Summary
Her præsenteres en protokol til optisk udvinding og katalogisering af medfødte cellulære fluorescenssignaturer (dvs. cellulær autofluorescence) fra hver enkelt levende celle fordelt i et tredimensionelt rum. Denne metode er velegnet til at studere den medfødte fluorescenssignatur af forskellige biologiske systemer ved en enkeltcellet opløsning, herunder celler fra bakterier, svampe, gær, planter og dyr.
Abstract
Beskrevet her er konfokal refleksion mikroskopi-assisteret single-celle medfødt fluorescens analyse (CRIF), en minimalt invasiv metode til rekonstruktion af den medfødte cellulære fluorescens signatur fra hver enkelt levende celle i en befolkning fordelt i en tre-dimensionel (3D) rum. Den medfødte fluorescens signatur af en celle er en samling af fluorescens signaler udsendes af forskellige biomolekyler i cellen. Tidligere undersøgelser fastslog, at medfødte fluorescenssignaturer afspejler forskellige cellulære egenskaber og forskelle i fysiologisk status og er en rig informationskilde til cellekarakterisering og identifikation. Medfødte fluorescenssignaturer er traditionelt blevet analyseret på befolkningsniveau, hvilket nødvendiggør en klonisk kultur, men ikke på encellet niveau. CRIF er særligt velegnet til undersøgelser, der kræver 3D-opløsning og/eller selektiv udvinding af fluorescenssignaler fra de enkelte celler. Fordi fluorescenssignaturen er en medfødt egenskab af en celle, er CRIF også velegnet til tagfri forudsigelse af typen og / eller fysiologisk status for intakte og enkelte celler. Denne metode kan være et kraftfuldt værktøj til strømlinet celleanalyse, hvor fænotypen for hver enkelt celle i en heterogen population kan vurderes direkte ved sin autofluorescence signatur under et mikroskop uden cellemærkning.
Introduction
Forskellige biomolekyler i en celle1 udsender autofluorescence signaler, og den medfødte fluorescens signatur af en celle består af samlingen af disse signaler. Denne signatur fluorescens afspejler forskellige cellulære egenskaber og også forskelle i fysiologisk status. Analyse af medfødt fluorescens er minimalt invasiv og kan supplere traditionelle, mere invasive mikrobiologiske sonder, der efterlader en række spor fra mild metabolisk modifikation til fuldstændig celledestruktion. Mens traditionelle teknikker såsom DNA eller celleindhold ekstraktion2,3, fluorescerende in situ hybridisering4, og indførelsen af fluorescerende reporter gener til genomet er effektive til at bestemme celletype eller fysiologisk status, de almindeligvis kræver enten manipulation af cellerne eller invasive mærkning.
Undersøgelser af medfødt fluorescens af forskellige levende og intakte mikrobielle kolonier, herunder bulk mikrobielle kultur suspensioner5,6, aktiv slam7, pattedyr væv8,9, og pattedyr celler1,10, har vist, at medfødt fluorescens analyse letter tag-fri analyse af celletyper og fysiologisk status. Medfødte fluorescenssignaturer er traditionelt blevet analyseret på befolkningsniveau og ikke på enkeltcelleniveau og kræver dermed en klonisk kultur. I modsætning hertil rekonstruerer og katalogiserer den confokale reflection-mikroskopi-assisteret enkeltcellet innat fluorescence-teknik (CRIF), der er beskrevet her, den medfødte cellulære fluorescenssignatur for hver enkelt levende mikrobiel celle. Desuden kan CRIF systematisk samle den medfødte fluorescenssignatur for en enkelt mikrobiel celle i en population, der er fordelt i et tredimensionelt (3D) rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af prøven
- Placer en 1 mm tyk silikonepakning med brønde på en glasrutschebane.
- Placer en 1 mm tyk 0,8% (w /v) agaroseplade i brønden af silikonepakningen.
- Udvandes celletætheden af en vilkårlig mikrobiel cellekultur til en optisk densitet ved 600 nm (OD660) = 1,0.
- Placer en 5 μL aliquot af celle suspension på agarose plade.
- Dæk forsigtigt med en glasovertræk.
2. Opsætning af et mikroskop
BEMÆRK: CRIF-teknikken kombinerer konfokal refleksionsmikroskopi (CRM) og multikanalkonspektroskopi. CRM fungerer som informationskilde for cellulær morfologi og rumlig lokalisering, som er uafhængig af cellulær medfødt fluorescens. Multikanal konfokal mikrospektroskopi giver spektrale oplysninger om cellulær medfødt fluorescens. I den følgende protokol kaldes ethvert billede, der er erhvervet med CRM eller konfokal fluorescensmikroskopi, henholdsvis et CRM-billede eller multikanalkonspektroskopibillede.
- Tilslut et konfokalt mikroskop med descanne spektralkanaler til et fotomultiplierrør (PMT) eller GaAsP-detektor.
BEMÆRK: Disse opsætninger er tilgængelige fra flere producenter. - Udstyr mikroskopet med et højt numerisk blændemål (NA) med tilstrækkelig forstørrelse.
BEMÆRK: Et 63x-mål med NA > 1.4 anbefales til analyse af bakterieceller. - Udstyr mikroskopet med et spejl med halv refleksion (f.eks. NT 80/20) for at imødekomme CRM, som er afhængig af den cellulære spredning af hændelseslys for at visualisere cellemorfologi.
- For multikanal konfokal mikrospektroskopi, udstyre mikroskopet med dichroic spejle. Brug f.eks. MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 eller MBS 488/543/633 strålekløvere til henholdsvis 405, 458, 488, 514, 543 eller 633 nm excitation.
- Juster belysningsintensiteten for hver excitationsbølgelængde ved hjælp af en lasereffektmåler. Hold output under mikroskopet konstant gennem excitation bølgelængder (f.eks bruge 50 μW med 63x målet).
3. Billedopsamling
- Indstil pinhole størrelse til 1 AU ved hjælp af mikroskop software.
- Indstil pixelboiden (dvs. scanningshastighed) for hver excitationsbølgelængde.
BEMÆRK: En alt for lang pixelbebotid kan beskadige celler. Undgå for lang pixel dvæle tid til at minimere fotodamage til cellerne. For bakterieprøver er en pixelbebotid <55,6 μs/μm2 (når bestrålingseffekten under mikroskopet er ~17 μW/cm2) normalt egnet til at undgå væksthæmning. Denne parameter kan variere afhængigt af organismer og eksperimentelle opsætninger. - Indstil scanningsopløsningen. For små celler som bakterier, bruge et scanningsområde på 1.024 x 1.024.
- Indstil Z-scanningsområdet, så interesseområdet er dækket.
BEMÆRK: For bakterie- og gærcelleprøver fordelt på en agaroseplade er et Z-scanningsområde på ~ 15 μm normalt tilstrækkeligt. - Indstil den descanne detektor til at fange det synlige bølgelængdeområde (f.eks. 416−691 nm). Brug et spektralvindue på 8−10 nm.
- Erhverve multikanal konfokal mikrospektroskopi billeder i en sekvens fra længste til korteste excitation bølgelængder til at skabe Z-stakke af fluorescens billeder.
- Hent CRM-afbildninger.
- Gem de erhvervede billeder som 16-bit tiff-filer i en mappe. Navngiv filerne ved hjælp af navngivningskonventionen XXXcYYzZZ.tif, hvor XXX er excitationsbølgelængden, YY er detektorkanalnummeret, ZZ er Z-slice-nummeret, og "c" og "z" er præfikser for henholdsvis detektornummeret og Z-slice-nummeret.
- For eksempel, hvis en multikanal konfokal mikrospektroskopi billede er taget med en excitation bølgelængde på 405 nm, 1st detektor kanal af detektoren array, og er den 5. skive af Z-stakken, navngive det "405c01z05.tif". I CRM-billeder skal du bruge strengen "CRM" i stedet for XXX (f.eks. "CRMc01z05.tif").
BEMÆRK: Beslut, om 2D- eller 3D-segmentering er bedst egnet til billeddataene. Brug en 2D-segmenteringsmetode i situationer, hvor små celler er begrænset til et 2D-plan (f.eks. bakteriepopulation, der klæber til en glasoverflade). Brug 3D-segmenteringsmetoden i situationer, hvor cellepopulationen fordeles i et tredimensionelt rum (f.eks. biofilm og vævsprøver), eller cellestørrelserne er større end tykkelsen af den optiske skive (f.eks. gærceller, pattedyrceller). For 2D-segmentering henvises til afsnit 4; for 3D-segmentering henvises til afsnit 5.
- For eksempel, hvis en multikanal konfokal mikrospektroskopi billede er taget med en excitation bølgelængde på 405 nm, 1st detektor kanal af detektoren array, og er den 5. skive af Z-stakken, navngive det "405c01z05.tif". I CRM-billeder skal du bruge strengen "CRM" i stedet for XXX (f.eks. "CRMc01z05.tif").
4. 2D-billedanalyse
- Udstyre en arbejdsstation med billedanalyse software (f.eks MATLAB).
- Udfør cellesegmentering og rekonstruktion af enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer.
- Åbn billedanalysesoftwaren.
- Dobbeltklik og åbn et af de medfølgende scripts "Script2D.m".
- Gå til fanen Editor , og klik derefter på Kør. Der skal vises et vindue til valg af mapper.
- Vælg den mappe, der blev oprettet i trin 3.8, og klik derefter på Åbn for at fortsætte. Der vises automatisk en dialogboks, der beder om input af segmentationsparameteren.
BEMÆRK: Til testformål skal du vælge det angivne datasæt ("Sample_2D"). Eksempeldatasættet leveres som en komprimeret fil og skal udtrækkes på forhånd. - Input af segmenteringsparametrene: Tærskel for placering af billede (0−1) for placering af billeder = 0,45, øvre tærskel for et celleområde (i pixel) = 200, nedre tærskel for et celleområde (i pixel) = 10 og Antallet af detektorer = 32. Klik på OK for at fortsætte.
BEMÆRK: Disse parametre kan kræve justering afhængigt af billedkvaliteten. - Der skal vises et nyt billedvindue, der præsenterer et CRM-billede. Vælg et vilkårligt baggrundsområde (dvs. område, hvor celler er fraværende), der skal bruges til baggrundsfratrækning. Tegn et rektangel i CRM-billedet ved at trække musen. Dobbeltklik i det valgte område for at bekræfte markeringen.
- Find en ny mappe med navnet Signatur i den samme mappe, der blev valgt i trin 4.2.4.
BEMÆRK: Den angivne kode opretter automatisk denne mappe. Mappen "Signature" gemmer den medfødte fluorescenssignatur for hver mikrobiel celle i en population, da .png filer, der nummererer serielt efter et fælles præfiks "Signature".
5.3D billedanalyse
- Udstyre en arbejdsstation med billedanalyse software (Tabel over materialer).
- Udfør cellesegmentering og rekonstruktion af enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer.
- Åbn billedanalysesoftwaren.
- Dobbeltklik på og åbn det medfølgende script "Script3D.m".
- Gå til fanen Editor , og klik derefter på Kør. Der skal vises et vindue til valg af mapper.
- Vælg den mappe, der blev oprettet i trin 3.8, og klik derefter på Åbn for at fortsætte. Der vises automatisk en dialogboks, der beder om input af segmenteringsparametrene.
BEMÆRK: Til testformål skal du vælge det medfølgende datasæt ("Sample_3D"). Eksempeldatasættet leveres som en komprimeret fil og skal udtrækkes på forhånd. - Input af segmenteringsparametrene: Tærskel for placering af billede (0-1) for billedplacering = 0,01, øvre tærskel for en cellevolumen (i pixel) = 1.000, Nedre tærskel for et celleområde (i pixel) = 20, X PixelStørrelse [μm/pixel] = 0,26, Y Pixel Size [μm/pixel] = 0,26, Z pixel Size [μm/pixel] = 0,42 og Antallet af detektorer = 32. Klik på OK for at fortsætte. en dialogboks, der beder inputtet for antallet af excitationsbølgelængder vises.
BEMÆRK: Disse parametre kan kræve justering afhængigt af billedkvaliteten. - Input antallet af bølgelængder, der anvendes til billedopkøb (f.eks. hvis der anvendes 405, 488, 561, 630, skal du indtaste 4 i dialogboksen). Klik på OK.
- Indtast excitation bølgelængder i en sekvens fra korteste (dvs. boks navn: Excitation Nr. 1) til længste bølgelængde i dialogboksene. Klik på OK for at fortsætte. Der skal vises et nyt billedvindue, der viser et CRM-billede.
- Vælg det vilkårlige baggrundsområde (dvs. det område, hvor cellerne er fraværende), der skal bruges til baggrundsfratrækning. Tegn et rektangel i CRM-billedet ved at trække musen. Dobbeltklik i det valgte område for at bekræfte markeringen.
- Find den mappe med navnet Signatur i den mappe, der blev valgt i trin 5.2.4.
BEMÆRK: Den angivne kode opretter automatisk denne mappe. Mappen "Signature" gemmer den medfødte fluorescenssignatur for hver enkelt mikrobiel celle i en population, da .png filer, der nummererer serielt efter et fælles præfiks "Signature".
6. Statistisk analyse
BEMÆRK: Udfør dimensionsreduktionsteknikker (f.eks. hovedkomponentanalyse [PCA]) for at visualisere fordelingen af hyperspektrum i cellepopulationerne. Det medfølgende script (PCA.py) udfører PCA for to cellepopulationer (dvs. to klasser).
- Udstyre en arbejdsstation med programmeringssproget og ledsagende biblioteker og moduler (Tabel over materialer).
- Opret en tom mappe i C-drevet (eller tilsvarende), og navngiv mappen "Parent_directory" (dvs. Parent_ mappe).
- Gem fluorescenssignaturerne (f.eks. de .png filer, der blev genereret i trin 4.2.7) af hver af de to cellepopulationer, i to separate mapper.
BEMÆRK: De to mapper skal begge være placeret i "Parent_directory".
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Signature01.png Signature02.png :putidaKT2442/
Signature01.png
Signature02.png
: - Download PCA.py i "Parent_directory".
- Åbn arbejdsstationens kommandolinjegrænseflade.
- Skriv "python C:/Parent_directory/PCA.py" i kommandolinjegrænsefladen.
- Vælg "Parent_directory", når meddelelsen 'Vælg destinationsmappe' er vist.
- I "C:/Parent_directory" skal du finde "PCA.png", som indeholder et resulterende PCA-plot.
putidaKT2440/
Signature01.pngSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser den typiske encellede fluorescenssignatur for en bakteriecelle, der præsenteres som et traditionelt spektrumplot (øverst) og som et varmekort (midten). Figur 1B viser resultatet af en nøjagtig segmentering af 2D-celler, der er overlejret over det oprindelige CRM-billede af en population af jordbakterier (Pseudomonas putida KT2440)12. De resulterende medfødte fluorescenssignaturer for befolkningen præsenteres som et varmekort i figur 1D. Bemærk, at variabiliteten inden for befolkningen var relativt lille efter vellykket cellesegmentering. Et eksempel på unøjagtig cellesegmentering er vist i figur 1C, som er overlejret på den samme population af P. putida som vist i figur 1B. Virkningen af unøjagtig cellesegmentering på befolkningens medfødte fluorescenssignaturer fremgår let af det betydelige antal outliers (figur 1E, røde trekanter). Unøjagtig cellesegmentering resulterede i en løsere klynge efter PCA sammenlignet med den stramme klynge opnået efter nøjagtig cellesegmentering (Figur 1F).
Typisk, på trods af intraspecies variabilitet, medfødte fluorescens signaturer af forskellige celletyper danner forskellige klynger. Figur 2C præsenterer resultatet af PCA-analyser for et taksonomisk tæt par stammer (P. putida-stamme KT2440 og stamme KT244213). På trods af den mindre variation, der blev observeret inden for hver enkelt population (figur 2A, B), dannede hver population en særskilt klynge på PCA-analyseområdet (figur 2C).
Figur 3A viser resultatet af nøjagtig 3D-cellesegmentering overlejret over det oprindelige CRM-billede af en population af spirende gær Saccharomyces cerevisiae YM427114. Figur 3B viser de deraf følgende medfødte fluorescenssignaturer for befolkningen.
Figur 1: Nøjagtigheden af segmentering og tilsyneladende intraspecies variabilitet. (A) Typisk enkeltcellet medfødt fluorescenssignatur for en bakteriecelle (P. putida KT2440), præsenteret som et spektrumplot (øverst) og et varmekort (midten). Emissionen bølgelængde er angivet som en regnbue farve kort (nederst). Y-aksen på spektrumplottet og varmekortets farve angiver begge de relative fluorescensintensiteter. Tallene i bunden angiver excitation bølgelængde. Visuel repræsentation af algoritmen til billedanalyse (A) (B) og unøjagtig (C). Lyseblå skygge angiver celleområder, der er påvist for en population af jordbakterie P. putida KT 2440. Klatter med rød nummerering i panel C er eksempler på falsk detektion, hvor algoritmen klassificerede ikke-celleområder (dvs. baggrundsstøj) som celleområder på grund af uhensigtsmæssige indstillinger for binariseringstærskel. Skalastænger = 1 μm hele vejen igennem. Panel D og E skildrer de medfødte fluorescenssignaturer for den samme population, genereret med henholdsvis nøjagtig og unøjagtig cellesegmentering. Hver kolonne viser et rekonstrueret encellet hyperspektrum på en matrix på 1 x 192, hvor det gul-til-blå farvekort angiver relativ fluorescensintensitet. (F) Variansen af medfødte fluorescenssignaturer i nøjagtige (lyseblå) og unøjagtige (røde) segmenter visualiseret ved hjælp af PCA. Hver akseetiket angiver komponentnummeret og dets kumulative procentvise bidrag til PCA-analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Intra- og interspecies variabilitet af medfødte fluorescenssignaturer. Medfødte fluorescenssignaturer præsenteret som varmekort for en population af P. putida KT2440 (A) og P. putida KT2442 (B). (C) Projektion af de to medfødte fluorescenssignaturpar visualiseret ved hjælp af PCA, svarende til P. putida KT2440 (rød, n = 288) og P. putida KT2442 (blå, n = 373). X- og Y-akser repræsenterer henholdsvis PC1 og PC2. Indsat tal angiver midten af hver klynge (1: P. putida KT2440, 2: P. putida KT2442). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempel på 3D-segmentering og medfødt udvinding af fluorescenssignatur. A) 3D-projektion af regioner, der er anerkendt som cellepopulationer af spirende gær S. cerevisiae YM4271. De indsatte numre er identifikationsnumrene. B) Varmekort over medfødte fluorescenssignaturer udvundet fra 3D-regionerne. X-aksenummeret svarer til identifikationsnummeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to kritiske punkter i denne metode, der skal følges nøje for at opnå reproducerbare resultater: 1) holde laser effekt under mikroskop mål konsekvent gennem excitation bølgelængder og eksperimenter, og 2) udføre nøjagtige celle segmentering.
Det første punkt er særlig vigtigt, når man sammenligner den medfødte fluorescenssignatur mellem forskellige eksperimenter. Undgå blot at anvende de samme "procent output" indstillinger til excitation bølgelængder (dvs. ved hjælp af 5% effekt for alle 405, 488, 514 og 530 nm laser linjer), fordi den maksimale effekt kan variere op til en størrelsesorden mellem laser linjer. Derudover har målet og den interne optik normalt ujævne optiske absorptionsegenskaber, som også skal tages højde for. Af disse grunde anbefales det faktisk at måle outputtet under målet ved hjælp af en lasereffektmåler (Materialetabel). At tage denne måling hvert par eksperimenter, eller med jævne mellemrum, anbefales også, fordi produktionen fra laser linjer kan betydeligt henfalde over et par år.
Det andet punkt, præcis cellesegmentering, bliver særlig vigtigt i situationer, hvor intra- eller interspecies variabilitet er et problem. Upræcis cellesegmentering (Figur 1D) resulterer i dyrere datapunkter (figur 1E, angivet med røde trekanter) og større synlige intraspecies variabilitet. Segmenteringsparametrene skal bestemmes omhyggeligt ved at kontrollere cellesegmenteringsnøjagtigheden ved at overlejre segmenteringsresultaterne på det oprindelige CRM-billede, før de går videre til yderligere analyse- eller træningsmodeller for maskinlæring. Hvis du arbejder med et billede af dårlig kvalitet, kan der kræves yderligere billedbehandling for at opnå nøjagtig segmentering. Ved hjælp af enten et 'Gaussian filter' eller 'median filter' kan fjerne kornede artefakter, og bilaterale filter forarbejdning tællere enhver stribet baggrund.
Med optik af dårlig kvalitet (f.eks. et ikke-konfokalt kvalitetsmål) eller utilstrækkelig detektorfølsomhed kan det være en udfordring at håndtere påvisning af svage medfødte fluorescenssignaturer. Bemærk, at ved hjælp af den opsætning, der er beskrevet her og tidligere11, stødte vi ikke på nogen form for celleprøve, hvis medfødte fluorescens var for svag til at rekonstruere en medfødt fluorescenssignatur. Selvom højere emissionsoutput for excitation og længere pixelbebotid kan bruges til at opnå stærkere emissionssignaler, kan dette forårsage skade på celleprøverne. En potentiel løsning i tilfælde, hvor svag medfødt fluorescens er et problem, er at reducere baggrundssignalintensiteten, f.eks. ved at suspendere celler i buffer eller syntetiske medier i stedet for bouillon. Typer af cellebeholdere, såsom glasbundsfade og mikrofluidiske anordninger, er kompatible og egnede til denne teknik, selv om en agaroseplade blev brugt til at holde celler på plads her og i en tidligere undersøgelse15.
Den konfokale mikroskop metode tilbyder rumlig opløsning og in situ analyse for klæbende cellepopulationer, biofilm, og vævsprøver. En potentiel afvejning af denne metode er den maksimale gennemløb sammenlignet med f.eks. Et komplet sæt af confocal scanninger indsamle et par hundrede til tusind medfødte fluorescens signaturer med et enkelt sæt scanninger kan tage op til et par minutter. Et flowcytometer er mindre følsomt på grund af dets optiske design, men kan potentielt opnå en gennemløb flere størrelsesordener større.
At strengt identificere en forbindelse, der er ansvarlig for en bestemt top i en medfødt fluorescerende signatur er typisk udfordrende, på grund af sin komplicerede karakter. Det er imidlertid blevet foreslået, at en række biologisk relevante molekyler, såsom vitaminer (f.eks flavin adenin dinucleotid [FAD]), coenzymer (f.eks. nicotinamid adenin dinucleotid [NADH]), og lipofuscinpigmenter kan være store fluorophorer i cellerne1,16. For eksempel har FAD et excitations maksimum mellem 350-450 nm og en emissionstop på ca. 525 nm16. Gratis NADH har en excitation maksimum og emission peak på 340 nm og 460 nm, henholdsvis, selv om emissionen spektre af protein-bundet NADH adskiller 16,17,18. Lipopigments, der er kendt for at associere med stressede eller alderen celler har et bredt excitationsområde (350-500 nm) og emissionsområde (450-600 nm)16,18.
Brugen af CRM tilbyder en uafhængig informationskilde til at identificere cellekonturer og giver derfor en anden væsentlig fordel ved CRIF: selektiv udvinding af fluorescenssignaler fra individuelle celler fordelt i et 3D-rum. Dette repræsenterer et skridt fremad fra den traditionelle analyse af fluorescensegenskaberne for en hel mikrobiel koloni eller en bulkkulturophæng, som er en gennemsnitlig blanding af signaler fra et stort antal celler forurenet med ikke-cellesignaler fra mellemstore komponenter, udskillede metabolitter og ekstracellulære matrixer. En analyse af encellede medfødte fluorescenssignaturer giver mulighed for prædiktiv karakterisering af intakte cellers fysiologiske status, hvilket giver en potentiel løsning til løsning af tidsmæssig udvikling af en celles fordeling og fysiologiske tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af et tilskud til videnskabelig forskning fra Japans ministerium for uddannelse, kultur, sport og teknologi (18K04843) til Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) til N. Nomura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
