulièrement vérifié pour la contamination, de préférence après toutes les étapes critiques.
Comme pour tout modèle, la co-culture infectée a également certaines limites; par exemple, l’intégration des cellules de macrophage. Ici, il était important d’avoir des macrophages sur le côté basolatéral; cependant, la manipulation de l’insert avec une couche épithéliale précédemment cultivée peut avoir fourni des dommages précoces et des perturbations à la co-culture. Bien que le modèle de soutien perméable fournissait des caractéristiques à haut débit, ce qui n’a pas été observé dans les co-cultures antérieures du poumon infecté par les FC20,21. Avec cela, d’autres expériences doivent évaluer les limites de l’utilisation de THP-1 comme substitut de macrophage. Bien que cette lignée cellulaire soit largement utilisée, elle est moins sensible au LPS22 et elle manque d’activation complète et l’ensemble de la population n’est pas différenciée des monocytes aux cellules macrophage23. Une autre limitation est l’absence d’autres composantes clés de l’infection des FC et de l’administration de médicaments. La ligne cellulaire CFBE41o- ne possède pas de cils et ne produit pas de mucus, ce qui arrive habituellement 20-30 jours de culture cellulaire à ALI. Comme ce n’était pas le cas pour CFBE41o- ligne cellulaire, nous avons utilisé les cellules après sept jours quand une barrière épithéliale serrée a été formée. Le dégagement mucociliaire modifie les conditions de résidence des microbes24 ou des particules de drogue9,,25 et les modèles in vitro évaluant le dépôt pulmonaire devraient en tenir compte. Contrairement à ce qui est observé par d’autres cellules, la culture tissulaire insère le revêtement avec un matériau de matrice extracellulaire (comme la fibronectine ou le collagène I) ne montrent pas une différence significative pour CFBE41o-, par exemple dans TEER26. Par conséquent, les filtres perméables n’ont pas été recouverts d’un matériau de matrice extracellulaire dans ce protocole.
Avec le protocole décrit ici, mono et co-cultures après l’infection de 6 h fournissent la libération suffisante de cytokine pour être employées comme mesure dans le futur essai de drogue. La co-culture apporte un avantage de la coopération cellulaire dans la modélisation de la réponse immunitaire. On s’attendait à ce que l’inefficace de la tobramycine dans la réduction de l’inflammation ne soit pas éliminée puisque toutes les bactéries n’ont pas été éliminées pendant le traitement (figure 4E, F). Néanmoins, la modélisation de la réponse à la tobramycine dans un modèle de CF est cruciale, car la tobramycine (en concentrations plus élevées) peut être efficace dans l’inhibition de P. aeruginosa, même sur le biofilm19,27. Une possibilité pour l’utilisation ultérieure de ce protocole est d’intégrer les médicaments anti-inflammatoires dans le traitement. La recommandation globale concernant les réponses inflammatoires serait d’utiliser le traitement de courte durée (6 h), qui a encore la cellule hôte et les bactéries présentes. Après ce point de temps, les cellules hôtes sont détruites dans des échantillons non traités. ELISA et FACS pourraient être utilisés pour mesurer la libération de cytokines. Enfin, si les échantillons sont stockés plus de 15 jours à -80 °C, il est recommandé de vérifier la fiabilité des cytokines en utilisant, par exemple, un contrôle positif des échantillons frais (p. ex. les cellules stimulées par le LPS).
