Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изготовление волноводов нулевого режима для одномолекулярной микроскопии высокой концентрации

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь описан метод наносферной литографии для параллельного изготовления волноводов нулевого режима, которые представляют собой массивы наноапертур в покрытой металлом стеклянной микроскопии для визуализации одной молекулы при нано- и микромолярных концентрациях флуорофоров. Метод использует преимущества самосборки коллоидных кристаллов для создания шаблона волноводов.

Abstract

В одномолекулярной флуоресцентной энзимологии фоновая флуоресценция от меченых субстратов в растворе часто ограничивает концентрацию флуорофора пико- на наномолярными диапазонами, что на несколько порядков меньше, чем многие физиологические концентрации лигандов. Оптические наноструктуры, называемые волноводами нулевого режима (ZMW), которые представляют собой отверстия диаметром 100−200 нм, изготовленные из тонкого проводящего металла, такого как алюминий или золото, позволяют визуалировать отдельные молекулы при микромолярных концентрациях флуорофоров, ограничивая возбуждение видимого света эффективными объемами зептолита. Однако потребность в дорогостоящем и специализированном оборудовании для нанопроизводства исключила широкое использование ZMW. Как правило, наноструктуры, такие как ZMW, получают путем прямой записи с использованием электронно-лучевой литографии, которая является последовательной и медленной. Здесь коллоидная, или наносферная, литография используется в качестве альтернативной стратегии создания нанометровых масок для изготовления волноводов. В настоящем докладе подробно описывается этот подход с практическими соображениями для каждого этапа. Метод позволяет параллельно изготавливать тысячи алюминиевых или золотых ЗМВт с конечными диаметрами волноводов и глубиной 100−200 нм. Требуется только обычное лабораторное оборудование и термический испаритель для осаждения металла. Делая ZMW более доступными для биохимического сообщества, этот метод может облегчить изучение молекулярных процессов в клеточных концентрациях и скоростях.

Introduction

Одномолекулярные методы, такие как одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) или одномолекулярная флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), являются мощными инструментами для молекулярной биофизики, позволяющими изучать динамические движения, конформации и взаимодействия отдельных биомолекул в таких процессах, как транскрипция1,2,3,трансляция4,5,6и многие другие7. Для smFRET микроскопия полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) является распространенным методом, поскольку многие привязанные молекулы могут наблюдаться с течением времени, а испаряющаяся волна, генерируемая TIR, ограничена областью 100-200 нм, прилегающей к покровному листу8. Однако даже при таком ограничении объема возбуждения интересующий флуорофоры все равно необходимо разбавлять до диапазонов pM или nM, чтобы обнаружить сигналы одной молекулы выше фоновой флуоресценции9. Поскольку константы Михаэлиса-Ментена клеточных ферментов обычно находятся в диапазоне от мкМ домМ 10,биохимические реакции в исследованиях одной молекулы обычно намного медленнее, чем в клетке. Например, синтез белка происходит со скоростью 15−20 аминокислот в секунду у E. coli11,12,в то время как большинство прокариотических рибосом в экспериментах smFRET переводят на 0,1−1 аминокислоту в секунду13. В синтезе белка кристаллические структуры и smFRET на застопорившихся рибосомах показали, что трансферные РНК (тРНК) колеблются между «гибридным» и «классическим» состояниями до этапа транслокации тРНК-мРНК14,15. Однако при наличии физиологических концентраций транслокационного фактора ГТФазы, EF-G, в smFRET6наблюдалась иная конформация, промежуточная между гибридным и классическим состояниями. Изучение динамических молекулярных процессов со скоростью и концентрациями, аналогичными тем, которые происходят в клетке, важно, но остается технической проблемой.

Стратегия увеличения концентрации флуоресцентной подложки заключается в использовании субзримых апертур на основе металлов, называемых волноводами нулевого режима (ZMW), для создания ограниченных полей возбуждения, которые селективно возбуждают биомолекулы, локализованные в отверстиях16 (рисунок 1). Отверстия обычно имеют диаметр 100−200 нм и глубину 17 мм100−150нм. Выше длины волны отсечки, связанной с размером и формой скважин (λc ≈ в 2,3 раза больше диаметра для круговых волноводов с водой в качестве диэлектрической среды18),в волноводе не допускаются режимы распространения, отсюда и термин волноводы нулевого режима. Однако колеблющееся электромагнитное поле, названное испаряющейся волной, экспоненциально распадающейся по интенсивности, все еще туннелирует на небольшом расстоянии в волновод18,19. Несмотря на сходство с испаряющимися волнами МДП, испаряющиеся волны ZMW имеют более короткую постоянную распада, что приводит к эффективной области возбуждения 10−30 нм в волноводе. При микромолярных концентрациях флуоресцентно меченых лигандов в области возбуждения одновременно присутствует только одна или несколько молекул. Это ограничение объема возбуждения и последующее уменьшение фоновой флуоресценции позволяет флуоресцентно визуализировать отдельные молекулы в биологически значимых концентрациях. Это было применено ко многим системам20,включая измерения FCS диффузии одного белка21,измерения одной молекулы FRET низкородных лиганд-белковых22 и белково-белковых взаимодействий23и спектроэлектрохимические измерения событий одиночного молекулярного оборота24.

ZMW были получены путем непосредственного рисунка металлического слоя с использованием ионно-лучевого фрезерования25,26 или электронно-лучевой литографии (EBL) с последующим плазменным травлением16,27. Эти методы бесмаскировочной литографии создают волноводы последовательно и, как правило, требуют доступа к специализированным установкам нанопроизводства, что препятствует широкому внедрению технологии ZMW. Другой метод, ультрафиолетовая наноимпринтная литография lift-off28,использует кварцевую скользящую форму для прессования обратного шаблона ZMW на резистивную пленку, такую как штамп. Хотя этот метод более упрощен, он по-прежнему требует EBL для изготовления кварцевой формы. В данной статье представлен протокол для простого и недорогого шаблонного метода изготовления, который не требует EBL или ионно-лучевого фрезерования и основан на тесной упаковке наносфер для формирования литографической маски.

Наносферная или «естественная» литография, которая была впервые предложена в 1982 году Декманом и Дансмуиром29,30,использует самосборку монодисперсных коллоидных частиц, начиная от десятков нанометров до десятков микрометров31,для создания шаблонов для моделирования поверхности путем травления и / или осаждения материалов. Двумерные (2D) или трехмерные (3D) расширенные периодические массивы коллоидных частиц, называемые коллоидными кристаллами, характеризуются яркой радужной радужностью от рассеяния и дифракции32. Хотя эта методология маскировки используется менее широко, чем электронно-лучевая или фотолитография, она проста, недорога и легко масштабируется для создания размеров объектов ниже 100 нм.

Направление самосборки коллоидных частиц определяет успех использования коллоидных кристаллов в качестве масок для поверхностного рисунка. Если размер и форма частиц однородны, коллоидные частицы могут быть легко собраны с помощью гексагональной упаковки, вызванной энтропийным истощением33. Испарение воды после капельного покрытия является эффективным путем к осаждению коллоидных частиц, хотя другие способы включают погружное покрытие34,спиновое покрытие35,электрофоретическое осаждение36и консолидацию на границераздела 37воздух-вода. Протокол, представленный ниже, основан на методе испарения седиментации, который был самым простым в реализации. Треугольные промежутки между плотно упакованными полистирольными шариками образуют отверстия, в которых можно облицовать жертвенный металл, формируя столбы(рисунок 2 и дополнительный рисунок 1). Краткий отжиг бусин перед этим этапом корректирует форму и диаметр этих стоек. Бусины удаляются, вокруг столбов наносится окончательный металлический слой, а затем столбы удаляются. После двух ступеней осаждения металла на коллоидную наномаску, удаления промежуточных столбов и модификации химического состава поверхности для пассивации и привязки массивы ZMW готовы к использованию для визуализации одной молекулы. Более обширную характеристику оптических свойств ZMW после изготовления можно найти в сопроводительной статье38. Кроме термического испарителя для осаждения металлов из пара, никаких специализированных инструментов не требуется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги могут быть выполнены в общем лабораторном пространстве.

1. Очистка стеклянных крышек

  1. Для обеспечения чистой поверхности для испарительного осаждения коллоидных частиц поместите 24 x 30 мм оптических боросиликатных стеклянных покровов (толщиной 0,16−0,19 мм) в рифленые вставки витражной банки для очистки коплинского стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крышки стоят вертикально и хорошо разделены, чтобы все поверхности были четко открыты во время процесса очистки.
  2. Налейте достаточно ацетона в банку для окрашивания, чтобы покрыть крышки, поместите крышку и обжарьте ультразвуком в течение 10 минут при 40 °C.
  3. Вылейте ацетон и промойте крышки, заполнив банку для окрашивания дистиллированнойH2O и вылив воду. Повторите еще 2 раза.
  4. Повторите ацетоновую ультразвуковую обивку (шаги 1.2 и 1.3) еще раз.
  5. Вылейте достаточно 200 мМ KOH в банку, чтобы покрыть крышки и ультразвуком, покрытым, в течение 20 мин при 40 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: KOH слегка вытряхывает стекло.
  6. Промойте крышки дистиллированной H2O 6 раз.
  7. Добавьте этанол, чтобы покрыть крышки, добавьте крышку и соник в течение 10 мин при 40 °C.
  8. Промойте крышки дистиллированнойH2O 3 раза.
  9. Подберите каждый обтеканий по краю с помощью мягких щипцов и высушите крышки газом N2. Касайтесь только краев крышки. Поместите каждый из высушенных, очищенных крытых липов в индивидуальную чистую чашку Петри.

2. Испарительное осаждение полистирольных шариков

  1. Для создания коллоидной кристаллической маски для массива ZMW центрифуга диаметром 50 мкл диаметром 1 мкм, нефункционализированные полистирольные шарики (2,5% мас./об.в воде) при 15 000 х г,25 °C в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед пипеткой бусин следует кратковременно вихрь булавочного раствора на случай, если бусины осядят на дно бутылки.
  2. Выбросьте супернатант, оставив как можно меньше воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточная вода может изменять свойства испарения этанола39,поэтому удаление небольшого количества шариков с целью удаления всей воды является приемлемым.
  3. Повторно суспендирует шарики со ступени 2.2 в 50 мкл растворителя 1:400 TritonX-100:этанол. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы тщательно смешать шарики с растворителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворитель ТритонХ-100:этанол следует запечатывать парафиновой пленкой после использования и готовить свежим один раз в месяц. Бусины, как правило, прилипают к сторонам пластикового сосуда, такого как трубка микроцентрифуги, поэтому пипетка по бокам гарантирует, что все бусины будут повторно суспендированы.
  4. Чтобы установить камеру влажности для осаждения, поместите 6 чашек Петри, каждая с одним чехлом, на скамейку в линию с крышками, оставленными слегка приоткрытыми. В каждой посуде переместите крышку в открытую область, чтобы крышки подвергались воздействию окружающей среды при повышении влажности на следующем этапе.
  5. Поместите гигрометр и небольшой электрический вентилятор в центре за чашками Петри.
  6. Запишите начальную относительную влажность (RH) в лаборатории. Наполните 200 мл воды 150−200 мл ~ 75 °C и поместите его за вентилятор.
  7. Включите вентилятор и накройте чашку Петри, вентилятор, замок и гигрометр перевернутым прозрачным пластиковым контейнером для хранения (66 см х 46 см х 38 см).
  8. Пусть RH в камере поднимется до 70−75%, что обычно занимает 5−10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если относительная влажность окружающей среды в лаборатории низкая (ниже ~50%), пусть камера достигает более высокой относительной влажности, но не выше 80%, чтобы компенсировать потерю влажности во время осаждения (см. Ниже).
  9. Когда RH достигнет 70−75%, запишите RH и слегка поднимите пластиковый контейнер для хранения, чтобы быстро разместить крышки на чашках Петри, что предотвращает чрезмерное смачивание крышек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура в камере будет немного теплее, чем комнатная температура, обычно 25−26 °C, в результате увлажнения. Если на обложек видна влага, то стеклянные поверхности слишком влажные. Коммерческий бардачок может упростить эту часть протокола.
  10. Пусть RH в камере продолжит расти до 85%. В этот момент запишите RH в камеру влажности и пипетку 5 мкл суспензии бусины на центр каждого крышки.
  11. Закрывайте камеру и чашки Петри после каждого осаждения, чтобы свести к минимуму потерю влажности. Постарайтесь закончить все 6 осаждений в течение 2 минут.
  12. Запишите RH в камере после осаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Rh после осаждения поможет оценить, насколько быстро влажность была потеряна во время осаждения, что зависит от условий окружающей среды. Для типичного успешного запуска камера будет начинаться с 85% RH до осаждения и заканчиваться при 70-75% RH после осаждения.
  13. Дайте шарикам растекатся и высохнет в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если коллоидные кристаллы имеют много отверстий или многослойных областей, то камера, вероятно, была слишком влажной или сухой соответственно. Отрегулируйте относительную влажность, при которой закрываются чашки Петри и начинается осаждение (см. раздел результатов для дальнейшего обсуждения оптимизации).

3. Отжиг бусин для уменьшения размера пор в коллоидном кристаллическом шаблоне

  1. Чтобы обеспечить равномерную температурную поверхность для отжига полистирольных шариков, которая сужает межшковые межшковые межударные межударные углы и закругляет углы интерстиков, поместите плоскую, фрезерованную алюминиевую пластину поверх стандартной керамической конфорки.
  2. Установите температуру конфорки на 107 °C, температуру стеклопротека полистирола40.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения стабильной и точной температуры термопарный зонд проводили в отверстии шириной 2−3 мм и глубиной 4−5 мм в алюминиевой пластине.
  3. Поместите крышку, содержащую шаблон бусины, на горячую алюминиевую пластину и отжиг в течение 20 с (см. раздел обсуждения для объяснения времени плавления).
  4. После нагрева снимите крышку с алюминиевой пластины и быстро поместите ее на алюминиевую поверхность другой комнатной температуры, чтобы охладить ее.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно либо слегка повесить крышки над краем пластины, либо перемешивать неглубокие каналы (см. прилагаемое видео) в пластину, чтобы облегчить подбор крышек.

4. Нанофабрикация алюминиевых волноводов нулевого режима с использованием коллоидного кристаллического шаблона

  1. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 300 нм меди со скоростью 2 Å/с на коллоидный кристаллический шаблон для создания столбов в промежутках между шариками.
  2. Удалите лишний металл сверху бусин, аккуратно прижав поверхность скотчем. Медленно снимите ленту, чтобы оттянуть металл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые небольшие пятна отражающего избытка металла могут остаться после натяжения ленты, и они часто могут быть удалены потоком газа N2. Если после вытягивания ленты остаются значительные пятна отражающего избытка металла, попробуйте замочить шаблоны в толуоле в течение 2 ч, чтобы частично растворить полистирольные шарики. Вымойте обтекаемы дистиллированной водой, высушитеn2и повторите потягивание ленты. Дополнительное замачивание не должно полностью растворять бусины, так как бусины помогают защитить стойки от повреждений во время натяжения ленты.
  3. Чтобы растворить полистирольные шарики, поместите шаблоны бусин в толуол и замочите на ночь.
    ВНИМАНИЕ: Пары толуола могут быть токсичными. Работайте с толуолом под хорошо проветриваемым капюшоном и носите средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защитные очки и лабораторное покрытие. Толуол следует хранить в вентилируемых шкафах, предназначенных для легковоспламеняющихся жидкостей.
  4. После инкубации толуола промыть шаблоны один раз хлороформом и дважды этанолом. В этот момент осторожно обрабатывайте крышки, потому что теперь открыты тонкие металлические стойки высотой 200−300 нм. Высушите шаблоныN2 и удалите остаточный полимер и загрязняющие вещества в кислородно-плазменном очистителем в течение 30 мин.
    ВНИМАНИЕ: Пары хлороформа могут быть токсичными. Работайте с хлороформом под хорошо проветриваемым капюшоном и носите средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Хлороформ следует хранить в вентилируемых шкафах вдали от других легковоспламеняющихся растворителей.
  5. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 3 нм слоя адгезии титана при 1 Å/с, а затем 100−150 нм алюминия при 4 Å/с вокруг и поверх медных столбов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать более толстую облицовку для получения более глубоких направляющих и лучшего затухания фоновой флуоресценции, но это также уменьшает выход после экспонирования и растворения столбов на следующем этапе (см. раздел обсуждения).
  6. Для растворения металлических столбов замочите крышки в медном травленте (на основе лимонной кислоты; Таблица материалов) в течение 2 ч.
    ВНИМАНИЕ: Металлический травильный материал может вызвать ожоги кожи. Работайте с травильонами под хорошо проветриваемым капотом и носите защитные средства. Тщательно вымойте руки после обработки. Металлический травиль следует хранить в вентилируемых шкафах, предназначенных для агрессивных жидкостей.
  7. Промойте крышки дистиллированной водой, высушитеn2и аккуратно облицовите поверхность металлической облицовки бумагой для линз, чтобы обнажить любые столбы, которые все еще покрыты облицовкой. Поместите крышки обратно в медный травил еще на 2 ч, затем снова промойте дистиллированной водой и высушитеN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды ZMW следует хранить в закрытых, чистых чашках Петри, чтобы они не загрязняли их.

5. Нанофабрикация волноводов нулевого режима золота с использованием коллоидного кристаллического шаблона

ПРИМЕЧАНИЕ: Способ изготовления золотых ZMW(дополнительный рисунок 1),который отражает протокол изготовления алюминиевых ZMW, приведен в этом разделе.

  1. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 3 нм слоя адгезии титана при 1 Å/с, а затем 300 нм алюминия при 4 Å/s.
  2. Удалите лишний металл сверху бусин, аккуратно прижав поверхность скотчем. Медленно снимите ленту, чтобы оттянуть металл.
  3. Чтобы растворить полистирольные шарики, поместите шаблоны бусин в толуол и замочите на ночь.
  4. После инкубации толуола промыть шаблоны один раз хлороформом и дважды этанолом. Высушите шаблоныN2 и удалите остаточные полимерные загрязнения в кислородно-плазменном очистителем в течение 30 мин.
  5. Используя тепловое или электронно-лучевое испарительное осаждение, нанесите 100−150 нм золота со скоростью 5 Å/s вокруг и поверх алюминиевых столбов.
  6. Для растворения металлических столбов замочите крышки в алюминиевом травленте (на основе фосфорной кислоты; Таблица материалов) в течение 1 ч.
  7. Промойте крышки дистиллированной водой, высушитеn2и аккуратно облицовите поверхность металлической облицовки бумагой для линз, чтобы обнажить любые столбы, которые все еще покрыты облицовкой. Поместите крышки обратно в алюминиевый травил на 1 ч, затем снова промойте дистиллированной водой и высушитеN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды ZMW следует хранить в закрытых, чистых чашках Петри.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Самосборка коллоидных частиц полистирола путем испарительного осаждения (этапы 2.1−2.13) может дать ряд результатов, поскольку требует контроля скорости испарения растворителя. Однако, поскольку осаждение является быстрым (10−15 мин на раунд), процедура может быть быстро оптимизирована для различных условий окружающей среды. На рисунке 3А показан хорошо сформированный коллоидный шаблон после осаждения и испарения. Макроскопически область бусин круглая, с границами, определенными непрозрачным, многослойным кольцом бусин. Полупрозрачные, но не белые области на изображении являются желаемыми однослойными областями. На рисунке 3B показан коллоидный шаблон, который был упакован в чрезмерно влажную среду (80% RH при закрытии чашки Петри). Эти шаблоны, как правило, не имеют чистой круговой границы и имеют многослойные усики, простирающиеся наружу. Осаждение приемлемо и может быть использовано на последующих фазах, но отверстия в решетке уменьшают количество пригодных для использования областей массива ZMW для визуализации одной молекулы. На рисунке 3C показан коллоидный шаблон, который был упакован в чрезмерно сухую среду (65% RH при закрытии чашек Петри). Эти шаблоны обычно меньше по диаметру по сравнению с идеальными, хорошо разбросанными шаблонами. Осаждение может быть использовано, но многослойные, белые области, которые пронизывая внутрь, уменьшают площадь, используемую для визуализации. Таким образом, мы не рекомендуем выполнять более 6 осаждений одновременно, поскольку осаждения к концу процесса будут происходить при более низкой влажности, когда камера открыта и закрыта. На рисунке 3D показан радужный рисунок, полученный дифракцией отраженного света от кристалла полистирола. Этот рисунок может быть использован для подтверждения успеха и качества хрустальной упаковки на глаз. На рисунке 3E,F показаны изображения атомно-силовой микроскопии (AFM) хорошо упакованных коллоидных шаблонов. Дефекты между зернами возникают из-за заклинивания во время испарительного осаждения41,и отдельные зерна можно увидеть с целью 10x. Таким образом, изучение коллоидных отложений с помощью маломощного светового микроскопа также может быть использовано для оценки упаковки.

После осаждения меди на отожженные коллоидные шаблоны (этап 4.1) радужная дифракционная картина должна по-прежнему быть видимой и усиленной отражающим металлическим покрытием верхушек бусин(рис. 4А, В). Шаблоны теряют отражающий рисунок радужной дифракции после вытягивания скотча (шаг 4.2), который удаляет избыток меди(рисунок 4C). На рисунке 4D,E показаны изображения AFM типичного поля медных столбов после осаждения металла. Дефекты между коллоидными кристаллическими зернами на рисунке 3E видны на изображениях меди в виде более крупных областей меди. Анализ изображений AFM показывает, что при толщине осаждения меди 300 нм конечные медные столбы в среднем 255 нм(рисунок 4F)в высоту и 121 нм в диаметре(рисунок 4G).

Осаждение алюминиевой облицовки (этап 4.5), где были бусины и поверх медных столбов, и последующее роспуск столбов (этапы 4.6 и 4.7) приводят к алюминиевым ZMW, показанным на рисунке 5A−C. Дефекты между коллоидными кристаллическими зернами видны в виде более крупных отверстий(рисунок 5B). Среднее расстояние между центрами ZMW на рисунке 5C составляет 559 нм, что согласуется с расстоянием, заданным геометрией шестиугольной близкой упаковки бусин 1 мкм Equation 1 (Использование полистирольных шаблонов, которые были отожжены в течение 20 с, приводит к волноводам, которые в среднем имеют диаметр 118 нм(рисунок 5D, E),соответствующие диаметрам столбов и достаточно малые, чтобы отсечь распространение видимого света. Профиль высоты волноводов на рисунке 5D также показывает, что его глубина составляет ~ 120 нм.

Одномолекулярный FRET был выполнен в ZMW для проверки функциональности(рисунок 6A). Типичное поле ZMW для визуализации показано на рисунке 6B,который содержит >3000 волноводов в поле зрения 40 x 80 мкм. ZMW были впервые пассивированы с использованием протоколов, описанныхранее 42,43. Вкратце, алюминиевые ZMW были пассивированы поли(винилфосфоновой кислотой) для покрытия алюминиевой облицовки, за которой следовал метокси-заканчивающийся полиэтиленгликоль (ПЭГ), легированный биотиновым ПЭГ для покрытия стеклянных низов ZMW. Золотые ZMW могут быть пассивированы тиол-дериватизированным ПЭГ для покрытия золотой облицовки с последующей аналогичной обработкой ПЭГ для стеклянных дна. Затем были построены проточные камеры объемом ~20 мкл для визуализации одной молекулы44. Одномолекулярную визуализацию FRET дуплексов ДНК выполняли, как описаноранее 38. Вкратце, 100 пМ−1 нМ цианина-3/цианина-5 (Cy3/Cy5), биотинилированные дуплексы ДНК (длина пары оснований 33) инкубировали в течение 10 мин в проточные каналы, функционализированные стрептавидином (5 мин инкубации, раствор 0,5 мг/мл). Концентрация меченых макромолекул может быть титрована для достижения ~20% нагрузки волноводов одной молекулой, что приводит к <5% волноводов, загруженных более чем одной молекулой, исходя из распределенной нагрузки Пуассона (большинство волноводов, ~75%, не будут иметь молекул)45. Несвязанная ДНК смывали дуплексным буфером без нуклеазы, за которым следовал буфер освещения (0,3% [мас./об.] глюкозы, 300 мкг/мл глюкозооксидазы, 120 мкг/мл каталазы и 1,5 мМ Тролокса [6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметил-хроман-2-карбоновой кислоты]). Небиотинилированные Cy5-меченые ДУПЛЕКСЫ ДНК (длина пары оснований 33) присутствовали в буфере освещения при 0, 50, 100 и 500 нМ в качестве фоновых флуорофоров в растворе. Одномолекулярные следы FRET от иммобилизованных дуплексных молекул ДНК Cy3/Cy5 были записаны с помощью специально построенного микроскопа TIRF, адаптированного к условиям эпифлуоресценции. Фильмы были записаны с числовой диафрагмой (NA) 100x масляным погружным объективом с переменным возбуждением 532 нм и 640 нм (экспозиция 100 мс) и спектральным сплиттером двойного обзора для одновременной записи излучения Cy3 и Cy5 на камеру электронно-умножающего зарядовую связь (EMCCD). Одномолекулярные следы FRET с одноступенчатыми отбеливателями в канале Cy5 были обнаружены при всех концентрациях тестируемого Cy5 в окружающейсреде (рисунок 6C−F). Для сравнения, одиночные молекулы можно было бы обнаружить только при освещении TIRF с концентрациями флуорофора от pM до низкого nM раствора46.

Figure 1
Рисунок 1: Схема волноводов нулевого режима. Диаграмма массива ZMW с расширенной диаграммой поперечного сечения одного ZMW справа. Отдельные флуоресцентно помеченные ферменты, представляющие интерес (коричневая рибосома с красным кругом для представления флуоресцентного красителя), химически иммобилизованные (через мРНК в этом примере) на стеклянное дно ZMW (обычно функционализированные с помощью биотинилированного ПЭГ), могут быть изображены с помощью типичной установки эпифлуоресцентной микроскопии на основе лазера. Свет возбуждения 532 нм (зеленые стрелки) отражается на границе стекла и металла из-за небольшого размера отверстия (диаметр 100−200 нм), но в ZMW присутствует нераспространяющаяся испаряющаяся волна, которая экспоненциально распадается по интенсивности. Это приводит к эффективной глубине освещения 10−30 нм (зеленое затенение в диафрагме). Добавляют отдельные флуоресцентные лиганды (синие тРНК с зелеными кругами в качестве флуоресцентных меток) в концентрациях от nM до μM. Отдельный лиганд, который диффундирует в диафрагму и взаимодействует с ферментом, визуанизуется без запретительной фоновой флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема метода коллоидного шаблонирования, разработанного для изготовления алюминиевых массивов ZMW. Полистирольные шарики диаметром 1 мкм осаждаются и самосборуются на очищенном стеклянном покровном листе, как описано в разделе 2 протокола. Затем шарики отжигаются для уменьшения размеров пор (раздел 3), после чего следует осаждение меди и растворение шариков в толуоле. Алюминий наносится вокруг и поверх медных столбов, которые затем выборочно травятся, чтобы оставить после себя шестиугольный массив наноапертур (секция 4). Для последних трех шагов справа от видов плана предоставляются виды поперечного сечения, чтобы показать ширину и высоту медных столбов и алюминиевых ZMW. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные результаты испарительного осаждения коллоидов. А) Пример оптимального коллоидного осаждения. (B) Пример приемлемого коллоидного осаждения, при котором условия были более влажными (80% RH), чем идеальными. Отверстия в кристаллическом монослое очевидны. С) Пример приемлемого коллоидного осаждения, при котором условия были более сухими (65% резус-влажности), чем оптимальные. Однослойные области слегка полупрозрачные, в то время как многослойные области белые и непрозрачные (периметр и полосы внутрь). (D) Коллоидный кристалл, освещенный белым светом, чтобы выделить радужную дифракцию из кристаллов. (E) AfM-изображение (постукивание зонда AFM в воздухе) монослоя шестиугольно упакованных полистирольных шариков от успешного коллоидного осаждения (шкала бар = 10 мкм). (F) Расширенное AFM-изображение упакованных бусин (шкала = 2 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Макроскопические и микроскопические изображения шаблонов ZMW после осаждения меди. (A) Изображение слайдов после физического испарения меди поверх бусин. (B) Радужная дифракционная картина из бисероплетения после осаждения меди. (C) Изображение шаблона (справа) после потягивания ленты для удаления излишков меди и ленты (слева). (D) AfM изображение медных столбов после натяжения ленты и полного растворения полистирольных шариков (шкала стержней = 5 мкм). (E) Изображение ОВМ с более высоким увеличением панели D (шкала = 2 мкм). (F) Гистограмма высоты медного столба (определяемая как максимальное измерение высоты в пределах каждого столба), n = 534. (G) Гистограмма медных пост-феретских диаметров, n = 201. Диаметр Ферета — максимальное расстояние между двумя параллельными линиями, касательными к границе столба (количественно определено в ImageJ47). Для идентификации частиц для анализа использовался порог на полпути между верхней частью облицовки и нижней поверхностью стекла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Макроскопические и микроскопические изображения алюминиевых ЗМВ. А) Изображение слайдов после физического испарительного осаждения 150 нм алюминия вокруг и поверх медных столбов. (B) AfM изображение алюминиевых ZMW после роспуска (шкала стержней = 5 мкм). (C) Изображение с более высоким увеличением панели B (шкала = 0,2 мкм). (D) Типичный профиль глубины отдельного ZMW из панели C. Профиль, взятый из зеленой линии, нарисованной на панели C. (E) Гистограмма диаметров ZMW Feret, n = 240. Диаметры Ферета были измерены, как показано на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Одномолекулярная визуализация FRET в ZMW. (A) Схема (не масштабируемая) одномолекулярной визуализации FRET дуплексов ДНК Cy3, Cy5-меченых в ZMW с мечеными Cy5 дуплексами на заднем плане. (B) Пример поля ZMW при освещении белым светом (шкала = 10 мкм). (С−Ф) Одномолекулярные записи FRET дуплексов ДНК, иммобилизованных в ZMW в присутствии дуплексов, меченных 0 (C),50 (D),100 (E)и 500 нМ (F) Cy5 в растворе. Для каждой концентрации верхняя панель показывает интенсивность флуоресценции Cy3 (зеленый) и Cy5 (красный) при лазерном освещении 532 нм (визуализация FRET), средняя панель показывает интенсивность флуоресценции Cy5 при лазерном освещении 640 нм (возбуждение прямого акцептора), а самая низкая панель показывает эффективность FRET ( Equation 2 ), рассчитанную из необработанных интенсивностей флуоресценции Cy3(ID)и Cy5(IA). Во время визуализации длина волны возбуждения чередовалась между 532 и 640 нм каждые 100 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Схема метода коллоидного шаблонирования, разработанного для изготовления золотого массива ZMW. Протокол изготовления золотого массива ZMW аналогивен протоколу изготовления алюминиевого массива ZMW(рисунок 2). Вместо того, чтобы наносить медь поверх полистирольных шариков, осажается алюминий. После растворения бусин в толуоле вместо алюминия поверх столбов откладывается золото. Алюминиевые стойки затем выборочно травятся, чтобы оставить после себя золотую решетку ZMW. Для последних трех шагов справа от видов плана предоставляются виды поперечного сечения, чтобы показать ширину и высоту алюминиевых столбов и золотых ZMW. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Конечно-элементное моделирование распространения электромагнитного поля в ZMW. (А−Д) Поперечные сечения величины усредненного по времени вектора Пойнтинга(Вт/м2)через волновод, изготовленный из необнаженного шаблона (A,C) и отожженного шаблона (B,D). Линейно поляризованные электромагнитные плоские волны (1 Вт, распределенные по площади слайда) на длинах волн, перечисленных на рисунке (400 нм или 1000 нм), проецировались на нижнюю поверхность, а самый низкий (фундаментальный) режим, который имеет наименьшее число волн, был рассчитан с помощью программного обеспечения моделирования(Таблица материалов)с методом конечных элементов для решения уравнений Максвелла и соответствующих граничных условий. Границы волноводов считались совершенными электрическими проводниками, что хорошо аппроксимировано алюминиевыми или золотыми стенками. Поперечное сечение от необнаженного шаблона волноводов определяли гексагональной упаковкой окружности диаметром 1 мкм, а трехконечные наконечники от полученной треугольной формы были обрезаны до ширины ~ 60 нм для моделирования реалистичной физической диафрагмы. Поперечное сечение от отожженных шаблонов аппроксимировалось как круг диаметром 130 нм. Оба волновода имели глубину 130 нм, аналогичную глубине облицовки после изготовления. (Э,Ф) В дополнение к длинам волн возбуждения 400 нм и 1000 нм, модели были решены на 100 длинах волн возбуждения, равномерно расположенных между 400 нм и 1000 нм, и индекс эффективного режима (определяемый как Equation 3 , где k z - волновое число в волноводе, которое уменьшается из-за ограничения в поперечной плоскости, а k - световое волновое число возбуждения в вакууме) был построен против длины волны возбуждения для треугольных (E) и циркулярных (F) волноводов. Для более коротких длин волн возбуждаются более высокие моды, и индекс эффективного режима увеличивается (максимальный индекс эффективного режима составляет 1, что является предельным случаем, когда электромагнитная плоская волна распространяется неограниченно в поперечной размерности). Эффективные длины волн отсечки волноводов оценивались как длина волны, при которой индекс эффективного режима падает до 0. Обратите внимание, что круговая направляющая λотсечка = 221 нм от конечно-элементного моделирования (F) согласуется с теоретическим предсказанием длины отсечки кругового волновода (λcutoff,analytical = 1,7d = 221 нм, где d — диаметр волновода). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Репрезентативные результаты производства Au ZMW. (A) Макроскопическая картина золотых массивов ZMW. (Б−Д) AFM изображения алюминиевых столбов из шаблона бусины, который не был отожжен (B),шаблона, который был отожжен при 107 ° C в течение 20 с (C),и шаблона, который был отожжен при 107 ° C в течение 25 s (D). (E) AfM изображение золотых ZMW после роспуска алюминиевых столбов. (F) Более высокое увеличение AFM изображения панели E.(G) Типичный профиль глубины золота ZMW. Профиль взят из зеленой линии, нарисованной на панели F (шкала = 1 мкм в B, C, Dи F;5 мкм в E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для коллоидной самосборки (раздел протокола 2) использование этанола, а не воды в качестве суспензионного растворителя ускоряет процесс испарения таким образом, что шаблоны готовы через 2−3 мин после осаждения, а не через 1−2 ч, как в предыдущих способах48,49. Представленный здесь протокол испарительного осаждения также проще, чем предыдущие протоколы осаждения, которые требуют контроля наклона поверхности, температуры и объема воздуха выше суспензии49,50,51. Объемная фракция частиц, используемая в этом протоколе, составляет 2,4%, что выше, чем 0,2−0,5%, использованные в предыдущих методахосаждения 48,которые повторно суспендвали коллоиды в водно-глицериновых смесях в течение гораздо более длительных временных масштабов оседания. Однако качество осаждений устойчиво к изменениям в объемной доле частиц, причем прошлые исследования показали, что она может варьироваться в диапазоне от 2 до 10%49,50,51. Размеры зерен коллоидных кристаллов, полученных при успешном осаждении по этому протоколу, составляют 20−30 мкм в поперечнике, больше, чем зерна из предыдущих методов осаждения (обычно несколько сотен нанометров в поперечнике)48,49. Макроскопически, примерно 2 см в диаметре области коллоидного монослоя также сопоставимы с областями 1 см, полученными предыдущими методами49. Большой размер коллоидных кристаллических шаблонов, полученных этим способом, также позволяет производить 3−5 разделенных проточных камершириной 44,каждая шириной около 3−4 мм, на каждом слайде ZMW. Таким образом, на каждом слайде может быть выполнено несколько независимых экспериментов с одной молекулой.

Отжиг шаблонов коллоидных шариков (раздел протокола 3) после самостоятельной сборки является простым, но важным шагом для достаточного снижения фоновой флуоресценции с помощью ZMW. Как показано на дополнительном рисунке 2, эффективная длина волноводов с треугольным сечением от необеденеленного шаблона составляет 894 нм. Для сравнения, эффективная длина волны отсечки для круглого волновода диаметром 130 нм из отожженного шаблона составляет 221 нм, что определяется как аналитически (в 1,7 раза больше диаметра направляющего18),так и численно. Использование меньших шариков для осаждения также может уменьшить размер шаблонных пор, но волноводы тогда будут расположены ближе, чем 200 нм, что находится вокруг дифракционного предела видимого света. Кроме того, волноводы останутся треугольными в поперечном сечении, что приведет к несимметричному распространению мощности через волновод(дополнительный рисунок 2A−D). Одним из недостатков этапа отжига является то, что изменчивость времени плавления может привести к колебаниям диаметра волноводов, поэтому точное время помогает свести к минимуму различия между партиями. Промежутки начинают закрываться при отжиге более 25 с, а диаметры столбов не сильно уменьшаются между 20−25 с(дополнительный рисунок 3B−D). Быстрый тест на промежуточное закрытие заключается в том, чтобы проверить, по-прежнему ли отожженные шаблоны создают радужную дифракционную картину при освещении светом и просмотре под углом. Если нет, то большинство интерстиц, вероятно, закрылись. Взаимосвязь между временем отжига и типичными диаметрами пор была представленаранее 38.

После достижения желаемого размера пор на этапе отжига медь наносится (шаг 4.1) на шаблоны для создания тени маски. Важно использовать наложение с прямой видимости, при этом металл приближается к шаблону как можно перпендикулярно. Таким образом, увеличение расстояния между образцом и источником металла, а также обеспечение того, чтобы пластина, удерживающая шаблоны, не вращалась, как это автоматически делается в некоторых машинах для осаждения из пара, поможет свести к минимуму боковое осаждение металла на полистирольную подложку. Однако некоторое боковое осаждение неизбежно, что уменьшает размер промежуточного отверстия и, следовательно, поперечное сечение столба по мере осаждения большего количества металла52. Это приводит к пирамидальным металлическим столбам, а не призмоподобным структурам52.

Поскольку медные столбы, вероятно, имеют пирамидальную, а не призменную форму, осаждение алюминия (шаг 4.5) поверх столбов также покрывает некоторые наклонные стороны, блокируя доступ медного травильного этверанта для некоторых столбов. Таким образом, этап раздувания бумаги для линз (этап 4.7 или 5.7) был добавлен после первого замачивания в травлении, чтобы механически разрушить любые медные столбы, все еще покрытые алюминием. Осаждение большего количества меди для создания более высоких столбов также делает столбы более восприимчивыми к механическим разрушениям во время обжига бумаги линз. Однако более 500 нм меди не следует депонировать, поскольку цель осаждения состоит в том, чтобы проецировать промежуточное отверстие на средней линии 500 нм шариков размером 1 мкм.

Другой потенциальной проблемой является непреднамеренное удаление алюминиевой облицовки во время облицовки линз (этап 4.7 или 5.7). Было обнаружено, что потеря алюминиевой облицовки во время буффинга стала более частой после добавления этапа отжига, вероятно, из-за увеличения остатка полистирола, который может мешать прилипанию алюминия к стеклу (раздел протокола 3). Однако ночное замачивание толуола (шаг 4.3 или 5.3) после вытягивания ленты решило эту проблему. На изображении AFM на рисунке 4Eможно увидеть некоторые остаточные кольца из полистирола между столбами, но алюминиевая облицовка все еще сопротивлялась множественным баффам на этапе 4.7. Если потеря алюминиевой облицовки остается проблемой после ночного замачивания толуола, к этапу 4.4 или 5.4 можно добавить промывку RCA-1 (стандартную чистую-1), промывку пираньей или дальнейшую очистку кислородной плазмой. Эти этапы промывки также могут быть добавлены после заключительной ступени травления (шаг 4.7 или 5.7) и перед пассивацией для дальнейшей очистки ZMW.

Производительность ZMW в экспериментах с одной молекулой FRET была аналогична производительности ZMW, изготовленных с помощью EBL. В предыдущем исследовании53, выполняя одномолекулярный FRET на Cy3, меченой одноцепочечной ДНК с меченым Cy5 белком-загрузчиком ДНК-геликазы в растворе (такое же донор-акцепторное расположение, как на рисунке 6A),события FRET были четко различимы на фоне Cy5 100 нМ, были менее четкими (более низкий акцепторный следовый сигнал к шуму) при 1 мкМ и не различимыми при 10 мкМ. Мы отмечаем, что в предыдущем исследовании с коммерческими ZMW сообщалось о сигналах акцептора ФРЕТа с одной молекулой в фоновых концентрациях до 1мМ 54,что выше, чем у нас и других предыдущих исследованиях42,53 с ЗИМВ, изготовленных на месте. Дальнейшее обсуждение характеристик сигнал-фон среди ZMW приведено в Jamiolkowski et al.38. Неспецифическое взаимодействие флуоресцентного образца с поверхностямиZMW 53 является общей проблемой, ограничивающей доступ к более высоким концентрациям, особенно если диффузные флуоресцентные виды в растворе являются большой макромолекулой. Исследования с ZMW на сложных биохимических системах, таких как трансляция, обычно ограничивают концентрации свободной флуоресцентной субстраты до 100−250 нМ55,56,57,58. Независимо от предполагаемого применения ZMW, оптимизация методов пассивации для различных систем, вероятно, будет необходима для поддержания приемлемого сигнала к шуму при высоких концентрациях.

В целом, метод, представленный здесь, не требует специальных навыков или оборудования, позволяет параллельно изготавливать сразу много шаблонов и может быть адаптирован для изготовления ZMW из разных металлов. В этой работе медь и алюминий были заменены алюминием и золотом, соответственно, для изготовления золотых ZMW(Дополнительный рисунок 3). Это выгодно для лабораторий, которые используют методы пассивации золота, а не алюминия. Кроме того, было показано, что золотые ZMW усиливают эмиссию флуорофоров, которые поглощают в красной области видимого спектра, в то время как алюминиевые ZMW усиливают эмиссию флуорофоров, которые поглощают в зеленойобласти 59. В будущем интенсивность флуоресцентного сигнала от ZMW, изготовленных с помощью этого метода, может быть увеличена путем травления в стекло под металлической оболочкой ZMW с использованием HF16,26,60. Это уводит обездвиженные биомолекулы дальше от металлических стенок, которые могут гасять флуорофоры61. Кроме того, существует максимальная интенсивность освещения возбуждения ниже входа в отверстие, и это было использовано ранее для усиления излучения одной молекулы26,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIH R01GM080376, R35GM118139 и NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 to Y.E.G., а также преддокторской стипендией NIAID NRSA F30AI114187 для R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

Биоинженергия Выпуск 159 волноводы нулевого режима наноапертура флуоресценция одной молекулы наносферная литография коллоидный кристалл самосборка

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Изготовление волноводов нулевого режима для одномолекулярной микроскопии высокой концентрации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter