Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع أدلة الموجة وضع الصفر لارتفاع تركيز المجهر جزيء واحد

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

الموصوفة هنا هو أسلوب الطباعة الحجرية nanosphere لتصنيع موازية من أدلة الموجات وضع الصفر، والتي هي صفائف من nanoapertures في غطاء الزجاج المجهري يرتدون المعدن لتصوير جزيء واحد في نانو إلى تركيزات الكائنات الدقيقة من الفلوروفوريس. الأسلوب يستفيد من التجمع الذاتي الكريستال الغروية لإنشاء قالب موجه الموجة.

Abstract

في جزيء واحد الأنزيمات الفلورية جزيء، مضان الخلفية من الركائز المسمى في الحل غالبا ما يحد من تركيز الفلوروفوري لنطاقات بيكو إلى نانومولار، عدة أوامر من حجم أقل من العديد من تركيزات ليجاند الفسيولوجية. تسمح الهياكل النانوية البصرية التي تسمى أدلة الموجات ذات الوضع الصفري (ZMWs)، والتي يبلغ قطرها 100−200 نانومتر والمصطنعة في معدن رقيق موصل مثل الألومنيوم أو الذهب، بتصوير الجزيئات الفردية بتركيزات الكائنات الدقيقة من الفلوروفوريس من خلال حصر الإثارة الضوئية المرئية في الأحجام الفعالة للزيبتلتر. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى معدات تصنيع النانو باهظة الثمن والمتخصصة قد حالت دون الاستخدام الواسع النطاق ل ZMWs. عادة ، يتم الحصول على الهياكل النانوية مثل ZMWs عن طريق الكتابة المباشرة باستخدام الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون ، وهو تسلسلي وبطيئ. هنا، يستخدم الغروانية، أو nanosphere، الطباعة الحجرية كاستراتيجية بديلة لخلق أقنعة على نطاق نانومتر لتصنيع دليل الموجة. ويصف هذا التقرير النهج بالتفصيل، مع مراعاة اعتبارات عملية لكل مرحلة. وتسمح هذه الطريقة بآلاف من الألومنيوم أو الذهب ZMWs أن تكون في موازاة, مع أقطار waveguide النهائي وأعماق 100−200 نانومتر. لا يلزم سوى معدات المختبر الشائعة والمبخر الحراري لترسب المعادن. من خلال جعل ZMWs أكثر سهولة للمجتمع الكيميائي الحيوي ، يمكن لهذه الطريقة تسهيل دراسة العمليات الجزيئية بتركيزات ومعدلات خلوية.

Introduction

تقنيات جزيء واحد مثل جزيء واحد نقل الطاقة الرنين مضان (smFRET) أو جزيء واحد مضان الطيف الارتباط (FCS) هي أدوات قوية للفيزياء الحيوية الجزيئية، مما يسمح لدراسة الحركات الديناميكية، والتطابقات، والتفاعلات من الجزيئات الحيوية الفردية في عمليات مثل النسخ1،2،3،ترجمة 4،5،6،وغيرها الكثير7. بالنسبة ل smFRET، يعد المجهر الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) طريقة شائعة لأنه يمكن اتباع العديد من الجزيئات المربوطة بمرور الوقت، وتقتصر الموجة المبشرة الناتجة عن النقل البري الدولي على منطقة 100−200 نانومتر مجاورة للزلاب8. ومع ذلك ، حتى مع هذا التقييد على حجم الإثارة ، لا تزال الفلوروفوريس ذات الاهتمام بحاجة إلى تخفيفها إلى نطاقات pM أو nM من أجل الكشف عن إشارات جزيء واحد فوق فلوريكنسالخلفية 9. منذ ثوابت Michaelis-Menten من الإنزيمات الخلوية وعادة ما تكون في نطاق μM إلى mM10، والتفاعلات الكيميائية الحيوية في دراسات جزيء واحد وعادة ما تكون أبطأ بكثير من تلك الموجودة في الخلية. على سبيل المثال، يحدث تخليق البروتين بمعدل 15−20 حمض أميني في الثانية في الإشريكية القولونية11،12، في حين أن معظم الريبوسومات prokaryotic في تجارب smFRET تترجم في 0.1−1 حمض أميني في الثانية13. في تخليق البروتين، أظهرت الهياكل البلورية وsmFRET على الريبوسومات المتوقفة أن نقل الحمض النووي الريبي (tRNAs) تتقلب بين الدول "الهجينة" و "الكلاسيكية" قبل نقل TRNA-mRNA الخطوة14،15. ومع ذلك ، عندما كانت التركيزات الفسيولوجية لعامل GTPase النقل ، EF-G ، موجودة ، لوحظ تشكيل مختلف ، وسيط بين الحالات الهجينة والكلاسيكية ، في smFRET6. دراسة العمليات الجزيئية الديناميكية بمعدلات وتركيزات مماثلة لتلك الموجودة في الخلية أمر مهم، ولكن لا يزال تحديا تقنيا.

استراتيجية لزيادة تركيز الركيزة الفلورية هو استخدام فتحات الطول الموجي القائمة على المعدن ، دون مرئية ، ودعا أدلة الموجات وضع الصفر (ZMWs) ، لتوليد حقول الإثارة المحصورة التي تثير بشكل انتقائي الجزيئات الحيوية المترجمة داخل الفتحات16 (الشكل 1). الفتحات عادة ما تكون 100−200 نانومتر في القطر و 100−150 نانومتر في العمق17. فوق الطول الموجي قطع المتعلقة حجم وشكل الآبار (λج ≈ 2.3 أضعاف القطر لموجس الموجات الدائرية مع الماء كما المتوسطةعازلة 18)،لا يسمح وسائط نشر في دليل الموجة، وبالتالي مصطلح دليل الموجة وضع الصفر. ومع ذلك ، فإن المجال الكهرومغناطيسي المتذبذب ، الذي يطلق عليه موجة مبشرة ، يتحلل أضعافا مضاعفة في شدته لا يزال أنفاقا على مسافة قصيرة في الدليل الموجي18،19. على الرغم من تشابهها مع موجات TIR المبشرة ، إلا أن موجات ZMW المبشرة لها ثابت اضمحلال أقصر ، مما يؤدي إلى منطقة إثارة فعالة 10−30 نانومتر داخل موجه الموجة. في تركيزات الكائنات الدقيقة من الليجانات المسماة بالفلورسنت ، يوجد واحد أو عدد قليل من الجزيئات في وقت واحد داخل منطقة الإثارة. هذا التقييد لحجم الإثارة وما يترتب على ذلك من انخفاض في تفلور الخلفية يمكن التصوير الفلوري للجزيئات المفردة بتركيزات ذات صلة بيولوجيا. وقد تم تطبيق هذا على العديد من النظم20, بما في ذلك قياسات FCS لنشر بروتين واحد21, جزيءواحد FRET القياسات من انخفاض تقارب ليغاند البروتين22 والتفاعلات البروتين البروتين23, والقياسات الطيفية الكهروكيميائية للأحداث دوران الجزيئية واحد24.