Certaines modifications du protocole sont possibles. Par exemple, le protocole actuel peut être étendu à l’application des médicaments nébulisés (étape 3.6). Ceci est nécessaire pour modéliser l’administration de médicaments pulmonaires par inhalation orale. La nébulisation des médicaments solubles dans l’eau, comme la tobramycine, ou des nano-porteurs de ces médicaments, comme la colistine liposomale, est relativement simple par les dispositifs disponibles dans le commerce couramment utilisés dans la clinique. En outre, il existe plusieurs dispositifs disponibles dans le commerce pour déposer des aérosols sur les inserts de culture cellulaire. En outre, comme le modèle décrit ici est basé sur des supports membranaires perméables, il pourrait également être adopté à certains dispositifs microfluidiques contemporains (par exemple « poumon sur une puce ») par exemple, pour étudier l’influence de la respiration et les étirements mécaniques connexes et les changements dans le flux d’air. En outre, ce protocole pourrait être modifié par l’ajout de mucus ou de remplacement par des cellules primaires en fonction de la question scientifique à traiter. Une autre étape intéressante prochaine serait l’essai des nanomédecines, d’autant plus que la nanotechnologie fait des progrès dans le développement de nouveaux anti-infectieux28, cf correcteurs29 et co-livraison d’antibiotiques et pathoblockers30. Dans l’ensemble, le protocole actuel peut être perçu comme utile pour évaluer la survie bactérienne sur traitement antibiotique dans un système complexe, ainsi que quelques lectures liées à l’hôte : cytotoxicité cellulaire, intégrité des barrières épithéliales, transmigration de macrophage et réponse inflammatoire. Ce sont des paramètres essentiels pour le développement de médicaments.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont bénéficié d’un financement du programme HORIZON 2020 de l’Union européenne pour la recherche, le développement technologique et la démonstration dans le cadre de l’accord de subvention no 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - Conception et développement de nanomédecines avancées pour surmonter les barrières biologiques et traiter les maladies graves. Nous remercions le Dr Ana Costa et le Dr Jenny Juntke pour le grand soutien apporté au développement de la co-culture, Olga Hartwig, pour l’illustration scientifique, Anja Honecker, pour les tests ELISA, Petra König, Jana Westhues et le Dr Chiara De Rossi pour le soutien à la culture cellulaire, à l’analyse et à la microscopie. Nous remercions également Chelsea Thorn d’avoir relu notre manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, Germany | HP62.1 | |
| CASY TT Cell Counter and Analyzer | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| Centrifuge Universal 320R | Hettich, Germany | 1406 | |
| CFBE41o- cells | 1. Gruenert Cell Line Distribution Program 2. Sigma-Aldrich |
1. gift from Dr. Dieter C. Gruenert 2. SCC151 |
|
| Chopstick Electrode Set for EVOM2, 4mm | World Precision Instruments, Sarasota, USA | STX2 | |
| Confocal Laser-Scanning Microscope CLSM | Leica, Mannheim, Germany | TCS SP 8 | |
| Cytokines ELISA Ready-SET-Go kits | Affymetrix eBioscience, USA | 15541037 | |
| Cytokines Panel I and II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA). | 740102 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) Glucose | Merck | 47829 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments, Sarasota, USA | EVOM2 | |
| Falcon Permeable Support for 12 Well Plate with 3.0μm Transparent PET Membrane, Sterile | Corning, Amsterdam, Netherlands | 353181 | |
| Fetal calf serum | Lonza, Basel, Switzerland | DE14-801F | |
| Goat anti-mouse (H+L) Cross-adsorbed secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), rabbit muscle | Roche, Mannheim, Germany | 10127230001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich, Germany | L2897-1KG | |
| MEM (Minimum Essential Medium) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| P. aeruginosa strain PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa strain PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| Phosphate buffer solution buffer | Thermo Fischer | 10010023 | |
| Petri dishes | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, Germany | P8139-1MG | |
| Precision Cover Glasses | ThorLabs | CG15KH | |
| Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibody | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco by Lifetechnologies, Paisley, UK | 11875093 | |
| Soda-lime glass Petri dish, 50 x 200 mm (height x outside diameter) | Normax, Portugal | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, Germany | S4521 | |
| T75 culture flasks | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 cells | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; Braunschweig, Germany) | No. ACC-16 | |
| Tobramycin sulfate salt | Sigma | T1783-500MG | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich, Germany | P1754 |
References
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
- Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
- Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
- Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186 (2010).
- Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
- Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
- Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
- Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
- Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13 (2016).
- Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
- Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
- Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
- Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
- Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31 (2019).
- Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
- Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
- Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
- Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
- Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
- Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
- Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
- Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
- Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
- Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
- Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).