وقد تم إنتاج ZMWs عن طريق نقش طبقة معدنية مباشرة باستخدام طحن شعاع أيون25،26 أو الطباعة الحجرية شعاع الإلكترون (EBL) تليها البلازما النقش16،27. هذه الأساليب الطباعة الحجرية قناع خلق أدلة موجية في سلسلة وعادة ما تتطلب الوصول إلى مرافق تصنيع النانو المتخصصة، ومنع اعتماد واسع النطاق لتكنولوجيا ZMW. طريقة أخرى، الأشعة فوق البنفسجية nanoimprint الطباعة الحجرية رفعقبالة 28،ويستخدم قالب الشريحة الكوارتز للضغط على قالب ZMW معكوس على فيلم مقاومة مثل ختم. في حين أن هذه الطريقة أكثر تبسيطا ، إلا أنها لا تزال تتطلب EBL لتصنيع قالب الكوارتز. تقدم هذه المقالة البروتوكول لطريقة تصنيع قالب بسيطة وغير مكلفة لا تتطلب طحن EBL أو شعاع أيون وتستند إلى التعبئة الوثيقة للنانكوسفير لتشكيل قناع حجري.

يستخدم النانوسفير أو الطباعة الحجرية "الطبيعية"، التي اقترحها ديكمان ودونسموير29و30لأول مرة في عام 1982، التجميع الذاتي للجسيمات الغروية أحادية التشتت، والتي تتراوح بين عشرات النانومترات وعشرات الميكرومتر31،لإنشاء قوالب للنقش السطحي عبر النقش و/أو ترسب المواد. تتميز الصفائف الدورية الثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) أو ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الجسيمات الغروية ، والتي يشار إليها باسم البلورات الغروية ، ب iridescence مشرق من التشتت والحيود32. على الرغم من أن استخدامها أقل على نطاق واسع من شعاع الإلكترون أو التصوير الضوئي ، فإن منهجية الإخفاء هذه بسيطة ومنخفضة التكلفة ، ويمكن تقليصها بسهولة لإنشاء أحجام ميزات أقل من 100 نانومتر.

توجيه التجميع الذاتي للجسيمات الغروية يحدد نجاح استخدام بلورات الغروية كأقنعة لأنماط السطح. إذا كان حجم وشكل الجسيمات متجانسة ، يمكن بسهولة تجميع الجسيمات الغروية ذاتيا مع التعبئة السداسية ، مدفوعة باستنفاد إنتروبيا33. تبخر الماء بعد انخفاض الطلاء هو طريق فعال لرواسب الجسيمات الغروية، على الرغم من أن أساليب أخرى تشمل تراجع طلاء34،تدور طلاء35،ترسب كهربائي36،وتوطيد في واجهة الهواء والمياه37. ويستند البروتوكول الوارد أدناه إلى طريقة ترسيب التبخر، التي كانت أبسط طريقة للتنفيذ. الفواصل الثلاثية بين حبات البوليسترين معبأة وثيقة شكل فتحات فيها لوحة معدن الأضاحي، وتشكيل وظائف (الشكل 2 والشكل التكميلي 1). ثني مختصر من الخرز قبل هذه الخطوة يضبط شكل وقطر هذه الوظائف. تتم إزالة الخرز ، وتودع طبقة معدنية نهائية حول المشاركات ، ثم تتم إزالة المشاركات. بعد خطوتي الترسب المعدني على قناع النانو الغرواني ، وإزالة الوظائف الوسيطة ، وتعديل كيمياء السطح للتخميل والربط ، تكون صفائف ZMW جاهزة للاستخدام لتصوير جزيء واحد. ويمكن العثور على توصيف أكثر شمولا للخصائص البصرية ZMW بعد تلفيق في المادة38المصاحبة. إلى جانب المبخر الحراري لترسب بخار المعادن ، لا توجد حاجة إلى أدوات متخصصة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يمكن إكمال كافة الخطوات في مساحة معمل عام.

1. تنظيف غطاء الزجاج

  1. لتوفير سطح نظيف للترسب التبخري للجسيمات الغروية، ضع أغطية زجاجية بصرية من البوروسيليكات مقاس 24 × 30 ملم (سمك 0.16−0.19 مم) داخل الإدراجات المخدودة لجرة تلطيخ زجاجية من كوبلين لتنظيفها.
    ملاحظة: تأكد من أن الأغطية تقف بشكل مستقيم ومنفصلة بشكل جيد بحيث يتم عرض جميع الأسطح بوضوح أثناء عملية التنظيف.
  2. صب ما يكفي من الأسيتون في جرة تلطيخ لتغطية الأغطية، ووضع الغطاء على، و sonicate لمدة 10 دقيقة في 40 درجة مئوية.
  3. صب الأسيتون وشطف coverlips عن طريق ملء جرة تلطيخ مع المقطر H2O وصب الماء. كرر 2 مرات أخرى.
  4. كرر صوتنة الأسيتون (الخطوتين 1.2 و 1.3) مرة أخرى.
  5. صب ما يكفي من 200 MM KOH في جرة لتغطية الأغطية و sonicate، مغطاة، لمدة 20 دقيقة في 40 درجة مئوية.
    ملاحظة: كوه يحفر قليلا الزجاج.
  6. شطف الأغطية مع المقطر H2O 6 مرات.
  7. إضافة الإيثانول لتغطية coverlips، إضافة الغطاء، و sonicate لمدة 10 دقيقة في 40 درجة مئوية.
  8. شطف الأغطية مع المقطر H2O 3 مرات.
  9. التقاط كل coverslip على الحافة باستخدام ملقط لطيف وتجفيف coverlips مع الغاز N2. المس حواف غطاء الغطاء فقط. ضع كل من الأغطية المجففة والمنظفة في طبق بيتري نظيف فردي.

2. ترسب التبخر من حبات البوليسترين

  1. لإنشاء قناع بلوري الغروانية لمجموعة ZMW، والطرد المركزي 50 ميكرولتر من قطر 1 ميكرومتر، والخرز البوليسترين غير وظيفية (2.5٪ ث / الخامس في الماء) في 15،000 × ز،25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: قبل pipetting الخرز، يجب أن يكون حل المخزون دوامة لفترة وجيزة في حالة قد استقر الخرز إلى الجزء السفلي من الزجاجة.
  2. تجاهل supernatant، وترك أقل قدر ممكن من الماء المتبقية.
    ملاحظة: يمكن أن تغير المياه المتبقية خصائص التبخر من الايثانول resuspension39، لذلك إزالة كمية صغيرة من الخرز من أجل إزالة كل من الماء هو مقبول.
  3. Resuspend الخرز من الخطوة 2.2 في 50 ميكرولتر من 1:400 TritonX-100:الإيثانول المذيبات. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط الخرز بدقة مع المذيبات.
    ملاحظة: يجب أن تكون مختومة TritonX-100:ethanol المذيبات مع فيلم البارافين بعد الاستخدام وإعداد الطازجة مرة واحدة في الشهر. تميل الخرز إلى الالتزام بجوانب وعاء بلاستيكي ، مثل أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، لذلك ماصة على طول الجانبين لضمان إعادة إنفاق جميع الخرز.
  4. لإعداد غرفة الرطوبة للترسب، ضع 6 أطباق بيتري، كل منها مع غطاء واحد، على مقعد في خط مع أغطية تركت ajar قليلا. في كل طبق، قم بتحريك الغطاء إلى المنطقة المفتوحة بحيث تتعرض الأغطية للبيئة عندما تزداد الرطوبة في الخطوة التالية.
  5. ضع مقياس الرطوبة ومروحة كهربائية صغيرة تركزت خلف أطباق بيتري.
  6. سجل الرطوبة النسبية للبدء (RH) في المختبر. املأ كوب سعة 200 مل مع 150−200 مل من الماء ~ 75 درجة مئوية وضعه خلف المروحة.
  7. قم بتشغيل المروحة وغط أطباق بيتري ومروحتها وأكوابها ومقياس الرطوبة بحاوية تخزين بلاستيكية منقلبة وشفافة (66 سم × 46 سم × 38 سم).
  8. دع RH في الغرفة ترتفع إلى 70-75٪، والتي عادة ما تستغرق 5-10 دقائق.
    ملاحظة: إذا كان المختبر المحيط RH منخفضا (أقل من ~ 50٪)، فدع الغرفة تصل إلى درجة حرارة أعلى، ولكن لا تزيد عن 80٪، للتعويض عن فقدان الرطوبة أثناء الترسب (انظر أدناه).
  9. عندما تصل درجة حرارة الري إلى 70-75٪، سجل RH ورفع حاوية التخزين البلاستيكية قليلا لوضع الأغطية بسرعة على أطباق بيتري، مما يمنع الإفراط في التبول من الأغطية.
    ملاحظة: درجة الحرارة في الغرفة ستكون أكثر دفئا قليلا من درجة حرارة الغرفة، وعادة ما تكون 25-26 درجة مئوية، نتيجة للترطيب. إذا كانت الرطوبة مرئية على الأغطية ، فإن الأسطح الزجاجية رطبة للغاية. صندوق قفازات تجاري قد يبسط هذا الجزء من البروتوكول.
  10. دع RH في الغرفة تستمر في الارتفاع إلى 85٪. عند هذه النقطة، سجل RH في غرفة الرطوبة وماصة 5 ميكرولتر من تعليق حبة على وسط كل coverslip.
  11. أغلقي الغرفة وأطباق بيتري بعد كل ترسب لتقليل فقدان الرطوبة. تهدف إلى الانتهاء من جميع الترسبات 6 في غضون 2 دقيقة.
  12. سجل RH في الغرفة بعد الشهادة.
    ملاحظة: سوف RH بعد ترسب تساعد على قياس مدى سرعة الرطوبة فقدت أثناء ترسب، والذي يعتمد على ظروف المختبر المحيط. بالنسبة للركض الناجح النموذجي، ستبدأ الغرفة بنسبة 85٪ من RH قبل الإدلاء بالشهادة وتنتهي عند 70-75٪ RH بعد الشهادة.
  13. دع قطرات الخرز تنتشر وتجف لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: إذا كانت بلورات الغروية لديها العديد من الثقوب أو مناطق متعددة الطبقات، ثم الغرفة كان من المرجح رطبة جدا أو جافة، على التوالي. ضبط الرطوبة النسبية التي لإغلاق أطباق بيتري والبدء في الترسبات (انظر قسم النتائج لمزيد من المناقشة للتحسين).

3. حبة التلوي للحد من حجم المسام في قالب الكريستال الغرواني

  1. لتوفير سطح درجة حرارة موحدة لتلص الخرز البوليسترين، الذي يضيق interstices بين حبة وجولات زوايا interstices، وضع شقة، لوحة الألومنيوم المطحون على رأس لوحة السيراميك الساخنة القياسية.
  2. تعيين درجة حرارة لوحة ساخنة إلى 107 درجة مئوية، ودرجة حرارة الانتقال الزجاج من البوليسترين40.
    ملاحظة: للحصول على درجة حرارة مستقرة ودقيقة، تم إجراء مسبار حراري في حفرة عمقها 2-3 مم وعمق 4-5 ملم في صفيحة الألومنيوم.
  3. ضع غطاء يحتوي على قالب الخرز على لوحة الألومنيوم الساخنة وعلوى لمدة 20 s (انظر قسم المناقشة لشرح وقت الذوبان).
  4. بعد التدفئة، وإزالة غطاء من لوحة الألومنيوم ووضعه على الفور على سطح الألومنيوم درجة حرارة غرفة أخرى لتبريده.
    ملاحظة: من المفيد إما أن يكون الأغطية معلقة قليلا على حافة اللوحة أو طاحونة القنوات الضحلة (انظر الفيديو المصاحب) في لوحة لتسهيل التقاط الأغطية.

4. Nanofabrication من الألومنيوم صفر وضع waveguides باستخدام قالب الكريستال الغروية

  1. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 300 نانومتر من النحاس في 2 Å/s على قالب الكريستال الغرواني لتوليد وظائف في interstices بين الخرز.
  2. إزالة المعادن الزائدة على رأس الخرز عن طريق الضغط بلطف على السطح مع الشريط. قشر الشريط ببطء لسحب قبالة المعدن.
    ملاحظة: قد تبقى بعض بقع صغيرة من المعدن الزائد العاكس بعد سحب الشريط، ويمكن إزالتها في كثير من الأحيان عن طريق تيار من الغاز N2. إذا بقيت بقع كبيرة من المعدن العاكس الزائد بعد سحب الشريط ، فحاول نقع القوالب في التولوين لمدة 2 ساعة لإذابة حبات البوليسترين جزئيا. غسل الأغطية بالماء المقطر، الجافة مع N2،وتكرار سحب الشريط. يجب أن لا تذوب نقع إضافية تماما الخرز، كما الخرز تساعد على حماية الوظائف من التلف أثناء سحب الشريط.
  3. لإذابة حبات البوليسترين، ضع قوالب الخرز في التولوين وانقعها بين عشية وضحاها.
    تحذير: قد تكون أبخرة الولوين سامة. العمل مع toluene تحت غطاء محرك السيارة جيدة التهوية وارتداء معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، ونظارات السلامة، ومعطف المختبر. يجب تخزين التولوين في خزانات التهوية المخصصة للسوائل القابلة للاشتعال.
  4. بعد حضانة التولوين، شطف القوالب مرة واحدة مع الكلوروفورم ومرتين مع الإيثانول. مقبض يغطي بعناية في هذه المرحلة لأن الحساسة 200-300 نانومتر وظائف معدنية طويل القامة تتعرض الآن. جفف القوالب باستخدام N2 وأزل البوليمر المتبقي والملوثات في منظف بلازما الأكسجين لمدة 30 دقيقة.
    تنبيه: قد تكون أبخرة الكلوروفورم سامة. العمل مع الكلوروفورم تحت غطاء محرك السيارة جيدة التهوية وارتداء معدات الحماية الشخصية، بما في ذلك القفازات، ونظارات السلامة، ومعطف المختبر. يجب تخزين الكلوروفورم في خزانات التهوية بعيدا عن المذيبات القابلة للاشتعال الأخرى.
  5. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 3 نانومتر من طبقة التصاق التيتانيوم في 1 Å/s تليها 100-150 نانومتر من الألومنيوم في 4 Å/s حول وعلى رأس وظائف النحاس.
    ملاحظة: يمكن للمرء استخدام الكسوة سمكا للحصول على أدلة أعمق وتحسين التوهين من مضان الخلفية، ولكن هذا يقلل أيضا من العائد بعد فضح وحل الوظائف في الخطوة التالية (انظر قسم المناقشة).
  6. لإذابة الوظائف المعدنية، نقع الأغطية في النحاس الخلاف (حمض الستريك القائم على؛ جدول المواد) لمدة 2 ساعة.
    تنبيه: يمكن أن يسبب اللافانت المعدني حروقا جلدية. العمل مع المحترفين تحت غطاء محرك السيارة جيدة التهوية وارتداء معدات الحماية. غسل اليدين جيدا بعد التعامل معها. وينبغي تخزين المعادن النقوش في خزانات التهوية المخصصة للسوائل المسببة للتآكل.
  7. شطف coverlips مع الماء المقطر، الجافة مع N2،وبرتقالي بلطف سطح الكسوة المعدنية مع ورقة العدسة لفضح أي الوظائف التي لا تزال مغطاة في الكسوة. وضع coverlips مرة أخرى في النحاس النقوش لمدة 2 ساعة أخرى، ثم شطف مرة أخرى مع الماء المقطر والجافة مع N2.
    ملاحظة: يجب تخزين شرائح ZMW في أطباق بيتري مغطاة ونظيفة لإبقائها خالية من الملوثات.

5. Nanofabrication الذهب صفر وضع waveguides باستخدام قالب الكريستال الغروانية

ملاحظة: يتم توفير طريقة لتصنيع الذهب ZMWs (الشكل التكميلي 1)، الذي يعكس بروتوكول لتصنيع الألومنيوم ZMWs، في هذا القسم.

  1. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 3 نانومتر من طبقة التصاق التيتانيوم في 1 Å/s تليها 300 نانومتر من الألومنيوم في 4 Å/s.
  2. إزالة المعادن الزائدة على رأس الخرز عن طريق الضغط بلطف على السطح مع الشريط. قشر الشريط ببطء لسحب قبالة المعدن.
  3. لإذابة حبات البوليسترين، ضع قوالب الخرز في التولوين وانقعها بين عشية وضحاها.
  4. بعد حضانة التولوين، شطف القوالب مرة واحدة مع الكلوروفورم ومرتين مع الإيثانول. جفف القوالب باستخدام N 2 وأزلملوثات البوليمر المتبقية في منظف بلازما الأكسجين لمدة 30 دقيقة.
  5. باستخدام ترسب التبخر الحراري أو الإلكترون شعاع، إيداع 100−150 نانومتر من الذهب في 5 Å/s حول وعلى رأس وظائف الألومنيوم.
  6. لإذابة الوظائف المعدنية، نقع الأغطية في النقوش الألومنيوم (حمض الفوسفوريك القائم على؛ جدول المواد) لمدة ساعة واحدة
  7. شطف coverlips مع الماء المقطر، الجافة مع N2،وبرتقالي بلطف سطح الكسوة المعدنية مع ورقة العدسة لفضح أي الوظائف التي لا تزال مغطاة في الكسوة. وضع coverlips مرة أخرى في الألومنيوم النقوش لمدة 1 ساعة، ثم شطف مرة أخرى مع الماء المقطر والجافة مع N2.
    ملاحظة: يجب تخزين شرائح ZMW في أطباق بيتري مغطاة ونظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن للتجميع الذاتي للجسيمات الغروية البوليسترين عن طريق الترسيب التبخري (الخطوات 2.1-2.13) أن ينتج مجموعة من النتائج لأنه يتطلب التحكم في معدل تبخر المذيبات. ومع ذلك، لأن الترسبات سريعة (10-15 دقيقة في الجولة الواحدة)، يمكن تحسين الإجراء بسرعة لظروف المختبر المحيط المختلفة. الشكل 3أ يظهر قالب الغروية شكلت بشكل جيد بعد ترسب والتبخر. بشكل كلي، منطقة الخرز دائرية، مع حدود محددة من قبل حلقة مبهمة متعددة الطبقات من الخرز. المناطق الشفافة ، ولكن ليس الأبيض في الصورة هي المناطق أحادية الطبقة المطلوبة. يظهر الشكل 3B قالب الغروية التي كانت معبأة في بيئة رطبة للغاية (80٪ RH عندما تم إغلاق أطباق بيتري). هذه القوالب تميل إلى أن لا يكون لها حدود دائرية نظيفة ولها أوتار متعددة الطبقات تمتد إلى الخارج. الترسب مقبول ويمكن استخدامه في المراحل اللاحقة ، ولكن الثقوب في الشبكة تقلل من عدد مناطق صفيف ZMW القابلة للاستخدام لتصوير جزيء واحد. الشكل 3C يظهر قالب الغروية التي كانت معبأة في بيئة جافة بشكل مفرط (65٪ RH عندما تم إغلاق أطباق بيتري). عادة ما تكون هذه القوالب أصغر في القطر مقارنة بالنماذج المثالية المنتشرة بشكل جيد. يمكن استخدام الترسب ، ولكن المناطق البيضاء متعددة الطبقات ، والتي تتناثر إلى الداخل ، تقلل من المساحة القابلة للاستخدام للتصوير. وبالتالي، لا نوصي بإجراء أكثر من 6 إفادات في وقت واحد لأن الإفادات قرب نهاية العملية ستحدث في رطوبة أقل عند فتح الغرفة وإغلاقها. يظهر الشكل 3D نمط قوس قزح الناتج عن الحيود للضوء المنعكس من بلورة البوليسترين. ويمكن استخدام هذا النمط لتأكيد نجاح وجودة التعبئة الكريستال بالعين. الشكل 3E,F يظهر صورة مجهرية للقوة الذرية (AFM) لقوالب الغروانية معبأة بشكل جيد. تنشأ العيوب بين الحبوب من التشويش أثناء الترسيب التبخري41، ويمكن رؤية الحبوب المتميزة بهدف 10x. وهكذا، يمكن أيضا أن تستخدم فحص الترسبات الغروانية مع المجهر ضوء الطاقة المنخفضة لتقييم التعبئة.

بعد ترسب النحاس على قوالب الغروية الصلبة (الخطوة 4.1) ، يجب أن يكون نمط حيود قوس قزح مرئيا ومعززا بطلاء معدني عاكس قمم الخرز(الشكل 4A ، B). تفقد القوالب نمط حيود قوس قزح العاكس بعد سحب الشريط السكوتش (الخطوة 4.2) الذي يزيل النحاس الزائد(الشكل 4C). الشكل 4D,E يظهر صور AFM لحقل نموذجي من الوظائف النحاسية بعد ترسب المعادن. العيوب بين الحبوب البلورية الغروية في الشكل 3E مرئية في صور آخر النحاس ومناطق أكبر من النحاس. تحليل الصور AFM يظهر أنه، لسمك ترسب النحاس من 300 نانومتر، وظائف النحاس في نهاية المطاف متوسط 255 نانومتر (الشكل 4F) في الارتفاع و 121 نانومتر في القطر (الشكل 4G).

ترسب الكسوة الألومنيوم (الخطوة 4.5) حيث كانت الخرز وعلى رأس وظائف النحاس، وحل اللاحقة من الوظائف (الخطوتين 4.6 و 4.7) يؤدي إلى ZMWs الألومنيوم هو مبين في الشكل 5A−C. العيوب بين الحبوب البلورية الغروية مرئية كفتحات أكبر(الشكل 5B). متوسط المسافة بين مراكز ZMW في الشكل 5C هو 559 نانومتر، بما يتفق مع التباعد الذي حددته هندسة التعبئة السداسية القريبة من حبات 1 ميكرومتر Equation 1 (باستخدام قوالب البوليسترين التي تم ثنيها لنتائج 20 s في أدلة الموجات التي يبلغ قطرها في المتوسط 118 نانومتر (الشكل 5D ،E) ، بما يتفق مع أقطار المنشور وصغير بما يكفي لقطع انتشار الضوء المرئي. يظهر ملف تعريف ارتفاع موجه موجة من الشكل 5D أيضا أنه ~ 120 نانومتر عميق.

تم تنفيذ جزيء واحد FRET في ZMWs لاختبار وظائف (الشكل 6A). يظهر حقل نموذجي من ZMWs للتصوير في الشكل 6B، والذي يحتوي على أدلة موجية >3000 في مجال رؤية 40 × 80 ميكرومتر. تم تمرير ZMWs لأول مرة باستخدام بروتوكولات موضحة سابقا42،43. لفترة وجيزة ، تم تمرير ZMWs الألومنيوم مع بولي (حمض الفينيل فوسفونيك) لمعطف الكسوة الألومنيوم تليها methoxy إنهاء البولي ايثيلين غليكول (PEG) مخدر مع PEG البيوتين إنهاء لمعطف قيعان الزجاج من ZMWs. الذهب ZMWs يمكن passivated مع PEG المشتقة من ثيول لمعطف الكسوة الذهبية تليها معاملة PEG مماثلة للقيعان الزجاجية. ثم تم بناء غرف التدفق ، حجم ~ 20 ميكرولتر ، لتصوير جزيء واحد44. تم إجراء تصوير جزيء واحد FRET من دوبلس الحمض النووي كما هو موضح سابقا38. باختصار، تم احتضان 100 pM−1 nM من السيانين-3/سيانين-5 (Cy3/Cy5)، دوبلس الحمض النووي البيوتينية (33 طول الزوج الأساسي) لمدة 10 دقائق في قنوات التدفق الوظيفية مع streptavidin (5 حضانة دقيقة، 0.5 ملغم / مل الحل). تركيز الجزيئات الكبيرة المسمى يمكن أن يكون titrated لتحقيق ~ 20٪ تحميل أدلة الموجات مع جزيء واحد، مما يؤدي إلى <5٪ أدلة الموجات محملة أكثر من جزيء واحد، استنادا إلى بواسون تحميل الموزعة (معظم أدلة الموجات، ~ 75٪، لن يكون لها جزيئات)45. تم غسل الحمض النووي غير المنضم مع المخزن المؤقت المزدوج الخالي من النيوكليز يليه عازل الإضاءة (0.3٪ [ث / v] الجلوكوز، 300 ميكروغرام/مل من الجلوكوز أوكسيداز، 120 ميكروغرام/مل كاتالاز، و1.5 مليون ترولوكس [6-هيدروكسي-2،5،7،8-tetramethyl-chromane-2-carboxylic حمض]). كانت دوبلس الحمض النووي غير البيوتينية المسمى Cy5 (طول زوج الأساس 33) موجودة في حاجز الإضاءة عند 0 و50 و100 و500 nM كفلوروفورات خلفية في الحل. تم تسجيل آثار جزيء واحد FRET من جزيئات الحمض النووي المزدوج Cy3/Cy5 المشلولة بمجهر TIRF مصمم خصيصا تم تعديله وفقا لظروف الإضاءة الفلورية. تم تسجيل الأفلام مع فتحة رقمية 1.48 (NA) 100x هدف الغمر النفط مع بالتناوب 532 نانومتر و 640 نانومتر الإثارة (100 مللي ثانية التعرض) ومقسم الطيفية عرض مزدوج لتسجيل انبعاث Cy3 و Cy5 في وقت واحد على جهاز الشحنة التي تتكاثر بالإلكترون مقرونة (EMCCD) الكاميرا. كانت آثار جزيء FRET المفرد مع مبيضات خطوة واحدة في قناة Cy5 قابلة للكشف في جميع تركيزات Cy5 المحيطة التي تم اختبارها(الشكل 6C−F). وبالمقارنة، فإن جزيئات واحدة يمكن الكشف عنها فقط في الإضاءة TIRF مع pM إلى تركيزات منخفضة محلول nM الفلوروفور46.

Figure 1
الشكل 1: تخطيطي لموجدي الموجات في الوضع الصفري. مخطط صفيف ZMW مع مخطط مقطعي موسع ل ZMW واحد على اليمين. يمكن تصوير إنزيمات واحدة ذات علامات فلورية ذات أهمية (ريبوسوم بني مع دائرة حمراء لتمثيل صبغة فلورية) معطلة كيميائيا (عبر الحمض النووي الريبي في هذا المثال) إلى القاع الزجاجي ل ZMWs (التي تعمل عادة مع PEG البيوتينية) مع إعداد مجهري نموذجي قائم على الليزر. ينعكس ضوء الإثارة 532 نانومتر (الأسهم الخضراء) عند الحدود الزجاجية المعدنية بسبب صغر حجم الفتحة (قطر 100−200 نانومتر)، ولكن توجد موجة مبشرة غير نشر تتحلل أضعافا مضاعفة في شدتها داخل ZMW. وينتج عن ذلك عمق إضاءة فعال 10−30 نانومتر (تظليل أخضر في الفتحة). يتم إضافة ليغاندس الفلورية الفردية (TRNAs الأزرق مع الدوائر الخضراء كعلامات الفلورسنت) في تركيزات nM إلى μM. يتم تصوير الليغند الفردي الذي ينتشر في الفتحة ويتفاعل مع الإنزيم دون مضان الخلفية المانعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التخطيطي لطريقة التمبلر الغروية التي تم تطويرها لتصنيع صفائف ZMW الألومنيوم. يتم إيداع حبات البوليسترين، قطرها 1 ميكرومتر، وتجميعها ذاتيا على غطاء زجاجي نظيف، كما هو موضح في القسم 2 من البروتوكول. ثم يتم ثني الخرز لتقليل أحجام المسام (القسم 3) ، يليه ترسب النحاس وانحلال الخرز في التولوين. يتم إيداع الألومنيوم حول وعلى رأس وظائف النحاس، والتي هي بعد ذلك محفورة بشكل انتقائي بعيدا لتترك وراءها مجموعة سداسية من nanoapertures (القسم 4). بالنسبة للخطوات الثلاث الأخيرة ، يتم توفير طرق عرضية إلى يمين طرق عرض الخطة لإظهار عرض ومرتفعات المشاركات النحاسية وZMWs الألومنيوم.

Figure 3
الشكل 3: النتائج التمثيلية من ترسب التبخر من الغروانيات. (أ) مثال على ترسب الغروانية الأمثل. (ب) مثال على ترسب الغروانية المقبولة التي كانت الظروف أكثر رطوبة (80٪ RH) من المثالي. الثقوب في طبقة الكريستال الأحادية واضحة. (ج) مثال على ترسب الغروانية المقبولة التي كانت الظروف أكثر جفافا (65٪ RH) من الأمثل. المناطق أحادية الطبقات شفافة قليلا في حين أن المناطق متعددة الطبقات بيضاء ومبهمة (محيط وشرائط إلى الداخل). (د) بلورة الغروانية مضيئة مع الضوء الأبيض لتسليط الضوء على حيود قوس قزح من البلورات. (ه) صورة AFM (التنصت على مسبار AFM في الهواء) لفئة أحادية من حبات البوليسترين المعبأة سداسيا من ترسب غروي ناجح (شريط مقياس = 10 ميكرومتر). (F) صورة AFM الموسعة للخرزات المعبأة (شريط المقياس = 2 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور مجهرية ومجهرية لقوالب ZMW بعد ترسب النحاس. (أ) صورة الشرائح بعد التبخر المادي للنحاس على رأس قوالب الخرز. (ب) قوس قزح نمط الحيود من قوالب حبة بعد ترسب النحاس. (C) صورة لقالب (يمين) بعد سحب الشريط لإزالة النحاس الزائد والشريط (يسار). (D) صورة AFM من وظائف النحاس بعد سحب الشريط وحل كامل من حبات البوليسترين (شريط مقياس = 5 ميكرومتر). (ه) صورة AFM التكبير أعلى من لوحة D (شريط مقياس = 2 ميكرومتر). (F) الرسم البياني للارتفاعات النحاسية (المعرفة كمقياس أقصى للارتفاع داخل كل مشاركة)، n = 534. (G) الرسم البياني للأقطار النحاسية فيريت آخر، ن = 201. قطر Feret هو المسافة القصوى بين خطين متوازيين معان إلى حدود المنشور (تم قياسها كميا في ImageJ47). ولتحديد الجسيمات للتحليل، استخدمت عتبة في منتصف الطريق بين الجزء العلوي من الكسوة والسطح الزجاجي السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور مجهرية ومجهرية من الألومنيوم ZMWs. (أ) صورة من الشرائح بعد ترسب التبخر المادي من 150 نانومتر من الألومنيوم حول وعلى رأس وظائف النحاس. (ب) صورة AFM من الألومنيوم ZMWs بعد حل (شريط مقياس = 5 ميكرومتر). (ج) صورة تكبير أعلى من لوحة B (شريط مقياس = 0.2 ميكرومتر). (د) صورة عمق نموذجية لفرد ZMW من لوحة C. الشخصية مأخوذة من الخط الأخضر المرسوم في لوحة C. (E) الرسم البياني من أقطار ZMW Feret، ن = 240. تم قياس أقطار Feret كما في الشكل 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تصوير جزيء FRET واحد في ZMWs. (أ) التخطيطي (وليس لتوسيع نطاق) من جزيء واحد FRET التصوير من Cy3، Cy5 المسمى الحمض النووي دوبلس في ZMWs مع Cy5 المسمى دوبلس في الخلفية. (ب) حقل مثال على ZMWs تحت إضاءة الضوء الأبيض (شريط المقياس = 10 ميكرومتر). (C−F) تسجيلات جزيء FRET واحد من دوبلس الحمض النووي شلت في ZMWs في وجود 0 (C)، 50 (D)، 100 (E)، و 500 nM (F) Cy5 المسمى دوبلس في الحل. لكل تركيز، لوحة أعلى يظهر Cy3 (الأخضر) وCy5 (الأحمر) كثافة الفلورسينس تحت إضاءة الليزر 532 نانومتر (FRET التصوير)، لوحة الأوسط يظهر كثافة Cy5 مضان تحت إضاءة الليزر 640 نانومتر (الإثارة المقبول المباشر)، وأدنى لوحة يظهر كفاءة FRET ( Equation 2 ) محسوبة من الخام Cy3 (ID) و Cy5 (IA) كثافة الفلورسينس. أثناء التصوير، تناوب الطول الموجي للإثارة بين 532 و 640 نانومتر كل 100 مللي ثانية.

الشكل التكميلي 1: التخطيطي لطريقة التمبلر الغروية التي تم تطويرها لتصنيع صفيف ZMW الذهب. بروتوكول لتصنيع الذهب ZMW صفيف مماثل لبروتوكول لتصنيع الألومنيوم ZMW صفيف (الشكل 2). بدلا من إيداع النحاس على رأس حبات البوليسترين ، يتم إيداع الألومنيوم. بعد حل الخرز في التولوين ، يتم إيداع الذهب بدلا من الألومنيوم على رأس المشاركات. ثم يتم حفر وظائف الألومنيوم بشكل انتقائي لترك وراءها مجموعة ZMW الذهب. للخطوات الثلاث الأخيرة ، يتم توفير طرق عرضية إلى يمين طرق عرض الخطة لإظهار عرض ومرتفعات مشاركات الألومنيوم والذهب ZMWs. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: نمذجة العناصر المحدودة لنشر المجال الكهرومغناطيسي في ZMWs. (A−D) المقاطع العرضية لحجم ناقل Poynting متوسط الوقت (W /m2)من خلال موجه موجي مصنوع من قالب غير معان (A،C) وقالب معلب (B, D). تم حساب موجات المستوي الكهرومغناطيسي المستقطبة خطيا (1 W موزعة على مساحة الشريحة) عند الأطوال الموجية المدرجة في الشكل (400 نانومتر أو 1000 نانومتر) على السطح السفلي ، وتم حساب الوضع الأدنى (الأساسي) ، الذي يحتوي على أدنى عدد من الموجات ، باستخدام برنامج النمذجة(جدول المواد)مع طريقة العنصر المحدود لحل معادلات ماكسويل وظروف الحدود المناسبة. ويفترض أن حدود أدلة الموجات هي موصلات كهربائية مثالية، والتي تقاربها الجدران الألومنيوم أو الذهب بشكل جيد. تم تحديد المقطع العرضي من قالب موجه الموجات غير المجسم من خلال التعبئة السداسية لدوائر قطرها 1 ميكرومتر ، وتم قص النصائح الثلاثة من الشكل الثلاثي الناتج إلى عرض ~ 60 نانومتر لنمذجة فتحة مادية واقعية. تم تقريب المقطع العرضي من القوالب الصلبة كدائرة قطرها 130 نانومتر. وكان كل من أدلة الموجات عمق 130 نانومتر، على غرار عمق الكسوة بعد تلفيق. (E, F) بالإضافة إلى أطوال موجية مثيرة من 400 نانومتر و 1000 نانومتر ، تم حل النماذج في 100 أطوال موجية مثيرة متباعدة بالتساوي بين 400 نانومتر و 1000 نانومتر ، ومؤشر الوضع الفعال (يعرف على أنه Equation 3 ، حيث kz هو عدد الموجات في دليل الموجة ، والذي ينخفض بسبب التقييد في المستوى العرضي ، و k هو عدد الموجات الخفيفة في الفراغ) تم رسمه ضد الطول الموجي للموجة الثلاثية (E) والتعميمية (F). بالنسبة للأطوال الموجية الأقصر ، تكون الأوضاع الأعلى متحمسة ، ويزيد مؤشر الوضع الفعال (مؤشر الوضع الفعال الأقصى هو 1 ، وهي الحالة المقيدة التي تنتقل فيها موجة الطائرة الكهرومغناطيسية غير مقيدة في البعد العرضي). وقدرت الأطوال الموجية الفعالة لقطع أدلة الموجات بأنها الطول الموجي الذي ينخفض فيه مؤشر الوضع الفعال إلى 0. لاحظ أن قطع الدليل الدائري= 221 نانومتر من نمذجة العناصر المحدودة (F) يتسق مع التنبؤ النظري للطول الموجي لقطع دليل الموجة الدائري (λcutoff, تحليلي = 1.7d = 221 nm, حيث d هو قطر دليل الموجة). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: النتائج التمثيلية من تصنيع Au ZMW. (أ) صورة مجهرية للصفائف الذهبية ZMW. (B−D) صور AFM لمشاركات الألومنيوم من قالب حبة لم يكن معلبا (B)، وهو قالب تم ثنيه عند 107 درجة مئوية لمدة 20 s (C)، وقالب تم ثنيه عند 107 درجة مئوية لمدة 25 s (D). (ه) صورة AFM من الذهب ZMWs بعد حل وظائف الألومنيوم. (F) أعلى صورة AFM التكبير من لوحة E. (G) ملف تعريف عمق نموذجي من الذهب ZMW. لمحة مأخوذة من الخط الأخضر المرسوم في لوحة F (شريط المقياس = 1 ميكرومتر في Bو Cو Dو F؛ 5 ميكرومتر في E). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بالنسبة للتجميع الذاتي الغرواني (القسم 2 من البروتوكول)، فإن استخدام الإيثانول بدلا من الماء كمذيب معلق يسرع عملية التبخر بحيث تكون القوالب جاهزة في 2-3 دقائق بعد الترسب بدلا من 1−2 ساعة كما هو الحال في الطرق السابقة48،49. بروتوكول الترسيب التبخري المعروض هنا هو أيضا أبسط من بروتوكولات الترسيب السابقة التي تتطلب التحكم في إمالة السطح ودرجة الحرارة وحجم الهواء فوق التعليق49و50و51. يبلغ كسر حجم الجسيمات المستخدم في هذا البروتوكول 2.4٪، وهو أعلى من 0.2−0.5٪ المستخدمة في طرق الترسيب السابقة48، والتي تقوم بإعادة تثبيت الغروانيات في مخاليط الجلسرين المائي لفترة أطول بكثير لتسوية المقاييس الزمنية. ومع ذلك، فإن جودة الترسبات قوية للتغيرات في جزء حجم الجسيمات، حيث وجدت الدراسات السابقة أنه يمكن أن تتراوح بين 2-10٪49و50و51. أحجام الحبوب من بلورات الغروية التي تم الحصول عليها في ترسب ناجح من هذا البروتوكول هي 20−30 ميكرومتر عبر, أكبر من الحبوب من أساليب الترسيب السابقة (عادة عدة مئات نانومتر عبر)48,49. بشكل كلي، ما يقرب من 2 سم في المناطق القطر من أحادي الطبقة الغروانية هي أيضا مماثلة للمناطق 1 سم التي تنتجها الأساليب السابقة49. يسمح الحجم الكبير لقوالب الكريستال الغروية المنتجة في هذه الطريقة أيضا بإجراء غرف تدفق منفصلة 3−544، كل منها بعرض 3-4 مم تقريبا ، على كل شريحة ZMW. وهكذا، يمكن إجراء تجارب جزيء واحد مستقلة متعددة على كل شريحة.

تعد إعادة تصميم قوالب الخرز الغرواني (قسم البروتوكول 3) بعد التجميع الذاتي خطوة بسيطة ولكنها حاسمة للحد بشكل كاف من تفلور الخلفية مع ZMWs. كما يظهر الشكل التكميلي 2، الطول الموجي قطع فعالة لموجة مع المقطع العرضي الثلاثي من قالب غير مرتبط هو 894 نانومتر. وبالمقارنة، فإن الطول الموجي الفعال لقطع 130 نانومتر دليل موجي دائري قطره من قالب معلب هو 221 نانومتر، كما هو محدد تحليليا (1.7 أضعاف قطر الدليل18)والعدد. استخدام الخرز أصغر للترسب يمكن أيضا تقليل حجم المسام قالب، ولكن سيتم بعد ذلك متباعدة أدلة الموجات أقرب من 200 نانومتر، الذي هو حول حد الحيود من الضوء المرئي. وعلاوة على ذلك، ستظل أدلة الموجات مثلثة في المقطع العرضي، مما يؤدي إلى انتشار الطاقة غير القياسي من خلال دليل الموجة(الشكل التكميلي 2A−D). عيب واحد من خطوة التلين هو أن التباين في وقت الذوبان يمكن أن يؤدي إلى تقلبات في قطر موجه الموجات ، لذلك يساعد التوقيت الدقيق على تقليل التباين بين الدفعات. تبدأ الفواصل في الإغلاق في أوقات التلين التي تزيد عن 25 ثانية، ولا تنخفض أقطار ما بعد التربيع كثيرا بين 20−25 ثانية(الشكل التكميلي 3B−D). اختبار سريع لإغلاق بين الأقواس هو التحقق مما إذا كانت القوالب المصلقة لا تزال تنتج نمط حيود قوس قزح عندما تضيء مع الضوء وينظر إليها في زاوية. وإذا لم يكن الأمر كذلك، فمن المرجح أن تكون غالبية الفواصل قد أغلقت أبوابها. وقد قدمت العلاقة بين الوقت الصلب وأقطار المسام نموذجية في وقت سابق38.

بعد تحقيق حجم المسام المطلوب أثناء خطوة التلأليد ، يتم إيداع النحاس (الخطوة 4.1) على القوالب لإنشاء ظل القناع. من المهم استخدام خط ترسب البصر ، مع اقتراب المعدن من القالب عموديا قدر الإمكان. وبالتالي ، فإن زيادة المسافة بين العينة ومصدر المعدن وكذلك ضمان لوحة عقد القوالب ليست الغزل ، كما هو الحال تلقائيا في بعض آلات ترسب البخار ، وسوف تساعد في تقليل ترسب الجانبية من المعدن على الركيزة البوليسترين. ومع ذلك، بعض ترسب الجانبي أمر لا مفر منه، مما يقلل من حجم ثقب الخلالي، وبالتالي فإن ما بعد المقطع العرضي كما يتم إيداع المزيد من المعدن52. وهذا يؤدي إلى وظائف معدنية هرمية بدلا من هياكل تشبه المنشور52.

لأن وظائف النحاس هي على الأرجح هرمية بدلا من المنشور على شكل، ترسب الألومنيوم (الخطوة 4.5) على رأس الوظائف يغطي أيضا بعض الجوانب المنحدرة، ومنع الوصول إلى الخلاف النحاس لبعض الوظائف. وهكذا، تمت إضافة خطوة تلميع الورق العدسة (الخطوة 4.7 أو 5.7) بعد نقع الأولى في النقوش لتعطيل ميكانيكيا أي وظائف النحاس لا تزال مغطاة في الألومنيوم. إيداع المزيد من النحاس لإنشاء وظائف أطول أيضا يجعل الوظائف أكثر عرضة للاضطراب الميكانيكية خلال تلميع الورق العدسة. ومع ذلك، لا ينبغي إيداع أكثر من 500 نانومتر من النحاس لأن الهدف من الترسب هو إسقاط الثقب الخلالي في خط الوسط 500 نانومتر من الخرز 1 ميكرومتر.

وثمة صعوبة محتملة أخرى هي إزالة غير مقصودة من الألومنيوم الكسوة أثناء تلميع الورق عدسة (الخطوة 4.7 أو 5.7). ووجد أن فقدان الكسوة الألومنيوم أثناء التلميع أصبحت أكثر تواترا بعد إضافة خطوة التلين، على الأرجح بسبب زيادة بقايا البوليسترين، والتي يمكن أن تتداخل مع الالتزام الألومنيوم إلى الزجاج (القسم البروتوكول 3). ومع ذلك، نقع التولوين بين عشية وضحاها (الخطوة 4.3 أو 5.3) بعد سحب الشريط حل هذه المشكلة. في صورة AFM في الشكل 4E، يمكن رؤية بعض الحلقات المتبقية من البوليسترين بين المشاركات ، ولكن الكسوة الألومنيوم لا تزال تقاوم هواة متعددة في الخطوة 4.7. إذا كان فقدان الكسوة الألومنيوم لا يزال مشكلة بعد نقع التولوين بين عشية وضحاها، يمكن إضافة غسل RCA-1 (معيار نظيف-1)، وغسل البيرانا، أو مزيد من تنظيف بلازما الأكسجين إلى الخطوة 4.4 أو 5.4. ويمكن أيضا أن تضاف هذه الخطوات غسل بعد الخطوة الحفر النهائي (الخطوة 4.7 أو 5.7) وقبل passivation من أجل مزيد من تنظيف ZMWs.

كان أداء ZMWs في تجارب FRET جزيء واحد مماثلة لتلك التي من ZMWs ملفقة مع EBL. في دراسة سابقة53 أداء جزيء واحد FRET على Cy3 المسمى الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل مع Cy5 المسمى الحمض النووي خلية محمل البروتين في الحل (نفس ترتيب المانحة المقبول كما هو الحال في الشكل 6A)،كانت الأحداث FRET ملحوظ بوضوح في 100 nM Cy5 الخلفية، كانت أقل وضوحا (انخفاض مقبول تتبع إشارة إلى الضوضاء) في 1 ميكرومتر، وليس من الواضح في 10 ميكرومتر. نلاحظ أن دراسة سابقة مع ZMWs التجارية ذكرت جزيء واحد FRET إشارات القبول بتركيزات الخلفية عالية مثل 1 MM54، أعلى مما حققناه نحن والدراسات السابقة الأخرى42،53 مع ZMWs ملفقة في المنزل. 10- ويعطى مزيد من المناقشة لأداء الإشارة إلى الخلفية بين الزماوين في Jamiolkowskiوآخرون. التفاعل غير المحدد لعينة الفلورسنت مع أسطح ZMW53 هو تحد شائع يحد من الوصول إلى تركيزات أعلى ، خاصة إذا كانت أنواع الفلورسنت المنتشرة في الحل هي جزيء كبير. الدراسات مع ZMWs على النظم الكيميائية الحيوية المعقدة مثل الترجمة وعادة ما تقتصر تركيزات الركيزة الفلورية الحرة إلى 100−250 nM55،56،57،58. وبغض النظر عن التطبيق المقصود لأجهزة ZMW، فمن المرجح أن يكون من الضروري تحسين أساليب التخميل لمختلف الأنظمة للحفاظ على إشارة مقبولة إلى الضوضاء بتركيزات عالية.

بشكل عام ، لا تتطلب الطريقة المعروضة هنا مهارات أو معدات متخصصة ، وتسمح بتصنيع مواز للعديد من القوالب في وقت واحد ، ويمكن تكييفها لتصنيع ZMWs في معادن مختلفة. في هذا العمل، تم استبدال النحاس والألومنيوم مع الألومنيوم والذهب، على التوالي، لتصنيع الذهب ZMWs (الشكل التكميلي 3). هذا مفيد للمختبرات التي تستخدم أساليب السلب من الذهب بدلا من الألومنيوم. وبالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت أن الذهب ZMWs لتعزيز الانبعاثات للفلوروفوريس التي تمتص في المنطقة الحمراء من الطيف المرئي، في حين أن الألومنيوم ZMWs تعزيز الانبعاثات للفلوروفوريس التي تمتص في المنطقةالخضراء 59. في المستقبل، قد يتم تعزيز كثافة إشارة الفلورسنت من ZMWs ملفقة مع هذه الطريقة عن طريق النقش في الزجاج تحت الكسوة المعدنية ZMW باستخدام HF16،26،60. وهذا يجلب الجزيئات الحيوية معطلة أبعد من الجدران المعدنية، والتي يمكن أن تروي الفلوروفوريس61. وعلاوة على ذلك، هناك حد أقصى في كثافة الإضاءة الإثارة تحت مدخل الفتحة، وقد تم استغلال هذا سابقا لتعزيز انبعاث جزيء واحد26،60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01GM080376، R35GM118139، ومركز NSF للهندسة الميكانيكية CMMI: 15-48571 إلى Y.E.G. ، وزمالة NIAID قبل الدكتوراه NRSA F30AI114187 إلى R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 159، دليل موجة وضع الصفر، فتحة النانو، مضان جزيء واحد، التصوير الحجري للنانوسفير، الكريستال الغرواني، التجميع الذاتي

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

تصنيع أدلة الموجة وضع الصفر لارتفاع تركيز المجهر جزيء واحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter